朱 越，廖澤彬，沈 歆，梅 雨，薛夢琪，高 月

0 引 言

惡性腫瘤已成為人類死亡的最主要原因，對于胸部腫瘤如肺癌、乳腺癌、食管癌等，除了傳統(tǒng)手術(shù)切除外，放射療法是其最主要的治療措施[1-3]。但在放療過程中，射線不可避免地?fù)p傷肺部正常組織，從而誘發(fā)放射性肺損傷, 嚴(yán)重影響患者預(yù)后及生活質(zhì)量。放射性肺損傷的早期表現(xiàn)是放射性肺炎，病理表現(xiàn)為肺泡上皮細(xì)胞以及血管內(nèi)皮細(xì)胞受到損傷并釋放炎性因子，炎性因子的累積進(jìn)一步加劇肺部炎性反應(yīng)，臨床表現(xiàn)癥狀為漸漸加重的咳嗽、咳痰和活動后氣急[4]。放射性肺炎具有自限性，輕者無需治療，重者需停止放射治療、使用激素、氧療和抗感染等對癥治療。然而，如炎癥階段前期得不到有效控制，后期將會不斷反復(fù)，進(jìn)而發(fā)展成為不可逆的放射性肺纖維化，最終導(dǎo)致呼吸功能損害，甚至呼吸衰竭[5-6]。由于目前臨床上僅能通過使用大劑量糖皮質(zhì)激素減輕放射性肺炎患者的咳嗽、發(fā)熱等癥狀，但激素使用后的副作用大，特別是對激素耐受的患者[7]。亟需研發(fā)高效低毒的藥物，來滿足放療患者對放射性肺炎的防治需要。

基于放射性肺炎的病理機制，科學(xué)家們對有潛在防護(hù)作用的中醫(yī)藥進(jìn)行了大量的研究，發(fā)現(xiàn)桑杏護(hù)肺顆粒通過調(diào)控Th1/Th2細(xì)胞平衡減輕大鼠放射性肺損傷的癥狀[8]；加味麻杏石甘湯通過抑制TGF-β/Smad信號通路從而減輕放射性肺纖維化[9]；另外，丹參川芎嗪注射液、百令膠囊等被證明對放射性肺炎有防治作用[10-14]。這些藥物與激素聯(lián)合使用，其效果也好于單獨使用激素，且副作用小。

薏苡仁油為從薏苡仁中有效成分提取的新型脂肪乳劑(康萊特注射液)。臨床上主要用于治療原發(fā)性非小細(xì)胞肺癌和原發(fā)性肝癌，和化療藥物合用，有一定增效作用[15]，且能減輕放化療的副反應(yīng)。常用于減輕癌癥患者疼痛[16]，有抑制癌細(xì)胞生長的作用[17]。由于在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中常被用于清解熱毒，是一種潛在的放射性肺損傷防治藥物。本研究旨在對薏苡仁油對放射性肺損傷中早期階段的放射性肺炎的防治作用進(jìn)行初步探索。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組SPF級雄性C57BL/6J小鼠，54只，七周齡，18～22 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證號：SCXK(京)2021-0006，動物飼養(yǎng)于軍事醫(yī)學(xué)研究院動物房，飼養(yǎng)于12 h晝夜交替環(huán)境中，溫度濕度恒定。小鼠采用隨機數(shù)字表法分為3組：正常對照組、輻照組、薏苡仁油組(腹腔注射)，每組18只，分為3個時間段，每個時間段各6只。

1.2照射源及主要儀器60Coγ射線照射源由軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所提供；酶標(biāo)儀(美國PerkinElmer公司)，全自動血細(xì)胞分析儀(Sysmex2000i)，脫水機(日本櫻花，型號：VIP-5)，包埋機(金華科迪，型號：KEDEE KD-TK),切片機(萊卡，型號：RM2235)，組織攤片機(金華科迪，型號：KEDEE KD-TK)，全景切片掃描儀(江豐生物，型號：KFBIO KF-PROP-120)，病理分析軟件K-VIEWER1.5.3.1(江豐生物)。

1.3藥品與實驗試劑薏苡仁油(康萊特注射液，浙江康萊特藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字Z10970091 ,批號：2012187-1)，白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、IL-18、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)(ELISA)檢測試劑盒(北京成志科為生物技術(shù)有限公司)。4%多聚甲醛(biosharp，規(guī)格：BL539A)，病理專用石蠟(世泰)，Hariss蘇木精(珠海貝索，規(guī)格：BASO BA4023)，伊紅(珠海貝索，規(guī)格：BASO BA4022)。

1.4輻照方法小鼠于照射前30min經(jīng)腹腔注射0.4%戊巴比妥鈉麻醉后，每6只為一組，固定于專用照射臺上，小鼠放在距離照射源1.5m處，并使用10cm厚鉛磚對除胸部以外區(qū)域進(jìn)行屏蔽，只保留胸部區(qū)域暴露，輻照野1.5 cm×22 cm，照射劑量率1.41 Gy/min，照射總劑量為25 Gy。正常對照組不做處理。

1.5小鼠給藥正常對照組、輻照組均腹腔注射大豆油，體積與薏苡仁油組一致，薏苡仁油組使用康萊特注射液腹腔注射給藥3 g/(kg·d)，各組于照射后連續(xù)給藥14 d。

1.6小鼠外周血象檢測輻照結(jié)束后，于2、4、8周時每組處死6只，對小鼠進(jìn)行股動脈取血，用全自動血細(xì)胞分析儀測定白細(xì)胞數(shù)量(WBC)。

1.7肺部組織病理觀察輻照結(jié)束后，于2、4和8周時每組處死6只，對小鼠進(jìn)行取材。取小鼠左側(cè)肺葉，置于4%多聚甲醛中浸泡48 h，脫水、石蠟包埋、切片，經(jīng)HE染色后，全景切片掃描儀掃描，使用病理觀察軟件K-VIEWER進(jìn)行觀察，選擇100倍進(jìn)行觀察。

1.8肺組織內(nèi)炎癥因子測定輻照結(jié)束后，于2、4和8周時每組均處死6只小鼠并進(jìn)行取材。取小鼠肺組織，稱量后進(jìn)行組織勻漿，參照試劑盒說明書檢測白介素-1β(IL-1β)、IL-6、IL-18、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量。

1.9統(tǒng)計學(xué)分析使用Graphpadprism 8.4.3(Graphpad Software Inc.La Jolla , USA)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，每個實驗重復(fù)3次，兩組間比較采用t檢驗，3組及以上采用單因素方差分析統(tǒng)計得出是否有統(tǒng)計學(xué)差異，其中，以P≤0.05被認(rèn)為差異有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 薏苡仁油對胸部照射的小鼠外周血象的影響與正常對照組對應(yīng)時間相比，輻照組白細(xì)胞計數(shù)均下降(P<0.05)。與輻照組相比，薏苡仁油組(KLT)在4周時，能顯著提升小鼠白細(xì)胞數(shù)量(P<0.01)，2周及8周時也有所上升，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

與正常對照組比較，*P<0.05， **P<0. 01；與輻照組比較，#P<0.05

2.2薏苡仁油對胸部照射后小鼠肺部組織病理的改變正常對照組各時段肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺泡、血管、氣腔關(guān)系正常，肺泡上皮未見不典型性改變，未見明確白細(xì)胞浸潤；輻照組2周后可見輕度肺炎，肺泡間隔增寬，出現(xiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤。輻照4周后肺炎程度加深，可見肺泡塌陷，炎性細(xì)胞大量浸潤，毛細(xì)血管出血。輻照8周后發(fā)展為重度肺炎，肺泡塌陷實變，肺泡結(jié)構(gòu)破壞，并有輕度纖維化改變。薏苡仁油組和輻照組相比，在輻照后各個時間段均表現(xiàn)出較好的炎癥抑制作用，在輻照4周和8周后也能夠維持肺泡結(jié)構(gòu)的完整性。見圖2。

圖 2 輻照后小鼠肺部組織病理學(xué)形態(tài)變化(HEx100)

2.3薏苡仁油對胸部照射小鼠肺部細(xì)胞因子的影響胸部輻照后2周、4周和8周，相比于正常對照組，輻照組小鼠肺部IL-1β、IL-18、TNF-α和IL-6各有不同程度的升高(P<0.05)。IL-18在照射后2周，輻照組與正常對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。在照射后4周及8周，輻照組IL-6表達(dá)顯著升高(P<0.05)。在輻照后給予薏苡仁油，4周和8周時薏苡仁油組能顯著下調(diào)IL-1β、IL-18、IL-6和TNF-α的表達(dá)(P<0.05)。見表2、3。2周時各指標(biāo)均有所下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表 1 60Coγ射線輻照2周后小鼠肺部各炎癥因子表達(dá)比較

表 2 60Coγ射線輻照4周后小鼠肺部各炎癥因子表達(dá)比較

表 3 60Coγ射線輻照8周后小鼠肺部各炎癥因子表達(dá)比較

3 討 論

腫瘤治療應(yīng)優(yōu)先選擇手術(shù)。對一些失去手術(shù)機會，或術(shù)后復(fù)發(fā)，晚期擴散或轉(zhuǎn)移等，放射療法是一種常用手段。但是，在放療殺傷腫瘤細(xì)胞的同時，射線也會對周圍正常的組織和器官造成損傷[18]。肺癌、乳腺癌等胸部腫瘤在放療后，大約50%患者會產(chǎn)生放射性肺損傷[19]。久而久之，不少患者還會發(fā)展成放射性肺纖維化，這就給放射治療帶來難題。另外，放射療法另一副反應(yīng)，就是骨髓的抑制，導(dǎo)致外周血象、白細(xì)胞的減少。造血系統(tǒng)對輻照極度敏感，外周血白細(xì)胞降低不僅提示造血系統(tǒng)損害，更影響機體免疫系統(tǒng)，誘發(fā)感染。

中藥薏苡仁，具有利水滲濕、清熱解毒、消腫散結(jié)等功效。而薏苡仁油為薏苡仁提取物，是薏苡仁的主要有效成份。本研究以C57BL/6J小鼠為實驗對象，通過60Coγ射線進(jìn)行胸腔局部照射建立放射性肺炎損傷模型，探索薏苡仁油對放射性肺炎的防治作用。

實驗中我們發(fā)現(xiàn)，除正常對照組外，輻照組各個時間段，其白細(xì)胞水平下降，尤其在輻照后的兩周，外周白細(xì)胞的數(shù)量下降到正常對照的1/3左右。而在相同條件下，給予薏苡仁油腹腔注射處理的小鼠，其白細(xì)胞下降的幅度及速度，明顯優(yōu)于輻照組。根據(jù)現(xiàn)有實驗結(jié)果，薏苡仁油對輻照小鼠白細(xì)胞急速下降的保護(hù)作用，一方面來自于骨髓對白細(xì)胞的制造能力增加，另一方面減緩白細(xì)胞的凋亡速度。

病理變化方面,在輻照兩周左右，小鼠放射性肺炎即有所表現(xiàn)，主要為肺泡間隙增寬，炎性細(xì)胞浸潤；4周左右炎性細(xì)胞大量浸潤，毛細(xì)血管充血、肺間質(zhì)水腫；8周左右可見肺泡塌陷實變，肺泡結(jié)構(gòu)破壞。在給予薏苡仁油后，各個時間段均出現(xiàn)了較好的炎癥抑制作用。藥效作用在4周以后效果更為顯著，表現(xiàn)在肺泡的滲出明顯減少，炎性細(xì)胞浸潤減輕，肺泡的結(jié)構(gòu)完整性也比輻照組好。

放射性肺炎的發(fā)病機制和影響因素眾多，主流觀點認(rèn)為，當(dāng)肺部經(jīng)受電離輻射后，上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞受損，從而引發(fā)肺泡屏障功能受損[20]。在輻照后幾天至幾周內(nèi)會產(chǎn)生一系列連鎖反應(yīng)，包括肺部炎性滲出增多、毛細(xì)血管通透性變差、細(xì)胞因子大量釋放[21]。巨噬細(xì)胞的累積又進(jìn)一步誘發(fā)機體的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生諸如氧化應(yīng)激產(chǎn)物ROS；促炎因子IL-1β以及一些促纖維化因子等。這些細(xì)胞因子的釋放和積聚如長期得不到控制，不僅易產(chǎn)生炎性風(fēng)暴，還會導(dǎo)致放射性肺炎由急性向慢性轉(zhuǎn)化，最終發(fā)展成不可逆的放射性肺纖維化。

輻照組小鼠肺組織IL-1β、IL-18和TNF-α各個時間段有不同程度的升高，IL-6在照射后4周及8周，表達(dá)顯著升高，與正常對照組相比均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在照射后給予薏苡仁油處理，4周和8周時薏苡仁油組能顯著下調(diào)IL-1β、IL-18、IL-6和TNF-α的表達(dá)。多項研究表明，放射性肺炎的發(fā)生與IL-1β、IL-6和TNF-α的 高表達(dá)息息相關(guān)，在防治放射性肺炎過程中十分關(guān)鍵[22-25]。因此，薏苡仁油能夠顯著下調(diào)胸部大劑量照射所導(dǎo)致的小鼠肺部炎癥因子紊亂，進(jìn)一步提示薏苡仁油對放射性肺炎的防治作用。

綜上所述，薏苡仁油可以升高輻照后小鼠白細(xì)胞總數(shù)，抑制肺泡結(jié)構(gòu)性改變，減輕炎性細(xì)胞浸潤，并通過抑制炎癥因子IL-1β、IL-18、IL-6和TNF-α的釋放從而達(dá)到減輕放射性肺炎的效果，對放射性肺損傷尤其是放射性肺炎產(chǎn)生一定的防治作用。