龔治安，崔靜軒，張偉偉，2，邵淑麗，2，李鐵，2

（齊齊哈爾大學(xué) 1.生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，2.抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)黑龍江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

近幾年，基因組編輯工具的開發(fā)加速了敲除（KO）動(dòng)物和敲除細(xì)胞系創(chuàng)建的進(jìn)展.包括鋅指核酸酶（zinc finger nuclease，ZFN）、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶（transcription activator-like effector nuclease，TALEN）和成簇規(guī)則間隔的短回文重復(fù)序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palinmic Repeats，CRISPR）/Cas9系統(tǒng)[1].CRISPR 及其相關(guān)蛋白（Cas）是一種RNA 引導(dǎo)的核酸酶，由微生物適應(yīng)性免疫系統(tǒng)通過(guò)再利用進(jìn)行基因組編輯發(fā)展而來(lái)[2].CRISPR-Cas 技術(shù)可以促進(jìn)真核細(xì)胞內(nèi)的高效基因組工程[3]，并且Cas9 蛋白的精確靶向是通過(guò)在其單向?qū)NA 內(nèi)指定20 個(gè)核苷酸（nt）的靶向序列來(lái)實(shí)現(xiàn)的[4].將CRISPR-Cas9 基因組編輯工具應(yīng)用于基因以及育種等方面，已成為科學(xué)家關(guān)注的焦點(diǎn).

1977 年，Yaffe[5]等首次建立了C2C12 肌原細(xì)胞系，其可在2%馬血清培養(yǎng)條件下被誘導(dǎo)分化，最終形成成熟的多核肌管，并表達(dá)肌球蛋白（myosin）和肌生成素（myogein，MyoG）等成熟骨骼肌的各種標(biāo)志蛋白[6].C2C12 細(xì)胞系分化速度比較快，可以形成能緊縮的微管，進(jìn)而產(chǎn)生特異性的肌肉蛋白.C2C12 成肌細(xì)胞系的建立則為研究骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育提供了一個(gè)很好的體外模型，通過(guò)研究不同處理對(duì)細(xì)胞增殖和分化的影響，可初步揭示其在肌肉生長(zhǎng)發(fā)育中的作用，為其它相關(guān)研究提供可靠的依據(jù).因此，C2C12 細(xì)胞可作為研究基因調(diào)節(jié)肌肉發(fā)育的生物學(xué)功能和分子機(jī)制的良好工具.CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)可對(duì)C2C12細(xì)胞中的基因進(jìn)行敲除或敲入，是研究該細(xì)胞成肌分化中分子機(jī)制的主要技術(shù)手段.本文以C2C12 細(xì)胞為研究對(duì)象，對(duì)CRISPR 技術(shù)的相關(guān)應(yīng)用、研究方法、結(jié)果以及對(duì)相關(guān)研究的影響等進(jìn)行綜述，以期為進(jìn)一步開展該領(lǐng)域的科學(xué)研究提供理論指導(dǎo).

1 CRISPR/Cas9 編輯系統(tǒng)作用機(jī)制

CRISPR 于1987 年首次在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)[7]，后來(lái)在許多其它細(xì)菌中被發(fā)現(xiàn)[8]406.幾年來(lái)，短重復(fù)序列的作用仍不清楚，直到2005 年，幾個(gè)研究小組描述了這些序列與噬菌體DNA 的相似性，提出了這些序列是細(xì)菌適應(yīng)性免疫系統(tǒng)一部分的假設(shè)[9-11].這些研究后來(lái)擴(kuò)展到實(shí)驗(yàn)證明CRISPR 及其相關(guān)蛋白（Cas）與靶向外源病毒DNA 的適應(yīng)性免疫相關(guān)聯(lián)[12].機(jī)制上，2 種不同的RNA——CRISPR 靶向（crRNA）和反式激活RNA（tracrRNA）能夠激活并引導(dǎo)Cas 蛋白結(jié)合病毒DNA 序列，隨后被剪切[13-14].這些CRISPR 系統(tǒng)的一個(gè)亞組（即Ⅱ型系統(tǒng)）依賴于單個(gè)Cas 蛋白靶向確定的DNA 序列，因此作為基因組編輯的工具特別有吸引力.將crRNAs 與tracrRNAs 結(jié)合成單個(gè)向?qū)NA（sgRNA）進(jìn)一步簡(jiǎn)化了該系統(tǒng)[15]816.2013 年首次利用化膿性鏈球菌（Streptococcus pyogenes，SpCas9）的Ⅱ型Cas 蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行RNA 引導(dǎo)的DNA切割，為利用CRISPR/Cas9 作為廣泛適用的基因組編輯工具奠定了基礎(chǔ)[16-17].在切割靶DNA 之前，Cas9 核酸酶在sgRNA 結(jié)合時(shí)發(fā)生構(gòu)象變化，并指向其靶位點(diǎn).結(jié)合特異性由3 個(gè)核苷酸前間隔區(qū)相鄰基序（PAM，由NGG 或NAG 序列組成）前的20 個(gè)核苷酸序列決定[15，18-19].DNA 解旋后，與PAM 結(jié)合并形成DNA-sgRNA雜交體，2 個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域在靶序列中引入雙鏈斷裂（DSB）[14，19]（見圖1a）.核酸酶活性的強(qiáng)度很大程度上是由Cas9 的結(jié)合效率決定的.對(duì)sgRNA 支架進(jìn)行系統(tǒng)修飾，鑒定出一種優(yōu)化的支架結(jié)構(gòu)，與Cas9 靶DNA 的更高結(jié)合效率相關(guān)[20].除了Cas9，其它使用替代PAM 位點(diǎn)（Cpf1）[21]或靶RNA（Cas13a/b）[22-23]的CRISPR II 型核酸酶已經(jīng)被開發(fā)成基因組工程工具.

2 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的功能性應(yīng)用研究

CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在改變基因表達(dá)情況方面，利用核酸酶缺陷型SpCas9 修飾（dCas9）與其它效應(yīng)結(jié)構(gòu)域融合建立了多元化的體系[24]（見圖1b）.CRISPR 干擾（CRISPRi）和激活（CRISPRa）利用融合的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，當(dāng)dCas9 被定向到靶基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)時(shí)，抑制或誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄[8]406.在抑制基因轉(zhuǎn)錄方面，大多數(shù)情況下，CRISPR 干擾系統(tǒng)依賴于帶有KRAB 阻遏結(jié)構(gòu)域的dCas9 融合來(lái)下調(diào)基因轉(zhuǎn)錄[25]445.值得關(guān)注的是，dCas9-KRAB 還可以通過(guò)改變靶位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)來(lái)修飾增強(qiáng)子區(qū)域，從而抑制基因轉(zhuǎn)錄[26].激活基因表達(dá)的研究中，首先發(fā)現(xiàn)了與dCas9 融合的單個(gè)VP64 激活劑結(jié)構(gòu)域，從而激活轉(zhuǎn)錄[25，27].后續(xù)通過(guò)對(duì)該系統(tǒng)進(jìn)行改進(jìn)，將VP64 改變?yōu)橐粋€(gè)三方激活劑VP64-p65-Rta（VPR）[28]或通過(guò)招募多個(gè)轉(zhuǎn)錄激活劑到dCas9，進(jìn)而更加有效地激活基因的表達(dá).除此之外，通過(guò)在dCas9 上添加長(zhǎng)表位尾（稱為SunTag）[29]或通過(guò)修飾sgRNA 支架包括適配子來(lái)生成激活劑結(jié)構(gòu)域的額外結(jié)合位點(diǎn)（稱為SAM）[30]，同樣也可以實(shí)現(xiàn)激活基因轉(zhuǎn)錄的效果.表觀遺傳學(xué)研究方面，同樣也開發(fā)了dCas9 融合蛋白進(jìn)行區(qū)域特異性表觀遺傳修飾.dCas9-DNMT3A或dCas9-DNMT3A-DNMT3L融合蛋白是目前有效的CRISPRa 系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以選擇性地增加靶向基因組區(qū)域CpG 基序的DNA 甲基化，從而抑制基因轉(zhuǎn)錄[31-33].

圖1 CRISPR/Cas9 功能

3 CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)在C2C12 細(xì)胞中的應(yīng)用

3.1 C2C12 細(xì)胞中基因定點(diǎn)敲除或敲入

CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在C2C12 細(xì)胞首次被應(yīng)用于構(gòu)建朊病毒蛋白（PrP）敲除克隆體系[34].MOYER[35]等采用CRISPR/Cas9 體系降低C2C12 成肌細(xì)胞中Mss51的表達(dá)，該基因是肌肉生長(zhǎng)抑制素和TGF-β1信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵靶標(biāo)，Mss51不調(diào)節(jié)肌母細(xì)胞增殖或分化，但是可作為肌肉生長(zhǎng)抑制素和TGF-β1等生長(zhǎng)因子對(duì)代謝過(guò)程的影響因素，包括脂肪酸氧化、糖酵解、氧化磷酸化.HUANG[36]等使用CRISPR-Cas9 生成了Ccndbp1-null 小鼠，Ccndbp1表達(dá)在C2C12 肌發(fā)生過(guò)程中上調(diào).Ccndbp1過(guò)表達(dá)促進(jìn)了肌發(fā)生，而Ccndbp1的敲低抑制了肌源性分化.2017 年，張凱麗[37]利用CRISPR/Cas9 技術(shù)首次實(shí)現(xiàn)了對(duì)小鼠成肌細(xì)胞Hnrnpk基因的敲除，并建立了利用CRISPR/Cas9 技術(shù)進(jìn)行基因定點(diǎn)修飾的技術(shù)平臺(tái)，為后續(xù)的基因定點(diǎn)修飾研究提供了一定的依據(jù).YI[38]等利用CRISPR/Cas9 技術(shù)將C2C12 細(xì)胞中Setd2基因沉默，結(jié)果顯示，肌管形成標(biāo)志物Myogenin（MyoG）、肌球蛋白重鏈（MHC）在分化過(guò)程中下調(diào)，同時(shí)細(xì)胞增殖速率降低，細(xì)胞增殖缺陷、表型受損.崔亞鳳[39-40]等利用CRISPR/dCas9 技術(shù)分別激活和抑制Egrl基因的表達(dá)，結(jié)果顯示，Egr1能夠促進(jìn)小鼠成肌細(xì)胞C2C12 的分化.鮑美玉[41]在探究Runx1基因?qū)2C12 細(xì)胞增殖和分化的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)Runx1基因后，C2C12 細(xì)胞分化被促進(jìn)，增殖也被促進(jìn)，而利用CRISPR/Cas9 敲除Runx1基因后，C2C12 細(xì)胞分化和增殖情況則與過(guò)表達(dá)相反.LI[42]等通過(guò)構(gòu)建一個(gè)過(guò)表達(dá)PFN2a的C2C12 小鼠成肌細(xì)胞系發(fā)現(xiàn)，PFN2a抑制增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而下調(diào)C2C12 肌源性發(fā)育.泛素特異性蛋白酶2（USP2）被認(rèn)為參與成肌細(xì)胞向肌管的分化進(jìn)程，CRISPR/Cas9 生成的Usp2（KO）C2C12 細(xì)胞表現(xiàn)出增殖抑制、三磷酸腺苷（ATP）含量的積累和耗氧量減少[43].此外，Usp2（KO）細(xì)胞以及USP2選擇性抑制劑處理的C2C12細(xì)胞均提高了線粒體中活性氧（ROS），這提示該基因可調(diào)節(jié)線粒體的膜電位和形態(tài)，保證成肌細(xì)胞ATP的供應(yīng)，進(jìn)而參與增殖和分化過(guò)程.HUANG[44]等通過(guò)CRISPR/Cas9 系統(tǒng)構(gòu)建了Mdfi過(guò)表達(dá)（Mdfi-OE）C2C12細(xì)胞系.實(shí)驗(yàn)表明，Mdfi通過(guò)上調(diào)Myod，Myog，Myosin的表達(dá)來(lái)促進(jìn)C2C12 細(xì)胞分化，并積極調(diào)節(jié)快速到慢速抽搐的肌肉纖維轉(zhuǎn)化[45].通過(guò)CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的依賴性硫酸肝素（HS）缺失極大地?fù)p害了C2C12細(xì)胞的成肌細(xì)胞分化[46].在探究DPY19L3在C2C12 小鼠成肌細(xì)胞的肌源分化中的作用時(shí)，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)進(jìn)行了DPY19L3基因消耗.結(jié)果表明，DPY19L3的缺失使細(xì)胞不能被誘導(dǎo)分化[47].

3.2 C2C12 細(xì)胞中基因表達(dá)調(diào)控

CRISPR/Cas9 技術(shù)也廣泛應(yīng)用于C2C12 細(xì)胞成肌分化過(guò)程.李浩可[48-49]等利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)構(gòu)建了LRTM1基因穩(wěn)定敲除的C2C12 細(xì)胞株，MAPK/ERK通路異常激活促進(jìn)了細(xì)胞的增殖，抑制了細(xì)胞的成肌分化.WANG[50]等使用CRISPR/Cas9 技術(shù)激活或抑制SPARCL1基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該基因激活BMP/TGF-β通路，促進(jìn)C2C12 細(xì)胞的分化[51].丁聰[52]、王璐璐[53]、張聞?dòng)頪54]在探究ARID4B、FBF1、維生素A1 在C2C12細(xì)胞中的機(jī)制時(shí)都采用了CRISPR/Cas9 技術(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ARID4B是牛磺酸（Tau）促進(jìn)C2C12 細(xì)胞增殖、蛋白質(zhì)合成以及mTOR的mRNA 表達(dá)的關(guān)鍵介導(dǎo)分子.FBF1參與小鼠C2C12 細(xì)胞分化的過(guò)程，并且與Fas相互作用，F(xiàn)as也可受FBF1的調(diào)控.外源添加維生素A1 很可能通過(guò)DHRS3催化形成維甲酸（RA）的途徑促進(jìn)C2C12 成肌細(xì)胞的分化.SRIRAM[55]等發(fā)現(xiàn)與C2C12 細(xì)胞相比，CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的C3G敲低產(chǎn)生的C2C12 細(xì)胞的穩(wěn)定克隆，不能正常分化，表現(xiàn)出Akt活性和S9-GSK3β磷酸化降低.轉(zhuǎn)錄因子CREB1是NRMT1轉(zhuǎn)錄的主要調(diào)節(jié)因子，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)敲除C2C12 小鼠成肌細(xì)胞中NRMT1的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，C2C12 細(xì)胞中Pax7表達(dá)下降，影響細(xì)胞進(jìn)程[56].轉(zhuǎn)錄因子ZBED6和Igf2內(nèi)含子之間存在相互作用，然而當(dāng)CRISPR/Cas9 介導(dǎo)基因敲除C2C12 成肌細(xì)胞中的miR-483 后，IGF2表達(dá)下調(diào)和細(xì)胞增殖率均降低[57].

在C2C12 細(xì)胞的肌生成抑制素（myostatin，MSTN）的研究中，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)發(fā)揮了重要的作用.首先是HUANG[58]等使用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)敲除小鼠C2C12 細(xì)胞系中的MSTN，并對(duì)mRNA 和miRNA 轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序.結(jié)果表明，MSTN的完全丟失上調(diào)了7 個(gè)miRNA，靶向有TGFB1，F(xiàn)OS，RB1等28 個(gè)下調(diào)基因，這些基因與腫瘤發(fā)生和細(xì)胞增殖密切相關(guān)，并且組成相互作用網(wǎng)絡(luò)[58-59].雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證小鼠中的MSTN是mmu-miR-1/206 的靶位點(diǎn).GE[60]等利用CRISPR/Cas9 基因編輯構(gòu)建MSTN3′UTR 發(fā)生突變的C2C12 細(xì)胞模型.結(jié)果顯示，該突變阻斷了MSTN的翻譯水平，并且通過(guò)抑制mmu-mir-206，可以挽救突變C2C12 細(xì)胞中MSTN蛋白的低表達(dá).在缺血再灌注（IR）損傷的研究中，DRYSCH[61]等利用CRISPR/Cas9 基因編輯將myostatin（MSTN）缺失引入C2C12 細(xì)胞系.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，C2C12-Mstn細(xì)胞在缺氧復(fù)氧（HR）作用下，MAPK/ERK激酶3/6（MEK3/6）隨p38mapk活化減弱，該實(shí)驗(yàn)證實(shí)了肌肉生長(zhǎng)抑制素對(duì)HR 中的保護(hù)作用.

3.3 C2C12 細(xì)胞中基因定點(diǎn)編輯

在C2C12 細(xì)胞基因改造方面，張寶[62]構(gòu)建肌肉特異性表達(dá)的打靶小鼠Rosa26 位點(diǎn)的CRISPR/Cas9 載體，并利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)將Donor-CMV-Cas9-DsRed 與Donor-MCK-Cas9-DsRed 同源重組進(jìn)入小鼠C2C12 細(xì)胞的Rosa26 位點(diǎn).同樣，王曉萌[63]等利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)以及肌肉特異性啟動(dòng)子SP，通過(guò)打靶小鼠C2C12 細(xì)胞中Rosa26 位點(diǎn)，成功構(gòu)建了肌肉特異性表達(dá)的Cas9 載體PX459-Rosa26-SP 和肌肉特異同源打靶示蹤載體Donor-Cas9-SP-DsRed.STEIL[64]等在C2C12 細(xì)胞中模擬CALM1基因的1 個(gè)或2 個(gè)等位基因中蛋氨酸氧化為蛋氨酸亞砜，利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)引入了一個(gè)氨基酸替換M109Q.結(jié)果顯示，1 個(gè)或 2 個(gè)等位基因發(fā)生CALM1M109Q 突變的細(xì)胞無(wú)法退出細(xì)胞周期，未能表達(dá)晚期肌源性因子.GóMEZ-DOMíNGUEZ[65]等在小鼠C2C12 成肌細(xì)胞中，利用CRISPR/Cas9 技術(shù)在位于LMNA外顯子4上構(gòu)建了40 多個(gè)突變體，結(jié)果在突變體中檢測(cè)到顯著的肌源性分化缺陷.

這些研究實(shí)驗(yàn)均獲得了具有純合突變的單細(xì)胞克隆和有效的基因敲除或過(guò)表達(dá)載體，并構(gòu)建了相應(yīng)基因的細(xì)胞系，并驗(yàn)證了許多參與C2C12 細(xì)胞成肌分化的轉(zhuǎn)錄因子（見圖2），為后續(xù)通過(guò)不同方法制備基因突變小鼠個(gè)體提供了材料以及理論依據(jù).

圖2 利用CRISPR/Cas9 技術(shù)驗(yàn)證參與C2C12 成肌分化的調(diào)控基因

4 結(jié)語(yǔ)

CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)通過(guò)不斷完善已經(jīng)發(fā)展為一項(xiàng)穩(wěn)定的基因編輯手段.本文闡述的研究結(jié)果表明，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用于小鼠C2C12 細(xì)胞基因編輯的多個(gè)方面，并驗(yàn)證了大量參與C2C12 細(xì)胞成肌分化的轉(zhuǎn)錄因子.但從技術(shù)層面考慮CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)還存在嚴(yán)重的脫靶問(wèn)題，這應(yīng)當(dāng)是在后期研究過(guò)程中重點(diǎn)完善的部分.在C2C12 細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也為構(gòu)建特異性基因突變小鼠以及肌細(xì)胞增殖分化的研究提供更多的理論參考.CRISPR/Cas9 就技術(shù)而言已經(jīng)達(dá)到成熟階段，而且基于Cas9 的單堿基基因編輯技術(shù)也已經(jīng)出現(xiàn)，這樣基因編輯精確性在理論層面被提升到了極高的水平，其應(yīng)用前景極其可觀.基于CRISPR 強(qiáng)大的基因編輯功能，在臨床研究中篩選疾病關(guān)鍵基因、癌癥免疫療法以及遺傳疾病治療等方向都具有巨大潛力.除了Cas9 系統(tǒng)之外，Cas12/13 技術(shù)也逐漸成熟，但目前僅能在實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)用，大規(guī)模商業(yè)化應(yīng)用較困難.目前可以預(yù)見的是，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)會(huì)更加深入和廣泛地被應(yīng)用于各種細(xì)胞以及動(dòng)物的基因編輯研究方面，這將加快農(nóng)業(yè)育種、醫(yī)學(xué)研究和臨床疾病治療等方面的研究取得突破性進(jìn)展.同時(shí)，同家族的Cas12/13 技術(shù)成熟也將成為未來(lái)基因編輯技術(shù)發(fā)展中的重要篇章.