劉書宇，湯 沂，李賀娟，劉 晶，宮劍濱

0 引 言

近年來，隨著人們生活質(zhì)量的提高，急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)發(fā)病率逐年升高，成為導(dǎo)致全球死亡率和致殘率升高的主要疾病之一。在美國，每年有超過78萬人患有ACS[1]。ACS包括冠狀動脈粥樣硬化斑塊破裂或糜爛引起的急性心肌梗死和不穩(wěn)定性心絞痛。經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention ，PCI)結(jié)合溶栓治療可恢復(fù)冠狀動脈血流，減少急性心肌缺血損傷。而心肌再灌注本身可引起心肌細胞壞死，稱為缺血/再灌注損傷(ischemia/reperfusion, I/R)[2-4]。I/R損傷的機制包括代謝損傷、大量氧自由基和非氧自由基的形成、細胞內(nèi)鈣超載、交感神經(jīng)系統(tǒng)興奮、炎癥系統(tǒng)和補體系統(tǒng)激活以及斑塊破裂引起的微血管栓塞[5-8]。

越來越多的研究表明，線粒體自噬在心肌I/R損傷中起著重要作用[9]。線粒體通過影響活性氧(ROS)、Ca2+和NAD+/NADH等細胞信號通路調(diào)控細胞的生存和死亡[10-12]。為了應(yīng)對各種應(yīng)激因素，細胞內(nèi)的線粒體會產(chǎn)生相應(yīng)機制(包括線粒體融合、裂變、線粒體自噬和線粒體生物合成等)，以維持線粒體的正常功能。目前研究表明，在哺乳動物細胞中，線粒體分裂和融合是由視神經(jīng)萎縮蛋白(Opal)、線粒體分裂蛋白(Drp1)、線粒體融合蛋白(Mfn)等蛋白共同調(diào)節(jié)以維持線粒體正常的功能；細胞內(nèi)泛素連接酶Parkin與線粒體外膜蛋白激酶Pink1共同調(diào)控線粒體自噬。一項研究表明，在Drp1缺乏的小鼠心肌細胞中，線粒體自噬可能被過度激活[13-17]。已有研究表明，Drp1/Pink1/Parkin通路通過調(diào)節(jié)線粒體自噬，參與多種心血管疾病如急性心肌梗死、心功能不全、心肌病等心肌細胞線粒體損傷的選擇性清除[18]。然而，該通路是否影響心肌I/R損傷尚不清楚。

另外，大量的臨床證據(jù)顯示比索洛爾可以顯著減少ACS患者的心血管不良事件，包括復(fù)發(fā)性心肌梗死、心力衰竭、心源性死亡和住院時間等[19]。我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn)比索洛爾通過減輕未折疊蛋白反應(yīng)保護大鼠心肌細胞缺血/再灌注損傷[20]。但是尚未對其機制進行深入探究，為此，通過本研究旨在探討比索洛爾是否可以通過Drp1/Pink1/Parkin通路保護H9c2心肌細胞I/R損傷。

1 材料與方法

1.1 細胞及試劑①細胞來源：H9c2心肌細胞(美國ATCC細胞庫)。②試劑：Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基DMEM(美國Gibco公司)，胎牛血清(美國Gibco公司)，胰蛋白酶( 美國Gibco公司)，BCA蛋白測定試劑盒(碧云天)，SDS-PAGE電泳液(碧云天)，SDS裂解液 (碧云天)，比索洛爾(大連美侖生物技術(shù)公司)，多功能酶標儀(SpectraMax M5，Molecular Devices；California)，MTT(南京萌邦生物)，流式細胞儀(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA)，Annerxin V FITC細胞凋亡檢測試劑盒(Biouniquer公司)，苯甲磺酰氟(PMSF, 碧云天)，一抗：p-Drp1(1:1000, #3455; Cell Signaling Technology), Drp1(1:1000, 8570; Cell Signaling Technology), Pink1 (1:1000, ab23707; Abcam), Parkin (1:1000, ab23707; Abcam), LC3 (1:1000, ab192890; Abcam), Beclin1(1:1000, ab210498; Abcam), GAPDH (1:10,000, ab8245; Abcam)。

1.2H9c2細胞培養(yǎng)用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基將H9c2細胞接種于細胞培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞生長融合至70%～80%左右，用0.25%的胰酶進行消化、傳代，待細胞生長狀態(tài)良好時，接種于不同培養(yǎng)板中，取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.3細胞缺氧/復(fù)氧(Hypoxia/Reoxygenation，H/R)模型的構(gòu)建待復(fù)蘇后的細胞在37 ℃，含5%CO2，95%空氣的培養(yǎng)箱中生長至對數(shù)期時，參照實驗室前期研究[21]，將細胞培養(yǎng)瓶中10%完全培養(yǎng)基換成等量的缺氧液(NaHCO326.2 mmol/L、CaCl21.8 mmol/L、MgSO40.8 mmol/L、NaH2PO42.6 mmol/L、HEPES 20.1 mmol/L、NaCl 116.4 mmol/L、KCl 5.4 mmol/L)，然后放入37℃，含5%CO2、94%N2、1%O2的三氣培養(yǎng)箱中進行缺氧6 h，最后再將缺氧液換成含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在正常培養(yǎng)箱中復(fù)氧12 h。

1.4實驗分組將生長狀態(tài)良好的H9c2細胞隨機分為4 組：比索洛爾組：在無血清培養(yǎng)基中加入終濃度為2 μmol/L的比索洛爾，正常條件培養(yǎng)，不進行缺氧/復(fù)氧處理；對照組：在37 ℃、5% CO2條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；缺氧/復(fù)氧組：根據(jù)1.3方法構(gòu)建缺氧/復(fù)氧模型；缺氧/復(fù)氧+比索洛爾組：缺氧前1 h在無血清培養(yǎng)基中加入終濃度為2 μmol/L的比索洛爾構(gòu)建模型。

1.5MTT法檢測細胞活力將H9c2細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，密度為5 × 103細胞/孔。待細胞生長融合至70%左右，根據(jù)實驗需求隨機分組給藥處理，給藥一定時間后，每孔加入20 μL MTT繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，輕輕棄去上層液體，每孔加入150 μL DMSO。搖床振蕩10 min，最后用酶標儀在570 nm處測量吸光度A值。

1.6流式細胞儀檢測細胞凋亡用0.25%胰蛋白酶收集不同處理組的細胞，提前準備預(yù)冷的PBS，輕輕洗滌細胞2次，再用195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細胞。各樣品分別加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻，再加入5 μL PI，室溫避光反應(yīng)15 min進行檢測。

1.7Western blot檢測蛋白表達水平先用預(yù)冷的PBS洗滌各處理組的H9c2細胞3次，再用含有1% PMSF的RIPA裂解緩沖液裂解，4 °C，12000 xg離心10 min后，收集細胞，使用BCA試劑盒測定蛋白濃度。 加入上樣緩沖液，放入100 ℃水浴中煮沸5 min，使蛋白變性。進行上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗孵育過夜，TBST緩沖液洗滌3次，每次5 min;然后與二抗室溫孵育，再用TBST洗滌3次。最后用ECL發(fā)光液進行曝光。

1.8構(gòu)建Drp1慢病毒低表達載體(Drp1-siRNA)先將H9c2細胞接種于6孔板中，然后分別加入Drp1慢病毒低表達載體(Drp1-siRNA)及空載體病毒(scramble)。轉(zhuǎn)染72 h后，于熒光顯微鏡下觀察到90%以上的細胞表達綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)，證明細胞感染成功；收集Drp1-siRNA和scramble分別轉(zhuǎn)染的心肌細胞，通過Western blot檢測目的基因Drp1表達變化，若顯示Drp1呈極低表達，則表明轉(zhuǎn)染成功。

2 結(jié) 果

2.1 比索洛爾對H9c2細胞存活的影響與對照組相比，缺氧/復(fù)氧組細胞存活率下降至59.34%±2.6%(P<0.05)；但經(jīng)比索洛爾處理后細胞存活率上升至83.25%±2.3%(P<0.05)。流式結(jié)果表明，與對照組凋亡率(7.1 %±1.4%)相比，缺氧/復(fù)氧組(27.5%±1.7%)明顯升高(P<0.05)；與缺氧/復(fù)氧組相比，缺氧/復(fù)氧+比索洛爾組的凋亡率為15.5%±1.5%(P<0.05)，見圖1。

2.2比索洛爾抑制線粒體裂變，增加線粒體自噬Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，缺氧/復(fù)氧組p-Drp1水平升高(P<0.05)，而LC3II/LC3I、Beclin1、Pink1和Parkin的表達降低(P<0.05)。與缺氧/復(fù)氧組相比，缺氧/復(fù)氧+比索洛爾組p-Drp1水平降低(P<0.05)，而LC3II/LC3I、Beclin1、Pink1和Parkin的表達升高(P<0.05)。以上結(jié)果表明，比索洛爾可降低p-Drp1的表達，增加LC3II/LC3I、Beclin1、Pink1、Parkin的表達，見圖2。

a：比索洛爾組；b：對照組；c：缺氧/復(fù)氧組；d：缺氧/復(fù)氧+比索洛爾組

1：比索洛爾組；2：對照組；3：缺氧/復(fù)氧組；4：缺氧/復(fù)氧+比索洛爾組

2.3下調(diào)Drp1對細胞活力和凋亡的影響通過Drp1慢病毒低表達載體感染H9c2細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的H9c2細胞損傷中，與scramble相比，Drp1-siRNA處理后使H9c2細胞活力由60%提高至87%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；流式結(jié)果也表明，Drp1-siRNA處理后可明顯抑制H9c2細胞的凋亡，見圖3。以上結(jié)果表明，比索洛爾可能通過抑制線粒體Drp1的表達和活性來保護H9c2細胞免受H/ R誘導(dǎo)的損傷。

2.4Drp1敲低對LC3、Beclin1、Pink1、Parkin表達的影響與scramble相比，轉(zhuǎn)染Drp1-siRNA的心肌細胞中Drp1的表達顯著降低(P<0.05)，表明Drp1-siRNA成功轉(zhuǎn)染心肌細胞。在缺氧/復(fù)氧中，與scramble處理相比，Drp1-siRNA處理的細胞LC3II/LC3I比值以及Beclin1、Parkin和Pink1表達水平顯著升高(P<0.05)。比索洛爾的使用進一步上調(diào)了這些自噬相關(guān)蛋白的表達，見圖4。

a：比索洛爾組；b：對照組；c：缺氧/復(fù)氧組；d：缺氧/復(fù)氧+比索洛爾組

1：比索洛爾組；2：對照組；3：缺氧/復(fù)氧組；4：缺氧/復(fù)氧+比索洛爾組

3 討 論

急性心肌梗死是現(xiàn)階段發(fā)病率和死亡率最高的重大疾病之一，給醫(yī)療保健帶來了沉重的負擔(dān)，同時，也使得患者的生命健康難以得到保障。目前，臨床上治療該疾病最有效的方法是PCI或溶栓治療。然而，這些治療均可引起心肌缺血/再灌注(I/R)損傷[22]。本實驗利用H9c2細胞缺氧/復(fù)氧模型，誘導(dǎo)心肌細胞凋亡，模擬機體心肌組織細胞I/R的病理生理本質(zhì)。

近年來，越來越多的研究表明自噬在I/R損傷中扮演著十分重要的作用。有學(xué)者認為，在心肌缺血階段，自噬的激活對心肌發(fā)揮著保護作用，再灌注階段自噬被進一步激活，但其發(fā)揮的作用還有待研究[23-24]。因此，越來越多的學(xué)者對自噬在I/R損傷過程中的作用和機制進行了研究。

眾所周知，線粒體參與多種關(guān)鍵的細胞過程，如細胞凋亡、鈣穩(wěn)態(tài)等[25]。在缺氧/復(fù)氧損傷條件下，線粒體裂變、融合和自噬對心肌細胞活性很重要[26-28]。Drp1 /Pink 1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬是清除線粒體的途徑之一，Pink1被認為是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，可促進Parkin轉(zhuǎn)運到線粒體，增加線粒體蛋白的泛素化。線粒體蛋白的泛素化導(dǎo)致泛素結(jié)合蛋白的招募，如p62/SQSTM[29]，它介導(dǎo)受損線粒體進入自噬體。此外，Drp1易位也可介導(dǎo)線粒體異常裂變，繼而引起線粒體自噬[30]。

本實驗通過研究，我們發(fā)現(xiàn)比索洛爾在缺氧/復(fù)氧處理中增加了細胞活力，同時減少了細胞凋亡。我們還觀察到缺氧/復(fù)氧處理的細胞表現(xiàn)出線粒體中Pink1和Parkin的水平降低，并伴有LC3-II/LC3-I的降低，這表明缺氧/復(fù)氧抑制了自噬相關(guān)通路，這與其他研究一致[31-33]。 比索洛爾顯著提高缺氧/復(fù)氧處理的細胞中LC3II/LC3I比值和線粒體自噬相關(guān)蛋白Beclin1、Pink1、Parkin的表達。經(jīng)siRNA干擾Drp1低表達后，與scramble處理相比，Drp1-siRNA處理的細胞自噬相關(guān)蛋白表達水平顯著升高，比索洛爾的使用進一步上調(diào)了這些自噬相關(guān)蛋白的表達；但Drp1-siRNA組比索洛爾對I/ R誘導(dǎo)的細胞活性和細胞凋亡的保護作用并不明顯，有可能與作用的時間和給藥的劑量有一定的關(guān)聯(lián)，其具體機制還有待進一步研究。

以上結(jié)果表明，比索洛爾可能通過Drp1/Parkin/Pink1通路激活線粒體自噬，減少心肌細胞凋亡，進而保護心肌細胞。這為臨床上研究和治療缺血再灌注損傷提供了理論依據(jù)。但本研究也存在一些不足需要改進，僅在細胞水平上對自噬在I/R損傷過程中的作用和機制進行了研究，而沒有在動物和臨床上進行深入研究，后期將進一步對其進行深入探索。