簡思杰，晁 嘉，孫 薇，陳 銳，丁 銳，陳 琛，5，劉 祥

（1. 陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院/中德天然產(chǎn)物研究所，陜西 漢中 723001；2. 阜陽師范大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，安徽 阜陽 236037；3. 陜南秦巴山區(qū)生物資源綜合開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 漢中 723001；4. 陜西理工大學(xué) 秦巴生物資源與生態(tài)環(huán)境省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（培育），陜西 漢中 723001；5. 陜西省資源生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 漢中 723001）

嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）屬弧菌科、氣單胞菌屬，革蘭氏染色呈陰性，其廣泛存在于淡水、土壤、污水以及人體糞便中，是一種廣泛流行的“人-畜-水生動物”共患病病原菌[1]。我國是水產(chǎn)大國，2020 年，我國淡水產(chǎn)品總量3234.64 萬t[2]。目前，嗜水氣單胞菌感染的水生動物病例呈上升趨勢，以淡水魚類為主，其是魚類的常見致病菌[3]。而且嗜水氣單胞菌也是我國大規(guī)模流行淡水養(yǎng)殖魚類暴發(fā)性疾病的主要病原菌[4]。嗜水氣單胞菌已嚴(yán)重危害我國淡水養(yǎng)殖業(yè)，對此病原菌的防治急需加強(qiáng)。傳統(tǒng)防治手段以抗生素防治及化學(xué)藥品防治為主，但長期使用抗生素會造成嚴(yán)重后果。如濫用抗生素會導(dǎo)致病原菌耐藥性增強(qiáng)，已經(jīng)出現(xiàn)耐青霉素、四環(huán)素等菌株[5]；抑制吞噬細(xì)胞的吞噬功能，導(dǎo)致魚類自身免疫力低下；抗生素的濫用更在一定程度上破壞了生態(tài)平衡；也可隨著食物鏈的富集對人類的健康產(chǎn)生危害。因此，亟須尋找生態(tài)友好型抗菌劑，其中基于外膜蛋白的亞單位疫苗是一種理想選擇。

外膜蛋白（Outer membrane protein，OMP），是革蘭氏陰性菌細(xì)胞的表面分子，在維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)、生命活動方面發(fā)揮重要作用，其暴露的抗原決定簇也可使外膜蛋白極易被免疫系統(tǒng)識別，從而引起機(jī)體的特異性免疫[6]。目前，已有基于外膜蛋白免疫原性的魚類疫苗研究，如TANG 等[7]將魚腸弧菌的5 個(gè)外膜蛋白進(jìn)行原核表達(dá)，發(fā)現(xiàn)外膜蛋白T 具有良好的保護(hù)性；SUN 等[8]成功表達(dá)純化熒光假單胞菌外膜蛋白ExbB，通過被動免疫保護(hù)評價(jià)，發(fā)現(xiàn)ExbB 對熒光假單胞菌感染的保護(hù)率可達(dá)54.0%，同時(shí)對嗜水氣單胞菌感染具有交叉免疫保護(hù)作用，保護(hù)率為38.4%；LIU 等[9]表達(dá)的熒光假單胞菌外膜蛋白PF1380同樣具有交叉被動免疫保護(hù)作用，對熒光假單胞菌感染的保護(hù)率為57%，對嗜水氣單胞菌感染的保護(hù)率為50%；毛然然等[10]將嗜水氣單胞菌外膜蛋白OprM 原核表達(dá)并進(jìn)行免疫保護(hù)作用評價(jià)，發(fā)現(xiàn)外膜蛋白OprM 的保護(hù)率高達(dá)89.47%；榮娜等[11-12]成功表達(dá)純化了嗜水氣單胞菌外膜蛋白P5、TolC，這些外膜蛋白均具有免疫原性。綜上所述，外膜蛋白具有一定免疫保護(hù)作用，同時(shí)也具有良好的應(yīng)用前景，但嗜水氣單胞菌外膜蛋白AHA1182的研究未見報(bào)道。為此，表達(dá)嗜水氣單胞菌外膜蛋白AHA1182并探究其免疫原性，以期為嗜水氣單胞菌疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及供試動物 嗜水氣單胞菌ATCC 7966，大腸桿菌（E.coli）DH5α、BL21 菌株及pET-32a 質(zhì)粒由陜西理工大學(xué)中德天然產(chǎn)物研究所保存；紅鯽購自漢中市某水族館，體表健康，平均體質(zhì)量約20 g，身長平均約10 cm，試驗(yàn)前在90 L 水箱中飼養(yǎng)14 d，每天換水1/3，飼養(yǎng)用水經(jīng)過處理，平均水溫（20±2）℃，飼料（上海傲滋水族科技有限公司）每日按體質(zhì)量的1%供給，使用氣泵24 h 供給空氣。飼養(yǎng)14 d后未見任何感染、死亡。

1.1.2 主要試劑 rTaq 聚合酶、ExTaq聚合酶、T4DNA 連接酶、內(nèi)切酶BamH Ⅰ及XhoⅠ購自日本TaKaRa公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒購自北京天根試劑公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購自杭州博日公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、二甲基聯(lián)苯胺（DAB）、DL2000 DNA marker、氨芐青霉素（AMP）購自北京索萊寶公司；TMB 顯色液為上海生工公司產(chǎn)品；HRP 標(biāo)記山羊抗大鼠IgG 購于Sigma 公司；堿性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶（ACP）測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；弗氏不完全佐劑購自MP 生物醫(yī)療公司；引物合成、基因測序由西安奧科生物公司完成；大鼠抗魚血清為中德天然產(chǎn)物研究所實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析 從NCBI 數(shù)據(jù)庫中下載嗜水氣單胞菌、殺鮭氣單胞菌、簡氏氣單胞菌、多樣氣單胞菌、舒氏氣單胞菌、產(chǎn)堿普羅維登斯菌以及愛德華氏菌與AHA1182 相同家族的外膜蛋白氨基酸序列，利用GeneDoc 3.2 軟件進(jìn)行序列對比，采用MEGA 5.0軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建 NCBI 數(shù)據(jù)庫中查找嗜水氣單胞菌ATCC7966 全基因組，根據(jù)全基因組設(shè)計(jì)AHA1182的 擴(kuò) 增 引 物 ，上 游 引 物 ：5′-AGAGGATCCGTGAATAAAGCGTTGAAA-3′，下 游引物：5′-ACCCTCGAGTTAGTTGCTCTTGCTTACC-3′（劃線部分為酶切位點(diǎn)）；擴(kuò)增模板為嗜水氣單胞菌全基因組；利用r Taq 聚合酶擴(kuò)增，體系為50-μL。預(yù)變性溫度、退火溫度、退火時(shí)間分別為94 ℃、55 ℃、90 s；對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行電泳鑒定并切膠回收；使用BamHⅠ與XhoⅠ對PCR 產(chǎn)物與pET-32a 質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，對二者分別切膠回收；通過T4 DNA 連接酶將目的片段與載體在16 ℃下連接16～18 h；將連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E.coliDH5α 中，轉(zhuǎn)化成功后提取構(gòu)建好的重組質(zhì)粒；利用雙酶切鑒定重組質(zhì)粒是否構(gòu)建成功；最后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coliBL21中，進(jìn)行相應(yīng)蛋白質(zhì)的原核表達(dá)。

1.2.3 重組蛋白的表達(dá)與純化 挑取單菌落培養(yǎng)8～12 h，按1∶100 比例轉(zhuǎn)接至含AMP 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3～4 h，0.1 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)8 h。取1 mL 菌液并離心收菌，加入300μL 2×SDS上樣緩沖液后沸水浴2 min，SDS-PAGE 電泳檢測目的蛋白的表達(dá)。重組蛋白的純化具體步驟：以1∶100 的比例將過夜培養(yǎng)的表達(dá)菌液轉(zhuǎn)接至600 mL LB 培養(yǎng)液（Amp+）中；培養(yǎng)至OD600=0.5時(shí)，加入600μL 0.1 mmol/L IPTG，誘導(dǎo)8 h；4 000 r/min離心10 min，收集誘導(dǎo)菌體進(jìn)行超聲破碎，超聲結(jié)束后，8 000 r/min 離心10 min，收集包涵體；將包涵體反復(fù)洗滌后進(jìn)行SDS-PAGE 電泳；將目的條帶切下研磨至無凝膠碎片，用蛋白質(zhì)浸提液重懸，室溫輕搖2 h；4 ℃、8 000 r/min 離心20 min，收集上清，加入4 倍體積預(yù)冷丙酮，-20 ℃過夜萃?。粚⑤腿『蟮牡鞍踪|(zhì)離心，收集沉淀用無菌水溶解，測量濃度并凍干。

1.2.4 重組蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化 采用L9（34）正交試驗(yàn)?zāi)Ｐ停ū?）探究目的蛋白的最佳表達(dá)條件。主要步驟：將過夜培養(yǎng)的蛋白質(zhì)表達(dá)菌液以1∶200 的比例接入600 mL 培養(yǎng)液中，37 ℃、220 r/min 培養(yǎng)至設(shè)定的OD600值，按照表中要求加入不同濃度的IPTG，每組進(jìn)行3 次重復(fù)。取1 mL 誘導(dǎo)菌液，離心收菌后菌體加入300μL 2×SDS蛋白質(zhì)上樣緩沖液，沸水浴2 min，SDS-PAGE 電泳獲得不同誘導(dǎo)條件下的AHA1182 蛋白表達(dá)圖譜。通過軟件Phoretix 1D 1.0.0.1 和SPSS 20.0 分別對表達(dá)圖譜光密度和不同因子作顯著性分析。

表1 蛋白質(zhì)表達(dá)條件正交試驗(yàn)的因子與水平Tab.1 Factors and levels of orthogonal test for protein expression condition

1.2.5 紅鯽抗血清特異性檢測 紅鯽免疫組與對照組各35條，免疫組與對照組均采用弗氏不完全佐劑乳化后進(jìn)行免疫。免疫組按照2μg/g的劑量進(jìn)行免疫，紅鯽腹腔注射免疫AHA1182 蛋白，14 d 后進(jìn)行第2 次免疫，7 d 后進(jìn)行第3 次免疫，操作同上；對照組免疫無菌水。7 d后尾靜脈取血。應(yīng)用Western blot夾心法驗(yàn)證紅鯽抗血清特異性，步驟如下：SDSPAGE 電泳嗜水氣單胞菌全蛋白；80 V、1 h 電轉(zhuǎn)于硝酸纖維素（NC）膜上，置于5%脫脂牛奶粉中充分封閉；將封閉好的NC 膜與不同稀釋倍數(shù)（1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200）的紅鯽抗血清、陰性對照血清在37 ℃中孵育40 min，TBST 溶液洗滌3 次，每次10 min；再與1∶400 的大鼠抗魚血清孵育，具體步驟同上；最后與1∶3 000 山羊抗大鼠抗體孵育；洗滌后進(jìn)行DAB顯色，確定抗原-抗體的結(jié)合情況。

1.2.6 ACP、AKP 活性測定 采用南京建成生物工程研究所試劑盒進(jìn)行ACP、AKP 測定，嚴(yán)格按說明書步驟進(jìn)行。

1.2.7 體外細(xì)胞吞噬試驗(yàn) 吞噬細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)中重要的細(xì)胞成分之一，吞噬微生物和其他異物顆粒，在機(jī)體免疫應(yīng)答中起重要作用。具體步驟：取免疫AHA1182 蛋白的紅鯽血漿200 μL 與1%甲醛生理鹽水滅活的金黃色葡萄球菌（6×108cfu/mL）1∶1 混合，25 ℃水浴60 min（每10 min 振蕩混勻一次）；以免疫無菌水的紅鯽血漿為對照。反應(yīng)結(jié)束后制作血涂片，用快速姬姆薩染色試劑盒（上海生工）進(jìn)行染色。

1.2.8 體外模擬抗AHA1182 蛋白抗體與嗜水氣單胞菌的相互作用 利用酶聯(lián)免疫吸附（ELIAS）法[13]檢測免疫紅鯽血漿與嗜水氣單胞菌的相互作用。具體步驟：嗜水氣單胞菌培養(yǎng)至OD600約1.0后，將菌體離心并洗滌；將菌體OD600調(diào)整至1.0（菌濃度1.0×109cfu/mL），分裝菌體每管150μL，再與不同稀釋倍數(shù)的血漿（1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200）37 ℃條件下孵育90 min，對照為陰性血漿；再與1∶400 的大鼠抗魚血清孵育90 min；最后與1∶3 000山羊抗大鼠抗體孵育1 h。將洗滌好的菌體與20 μL PBS 混合后加入酶標(biāo)板，再加入200 μL 的TMB 顯色液；最后用50μL 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，450 nm讀數(shù)。

1.2.9 病理切片觀察 以免疫結(jié)束的紅鯽腎臟、脾臟、腸為組織病理學(xué)切片材料。病理切片主要有3個(gè)步驟，即組織包埋、組織切片與H&E染色：（1）組織包埋：將組織立即浸泡在改良的Davidson’s[14]固定液中，固定18～24 h 后轉(zhuǎn)入10%甲醛溶液中繼續(xù)固定24 h；將固定好的組織于梯度體積分?jǐn)?shù)（80%、90%、95%、100%）的乙醇中脫水，再放入二甲苯中透明；將透明好的組織于60 ℃的石蠟中充分浸蠟，再包埋于折疊好的模具中。（2）切片：將包埋好的組織修正成約1 cm3的立方體，石蠟切片機(jī)切成厚度為4μm 的切片，并將其附著于載玻片上，烘干。（3）H&E 染色：使用蘇木素與伊紅進(jìn)行染色。首先將烘干的切片放入二甲苯中脫蠟；再于梯度體積分?jǐn)?shù)的乙醇中復(fù)水，復(fù)水結(jié)束后蘇木素染色30 s，使細(xì)胞核上色，伊紅染色20 min，使細(xì)胞質(zhì)著色。繼續(xù)于梯度體積分?jǐn)?shù)的乙醇中脫水，在二甲苯中透明，最后用中性樹脂封片即可。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，并用GraphPad Prism 8.0.1軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌株間外膜蛋白AHA1182同源性與系統(tǒng)發(fā)育分析

利用GeneDoc 3.2 軟件對不同菌株與嗜水氣單胞菌外膜蛋白AHA1182的氨基酸序列進(jìn)行比對，結(jié)果顯示，氣單胞菌間具有高度的同源性，分別為98.8%（殺鮭氣單胞菌）、73.5%（舒氏氣單胞菌）、72.9%（多樣氣單胞菌）、90.4%（簡氏氣單胞菌），而不同屬間菌株也具有一定的同源性（圖1）。以MEGA 5.0 軟件構(gòu)建的進(jìn)化樹顯示，2 種不同的氣單胞菌親緣關(guān)系較近（嗜水氣單胞菌、殺鮭氣單胞菌），且不同種菌株間也有一定的親緣關(guān)系（圖2）。因而，動物免疫AHA1182蛋白后產(chǎn)生的抗體可能對不同種屬的細(xì)菌有交叉免疫的作用。

圖1 不同菌株間外膜蛋白AHA1182氨基酸序列比對結(jié)果Fig.1 Alignment results of amino acid sequences of outer membrane protein AHA1182 among different strains

圖2 不同菌株間外膜蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of outer membrane proteins among different strains

2.2 外膜蛋白AHA1182的表達(dá)純化

利用PCR 擴(kuò)增AHA1182基因，結(jié)果如圖3A 所示，在約500 bp 處有單一且清晰的條帶，與理論值一致；重組質(zhì)粒pET-32a-AHA1182經(jīng)過BamH Ⅰ與XhoⅠ雙酶切鑒定，在約500 bp處得到一條帶，與理論值相同，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功（圖3B）。重組質(zhì)粒經(jīng)轉(zhuǎn)化E.coliBL21，IPTG誘導(dǎo)后，通過SDS-PAGE電泳可得1條約35 ku的條帶，表示目標(biāo)蛋白AHA1182表達(dá)成功（圖3C）；利用包涵體洗滌、SDS-PAGE 切膠純化后獲得的目的蛋白如圖3C所示。

圖3 AHA1182重組質(zhì)粒的構(gòu)建及蛋白質(zhì)純化檢測Fig.3 Construction of recombinant plasmid and protein purification of AHA1182

2.3 AHA1182蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化

誘導(dǎo)菌液經(jīng)SDS-PAGE 電泳獲得不同誘導(dǎo)條件下的表達(dá)圖譜，圖譜光密度值分析如表2所示，所得數(shù)據(jù)極差和方差分析如表3、表4 所示。綜合分析，AHA1182蛋白的最佳表達(dá)條件為A3B3C2D1，即菌液濃度OD600=1.0，IPTG 終濃度為0.5 mmol/L，在28 ℃下誘導(dǎo)8 h；通過顯著性分析可知，IPTG 濃度對AHA1182蛋白的高效表達(dá)有重要作用。

表2 AHA1182蛋白表達(dá)圖譜光密度分析Tab.2 Optical density analysis of AHA1182 expression map

表3 AHA1182表達(dá)圖譜光密度值的極差分析Tab.3 Range analysis of optical density of AHA1182 expression map

表4 AHA1182表達(dá)圖譜光密度值的方差分析Tab.4 Variance analysis of optical density of AHA1182 expression map

2.4 AHA1182蛋白抗血清的特異性與效價(jià)檢測

Western blot試驗(yàn)結(jié)果（圖4）顯示，約在23 ku處出現(xiàn)特異性條帶，陰性血清無條帶，表明紅鯽血清中存在抗體與嗜水氣單胞菌特異性結(jié)合。說明AHA1182具有免疫原性，并正確激活了紅鯽的特異性免疫，血清效價(jià)為1∶100（圖4）。

圖4 AHA1182蛋白抗血清的特異性與效價(jià)檢測Fig.4 Detection of specificity and titer of AHA1182 protein serum

2.5 免疫AHA1182蛋白紅鯽血清的ACP、AKP活性測定結(jié)果

紅鯽在免疫AHA1182 蛋白后，與對照組相比，血清的ACP、AKP 均極顯著性（P＜0.01）升高（圖5），表明外膜蛋白AHA1182 可激活紅鯽體內(nèi)的非特異性免疫。

圖5 AHA1182蛋白抗血清的AKP、ACP活性Fig.5 Activity of AKP and ACP in serum of C.auratus immunized with AHA1182 protein

2.6 免疫AHA1182蛋白紅鯽血漿的體外細(xì)胞吞噬作用

免疫AHA1182 蛋白紅鯽血漿的吞噬作用結(jié)果如表5 所示。與對照組相比，免疫AHA1182 蛋白紅鯽血漿細(xì)胞吞噬作用明顯升高：吞噬百分?jǐn)?shù)升高，且吞噬指數(shù)極顯著升高（P＜0.01）。

表5 免疫AHA1182蛋白后紅鯽血漿的細(xì)胞吞噬作用Tab.5 Leukocyte phagocytosis of C.auratus plasma after immunization with AHA1182

2.7 免疫AHA1182蛋白紅鯽血漿與嗜水氣單胞菌的相互識別作用

利用ELISA 進(jìn)行體外相互作用模擬，結(jié)果顯示，免疫AHA1182蛋白后紅鯽血漿與嗜水氣單胞菌相互作用強(qiáng)度隨血漿的稀釋度增大而減小，可證明抗AHA1182 蛋白抗體與嗜水氣單胞菌在體外具有相互識別作用，且滴度可達(dá)1∶3 200（圖6）。

圖6 抗AHA1182蛋白抗體與嗜水氣單胞菌體外相互作用Fig.6 AHA1182 protein antibody interacts with Aeromonas hydrophila in vitro

2.8 AHA1182蛋白對紅鯽內(nèi)臟的影響

對紅鯽腎臟、脾臟、腸組織進(jìn)行組織病理學(xué)切片（圖7），對照組腎臟組織可見細(xì)胞排列緊湊，腎小管、腎小球無明顯損傷（7a），脾臟結(jié)構(gòu)緊湊，淋巴細(xì)胞數(shù)量相對較多（7b），腸組織杯狀細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)完整（7c）；AHA1182 蛋白免疫組與對照組相比內(nèi)臟組織無明顯區(qū)別，表明免疫外膜蛋白AHA1182對紅鯽內(nèi)臟無影響。

圖7 紅鯽腎臟、脾臟、腸組織病理學(xué)切片F(xiàn)ig.7 Pathological sections of kidney，spleen and intestine of C.auratus

3 結(jié)論與討論

嗜水氣單胞菌是廣泛存在于各種水體中的病原菌，其對漁業(yè)養(yǎng)殖的危害性已引起公眾的注意，且目前的防治方法均存在缺陷。長期使用抗生素防治會使病原菌產(chǎn)生耐藥性；飼料中維生素與中草藥的添加雖會提高魚類的抗菌力，但防治效果不明顯；益生素的使用能夠提高一部分魚類的自身免疫力，但適用范圍并不廣泛[15]。因此，本研究選取嗜水氣單胞菌外膜蛋白AHA1182進(jìn)行主動免疫評價(jià)，為研制嗜水氣單胞菌漁用疫苗尋找新的候選抗原。

本研究成功構(gòu)建了AHA1182原核表達(dá)菌株，正交試驗(yàn)確定了最佳表達(dá)條件：菌液濃度OD600=1.0，IPTG 終濃度為0.5 mmol/L，在28 ℃條件下誘導(dǎo)8 h。顯著性分析表示，IPTG 濃度對誘導(dǎo)表達(dá)有極顯著的影響。有研究表明，低溫培養(yǎng)有助于蛋白質(zhì)的可溶性表達(dá)，可減少包涵體的形成[16]，本研究結(jié)果（28 ℃）印證了這一結(jié)論。誘導(dǎo)時(shí)間因素對蛋白質(zhì)表達(dá)具有重要影響，有研究表明，誘導(dǎo)時(shí)間過長會導(dǎo)致蛋白質(zhì)被蛋白酶降解，不利于蛋白質(zhì)的表達(dá)[17]，這與本研究結(jié)果（8 h）一致。IPTG 具有一定的毒性，過高濃度的IPTG 會抑制細(xì)菌生長[18]，適度的IPTG 濃度對蛋白質(zhì)的表達(dá)量具有重要作用。本研究結(jié)果表明，IPTG 濃度對蛋白質(zhì)表達(dá)有極顯著的影響，其最佳濃度為0.5 mmol/L。最佳誘導(dǎo)條件的確定，為AHA1182蛋白的批量純化并進(jìn)行免疫學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。

免疫原性指能夠刺激特定的免疫細(xì)胞，使免疫細(xì)胞活化、增殖、分化，產(chǎn)生抗體從而引起免疫應(yīng)答的抗原。本研究通過體外模擬紅鯽血清與嗜水氣單胞菌的識別作用及Western blot 檢測AHA1182 的免疫原性。體外模擬試驗(yàn)結(jié)果表明，抗血清與細(xì)菌具有相互作用，且效價(jià)可達(dá)1∶3 200；Western blot 檢測結(jié)果表明，紅鯽抗血清具有特異性。這與前人研究結(jié)果基本一致[19-21]?？乖?抗體結(jié)合需要相應(yīng)的抗體[22]，而體外模擬的結(jié)果說明了紅鯽血清可識別嗜水氣單胞菌，并通過抗原呈遞作用，將體內(nèi)病原菌清除。本研究利用純化后的外膜蛋白AHA1182免疫紅鯽，發(fā)現(xiàn)AHA1182 蛋白具有一定的免疫原性，為漁用疫苗的開發(fā)奠定了生物學(xué)基礎(chǔ)。

非特異性免疫是魚類免疫病原微生物的主要方式，吞噬作用與免疫相關(guān)的酶類是非特異性免疫的重要組成部分。ACP、AKP作為魚類主要解毒酶，廣泛存在于魚類體液與臟器中[23-24]。因此，吞噬細(xì)胞活性、AKP、ACP 可作為非特異性免疫的評價(jià)指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，對紅鯽免疫AHA1182 蛋白后，紅鯽血清中AKP、ACP 均顯著升高；同時(shí)，紅鯽血漿中細(xì)胞吞噬作用的指標(biāo)值均升高。可見，AHA1182蛋白可激活紅鯽的非特異性免疫。此外，SUN 等[8]通過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)熒光假單胞菌外膜蛋白ExbB進(jìn)化保守，且具有交叉免疫保護(hù)作用。本研究選取6 株具有AHA1182 相同家族外膜蛋白的魚類致病菌，并與嗜水氣單胞菌外膜蛋白AHA1182進(jìn)行氨基酸序列比對、系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)外膜蛋白AHA1182 進(jìn)化保守，因此，蛋白AHA1182 也可能具有交叉免疫保護(hù)作用，有望成為多價(jià)疫苗的候選抗原。

組織病理學(xué)切片觀察可直觀反映組織、細(xì)胞的損傷情況。張海彬等[25]利用病理學(xué)組織切片觀察感染嗜水氣單胞菌的烏鱧內(nèi)臟損傷情況；蘭蕾等[26]對艾煙染毒后大鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺等組織進(jìn)行組織病理學(xué)切片觀察，發(fā)現(xiàn)染毒后均有損傷。本研究利用組織病理學(xué)切片觀察，發(fā)現(xiàn)AHA1182蛋白的免疫對紅鯽內(nèi)臟無明顯影響。

綜上所述，AHA1182 蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性，能夠激活紅鯽非特異性免疫，且對紅鯽內(nèi)臟無明顯影響。本研究證明了嗜水氣單胞菌外膜蛋白AHA1182可作為一種保護(hù)性抗原，為嗜水氣單胞菌疫苗的開發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)。