陳維聰，劉運超，周川杰，楊蘇珍，魏 薔，柴書軍，張改平，，3

（1. 西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動物免疫學(xué)重點實驗室，河南 鄭州 450002；3. 揚州大學(xué) 江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚州 225009）

豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）為單股正鏈RNA 病毒，屬于冠狀病毒科[1]。PEDV 傳染性強(qiáng)，對各年齡段的豬均能感染，多在寒冷季節(jié)暴發(fā)[2-3]。該病毒的傳播途徑主要是糞-口傳播，氣溶膠也是傳播途徑之一，飼料和原料成分也可將病原傳播給仔豬。通常年齡較大的豬感染PEDV 病情較輕且病程短，死亡率低，但對哺乳期仔豬危害極大，常引起嚴(yán)重腹瀉和嘔吐，病死率可達(dá)50%以上[4]。PEDV 基因組包含7 個開放閱讀框（Open reading frame，ORF），其中ORF1a 和1b 編碼的2 種蛋白質(zhì)被切割成多個非結(jié)構(gòu)蛋白（nsp1—nsp16），參與PEDV RNA 的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制[5]。ORF2—6依次編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白，分別為S、E、M和N蛋白，其中S 蛋白位于病毒表面，由1 383 個氨基酸組成，在病毒與宿主細(xì)胞受體相互作用和刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體方面起重要作用[6-7]。前人研究表明，在PEDV 入侵宿主細(xì)胞時，S蛋白由宿主蛋白酶切割成S1 和S2 亞基，S1 蛋白介導(dǎo)病毒與細(xì)胞受體的結(jié)合，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，是研制PEDV 亞單位疫苗的重要靶標(biāo)蛋白[8]。

目前，尚無針對PEDV 的特效藥物，只能通過免疫接種疫苗進(jìn)行預(yù)防。臨床上廣泛使用PEDV 的滅活疫苗或減毒活疫苗進(jìn)行免疫，取得了良好的防控效果[9]。但是隨著病毒的不斷變異，尤其是G2b 亞型變異毒株的出現(xiàn)，使得PEDV 的防控壓力逐漸增大[10-12]。同時，弱毒疫苗還存在排毒或毒力返強(qiáng)等問題，增加了生物安全風(fēng)險。與弱毒疫苗相比，亞單位疫苗具有抗原特異性強(qiáng)、免疫原性好、生物安全性高等優(yōu)點[13-14]。SUO 等[15]以哺乳動物細(xì)胞表達(dá)的PEDV S1 蛋白為抗原制備疫苗免疫妊娠母豬，可在血清中檢測到抗PEDV 中和性抗體，對所產(chǎn)仔豬具有良好的保護(hù)作用。譚博敏等[16]在畢赤酵母表達(dá)載體中插入PEDV S1 蛋白基因，并成功在酵母染色體上整合了該基因，表達(dá)的目的蛋白與PEDV 陽性血清能發(fā)生特異性結(jié)合。之后，該團(tuán)隊構(gòu)建了S1和M基因的共表達(dá)重組桿狀病毒，其共表達(dá)產(chǎn)物與PEDV 多克隆抗體的反應(yīng)具有很強(qiáng)的特異性，且具有良好的反應(yīng)原性。前人研究表明，果蠅胚胎S2細(xì)胞為懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)過程中不需要CO2，細(xì)胞培養(yǎng)工藝簡單，生產(chǎn)成本低廉，便于規(guī)?；a(chǎn)[17]。為此，利用果蠅胚胎S2 細(xì)胞重組表達(dá)PEDV 的S1 蛋白，將表達(dá)的目的蛋白純化后制備疫苗進(jìn)行動物免疫試驗，對其免疫原性進(jìn)行綜合評估，旨在為研制新型PEDV亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 載體、細(xì)胞、主要試劑及供試動物

PEDV CH/HUBEI/2016 株、pMT/BiP/V5-S1-His A表達(dá)載體、果蠅胚胎S2 細(xì)胞、PEDV 陽性血清、ISA 50V 佐劑、HisTrap Excel 預(yù)裝柱、Superdex 200 Increase 凝膠過濾層析柱、LPS 培養(yǎng)液、熒光標(biāo)記抗體（CD3e-APC、CD4-FITC、CD8a-PE）均由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物免疫學(xué)重點實驗室提供。

Vero 細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫；RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM 高糖培養(yǎng)基、PBS、雙抗（100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素）、ECL 顯色液試劑盒、Cell Counting Kit-8 試劑盒，均購自北京索萊寶公司；牛胰蛋白酶購自Sigma 公司；彩虹180 廣譜蛋白質(zhì)Marker 購自Thermo Fisher Scientific 公司；鼠抗組氨酸標(biāo)簽（His）抗體購自Proteintech 公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠IgG 購自Abcam 公司；PEDV-IgG 抗體檢測試劑盒、IL-4 檢測試劑盒和IFN-γ 檢測試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物公司；APC anti mouse CD3e、FITC anti mouse CD4、PE anti mouse CD8a 抗體均購自BD 公司；細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑CellfectinⅡ、殺稻瘟菌素S（Blasticidin S）均購自Invitrogen 公司；4 周齡雌性昆明鼠（共20 只）購自鄭州市實驗動物中心。

1.2 重組蛋白的表達(dá)

將重組表達(dá)載體pMT/BiP/V5-S1-His A 和輔助載體pCoBlast 按19∶1 的比例共轉(zhuǎn)染生長狀態(tài)良好的果蠅胚胎S2 細(xì)胞，每隔72 h 更換含殺稻瘟菌素S的新鮮完全培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，經(jīng)4～5輪篩選，待正常生長的細(xì)胞培養(yǎng)至密度（4～6）×105個/mL 時，加入終濃度0.75 mmol/L 的硫酸銅進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，28 ℃、220 r/min 條件下培養(yǎng)5 d。收集誘導(dǎo)后細(xì)胞離心取上 清 進(jìn) 行Western blot 檢 測，以1∶5 000 稀 釋 的PEDV陽性血清為一抗，以1∶2 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗。

1.3 重組蛋白的純化

收集誘導(dǎo)細(xì)胞，2 000 r/min 離心30 min 收集上清。使用pH 值8.8 的1.5 mol/L Tris-HCl 緩沖液調(diào)節(jié)細(xì)胞上清pH 值至8.0，4 ℃條件下10 000 r/min 離心30 min，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾后用于純化。首先使用5 mL HisTrap Excel 預(yù)裝柱對表達(dá)的重組PEDV S1 蛋白初步純化，收集不同濃度咪唑洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE 初步鑒定，將得到的洗脫液經(jīng)超濾管濃縮后，然后用Superdex 200 Increase 凝膠過濾層析柱進(jìn)一步純化，收集洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。

1.4 重組蛋白的免疫評價

1.4.1 免疫程序 將純化的重組PEDV S1 蛋白與ISA 50V 佐劑按照1∶1（m/V）混合乳化制備疫苗。將20 只昆明鼠隨機(jī)分為4 組，采取皮下多點注射法進(jìn)行免疫。高劑量免疫組免疫S1 蛋白60 μg/只（S1 60 μg）；低劑量免疫組免疫S1 蛋白20 μg/只（S1 20μg）；滅活病毒免疫組免疫PEDV 滅活病毒液150μL/只（濃縮后TCID50=10-6/100μL）；PBS 免疫組免疫PBS 150μL/只，作為陰性對照。首免后14、35 d各加強(qiáng)免疫一次。首免后分別于0、7、14、21、28、35、42、49、56 d 眼眶靜脈叢采血分離血清，三免后10 d摘取脾臟，分別采用流式細(xì)胞術(shù)、ELISA、病毒中和試驗和淋巴細(xì)胞增殖試驗檢測小鼠的免疫應(yīng)答。

1.4.2 特異性抗體及細(xì)胞因子檢測 采用雙抗夾心法測定免疫小鼠特異性IgG 抗體產(chǎn)生水平，將待檢血清50倍稀釋，與標(biāo)準(zhǔn)品分別加入以PEDV S1蛋白抗原包被的微孔中，每組樣品重復(fù)5 次，37 ℃孵育30 min，每孔加入150μL PBST 洗滌5 次；每孔加入50 μL 酶標(biāo)二抗，37 ℃孵育30 min，洗滌5 次；加入顯色液避光作用15 min，隨即加入終止液，并于酶標(biāo)儀以450 nm 波長進(jìn)行讀數(shù)（OD450）。以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度及OD450繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)合樣品稀釋倍數(shù)計算樣品質(zhì)量濃度。以相同方法測定小鼠血清中IL-4和IFN-γ濃度。

1.4.3 病毒中和試驗 采用二免后14 d 小鼠血清進(jìn)行病毒中和試驗。將加熱滅活后的血清1∶10 稀釋后，每孔按50μL 在96 孔板上作連續(xù)2 倍倍比稀釋（1∶4、1∶8…1∶512），隨后與200 TCID50PEDV 病毒液1∶1混合，37 ℃孵育1 h；將血清-病毒混合液加入提前接種Vero 細(xì)胞的96 孔板中，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育3～5 d，顯微鏡下觀察記錄細(xì)胞病變孔數(shù)，中和抗體效價以完全抑制病毒感染的血清稀釋倍數(shù)的倒數(shù)表示。

1.4.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測 采集各組小鼠100 μL 抗凝血進(jìn)行T 細(xì)胞亞類檢測，室溫下每管加入熒光標(biāo)記 抗 體：2 μL APC antimouse CD3e、1 μL FITC antimouse CD4 和1 μL PE antimouse CD8a，避光孵育25 min；每管加入紅細(xì)胞裂解液室溫孵育15 min，每隔4 min 顛倒混勻，2 000 r/min 離心3 min；每管加入300μL PBS重懸細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.4.5 脾細(xì)胞增殖試驗 三免后10 d，各組隨機(jī)選取2只小鼠進(jìn)行淋巴細(xì)胞增殖試驗。無菌摘取小鼠脾臟，利用注射器膠塞和尼龍篩網(wǎng)輕柔研磨收集脾臟單細(xì)胞，加入紅細(xì)胞裂解液作用15 min，2 000 r/min離心3 min，將分離出的淋巴細(xì)胞以每孔5×105個鋪設(shè)96孔板，每孔含100μL 1640培養(yǎng)基，37 ℃預(yù)培養(yǎng)16 h，再分別加入2μg/孔和5μg/孔的S1 蛋白，37 ℃孵育48 h，分別設(shè)立LPS 和1640 培養(yǎng)液為陽性和陰性對照，每孔加入10 μL CCK-8 試劑，37 ℃孵育1～4 h，于酶標(biāo)儀以450 nm 波長進(jìn)行讀數(shù)，參考文獻(xiàn)中方法計算淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組PEDV S1蛋白的表達(dá)

經(jīng)過4～5 輪25 μg/mL 殺稻瘟菌素S 篩選，得到穩(wěn)定分泌表達(dá)PEDV S1蛋白的S2細(xì)胞系，然后加入0.75 mmol/L 硫酸銅誘導(dǎo)5 d，離心取上清，對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Western blot鑒定。結(jié)果顯示，在100 ku處出現(xiàn)能與PEDV 陽性血清產(chǎn)生特異性反應(yīng)的單一條帶（圖1），與預(yù)期蛋白質(zhì)分子質(zhì)量大小一致，表明重組PEDV S1蛋白成功表達(dá)。

圖1 重組PEDV S1蛋白的Western blot 鑒定Fig.1 Identification of recombinant S1 protein by Western blot

2.2 重組PEDV S1蛋白的純化

從圖2 可以看出，重組PEDV S1 蛋白能被50～500 mmol/L 咪唑洗脫下來，但雜蛋白較多。收集洗脫液通過超濾管離心，再經(jīng)凝膠過濾層析柱純化后，SDS-PAGE分析顯示，重組PEDV S1蛋白的洗脫體積在12.2 mL處（圖3A），雜蛋白得到有效去除，得到純度較高的PEDV S1重組蛋白（圖3B）。

圖2 重組PEDV S1蛋白的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of recombinant S1 protein

圖3 重組S1蛋白的分子篩色譜（A）和SDS-PAGE分析結(jié)果（B）Fig.3 Resuluts of size-exclusion chromatography（A）and SDS-PAGE analyses（B）of recombinant protein S1

2.3 重組PEDV S1蛋白的免疫原性檢測結(jié)果

2.3.1 特異性抗體水平 從圖4 可以看出，與陰性對照相比，重組PEDV S1 蛋白能引起機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，IgG 抗體水平首免后不斷上升。高劑量免疫組IgG 抗體水平在28 d顯著高于滅活病毒免疫組（P＜0.05），在35 d 與滅活病毒免疫組相比差異極顯著（P＜0.01）。

圖4 重組PEDV S1蛋白免疫血清IgG特異性抗體水平檢測結(jié)果Fig.4 Detection results of IgG-specific antibody in recombinant PEDV S1 protein immune serum

2.3.2 中和抗體效價 檢測二免后14 d 各組小鼠血清，高、低劑量S1 蛋白免疫組和滅活病毒免疫組中和抗體效價分別為1∶320、1∶160 和1∶320，均高于陰性對照組（1∶40），表明純化后的重組PEDV S1蛋白具有良好的免疫原性，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗PEDV中和抗體。

2.3.3 細(xì)胞因子水平 采用雙抗夾心ELISA 方法檢測免疫后小鼠血清中IL-4 和IFN-γ 水平的變化，結(jié)果如圖5、圖6 所示，與陰性對照相比，重組PEDV S1 蛋白免疫組的IL-4 和IFN-γ 水平持續(xù)上升。首免后56 d，與滅活病毒免疫組相比，高劑量S1 蛋白免疫組IL-4 水平差異極顯著（P＜0.01）；首免后42 d，高劑量S1 蛋白免疫組的IFN-γ 水平差異極顯著（P＜0.01）。

圖5 重組PEDV S1蛋白免疫血清IL-4水平檢測結(jié)果Fig.5 Detection results of IL-4 level in recombinant PEDV S1 protein immune serum

圖6 重組PEDV S1蛋白免疫血清IFN-γ水平檢測結(jié)果Fig.6 Detection results of IFN-γ level in recombinant PEDV S1 protein immune serum

2.3.4 脾淋巴細(xì)胞刺激指數(shù) 從圖7 可以看出，2μg/孔的重組PEDV S1 蛋白刺激后，高劑量免疫組刺激指數(shù)與PBS 免疫組、滅活病毒免疫組相比差異性極顯著（P＜0.01）；5μg/孔的重組PEDV S1 蛋白刺激后，高劑量免疫組與PBS 免疫組、滅活病毒免疫組相比差異顯著（P＜0.05）。

圖7 重組PEDV S1蛋白免疫小鼠淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)測定結(jié)果Fig.7 Detection results of lymphocyte proliferation index of mice immunized with recombinant PEDVS1 protein

2.3.5 外周血中CD3+T 細(xì)胞、CD4+/CD8+T 細(xì)胞比例 由表1 可知，重組PEDV S1 蛋白免疫組CD3+細(xì)胞百分比高于滅活病毒免疫組和PBS免疫組，CD4+/CD8+比值均高于對照組。

表1 小鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群變化檢測結(jié)果Tab.1 Detection results of changes in T lymphocyte subsets in peripheral blood of mice

3 結(jié)論與討論

豬流行性腹瀉是一種傳染性腸道疾病，可感染各年齡段的豬，主要依賴接種疫苗進(jìn)行防控[19]。2006 年以來，PEDV 新流行毒株出現(xiàn)，CV777 株傳統(tǒng)弱毒疫苗保護(hù)率降低，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失。PEDV S 蛋白是病毒表面纖突糖蛋白，參與病毒與宿主細(xì)胞表面受體結(jié)合，其中S1蛋白是誘發(fā)中和抗體的主要抗原和PEDV 亞單位疫苗研究的重要靶點[20-21]。果蠅胚胎S2細(xì)胞系來源于黑腹果蠅胚胎晚期的原代細(xì)胞培養(yǎng)物，能夠在沒有CO2的情況下以松散的半黏附和懸浮形式生長，該表達(dá)系統(tǒng)結(jié)合了哺乳動物細(xì)胞和桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點，能夠?qū)ν庠吹鞍走M(jìn)行高效折疊，形成二硫鍵和糖基化修飾，使重組蛋白結(jié)構(gòu)與功能更接近其天然狀態(tài)[22]。同時，該細(xì)胞培養(yǎng)過程中無須使用血清，成本低，工藝簡單，更利于工業(yè)化生產(chǎn)。

本研究利用果蠅胚胎S2 細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)重組表達(dá)了PEDV S1 蛋白，純化后抗原純度可達(dá)80%以上，能夠與PEDV 陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。重組PEDV S1 蛋白以分泌表達(dá)形式存在于細(xì)胞培養(yǎng)上清中，利于分離純化。重組PEDV S1 蛋白與佐劑混合后免疫昆明鼠，可誘導(dǎo)產(chǎn)生高效價的PEDV 特異性IgG。黃春娟[23]利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)串聯(lián)表達(dá)的PEDV S 蛋白核心表位和大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素（Heat-labile enterotoxin B，LTB）免疫小鼠，產(chǎn)生的PEDV 特異性血清IgG 抗體顯著高于滅活苗陽性對照。與黃春娟[23]的研究結(jié)果相比，本研究利用果蠅胚胎S2細(xì)胞表達(dá)的重組PEDV S1蛋白免疫小鼠，抗原使用量和注射劑量更少，且免疫效果更優(yōu)。本研究中重組PEDV S1 蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生高效價的中和性抗體，60 μg 劑量免疫組小鼠的血清中和效價可達(dá)1∶320，遠(yuǎn)高于王加圓[24]研究中的中和效價（僅為1∶8）。提示本研究利用果蠅胚胎S2 細(xì)胞表達(dá)的重組S1蛋白能夠更好地誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答。

細(xì)胞因子檢測結(jié)果顯示，重組PEDV S1 蛋白免疫可刺激小鼠產(chǎn)生高水平IL-4 和IFN-γ，與聶民財?shù)萚25]的研究結(jié)果一致，表明重組PEDV S1 蛋白免疫可同時刺激體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。由于細(xì)胞因子試劑盒檢測靈敏度較高，多次眼眶采血造成小鼠應(yīng)激等因素，陰性對照組小鼠OD450檢測值偏高，但與重組S1 蛋白免疫組和疫苗免疫組相比仍差異顯著。重組S1 蛋白能夠有效刺激小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分裂增殖，免疫組小鼠CD3+T 細(xì)胞百分比和CD4+/CD8+細(xì)胞比值均得到提升，提示機(jī)體特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答被激活。史翠萍等[26]制備了展示PEDV S1 蛋白的重組桿狀病毒活載體疫苗，免疫小鼠可誘導(dǎo)產(chǎn)生抗PEDV 特異性抗體和中和抗體，同時能夠誘導(dǎo)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答，與本研究結(jié)果一致。重組PEDV S1 蛋白作為抗原制備疫苗，能夠有效激活宿主的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，避免了弱毒疫苗存在的生物安全風(fēng)險，是PEDV亞單位疫苗研究的一個重要方向。

綜上，采用果蠅S2細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)成功分泌表達(dá)了PEDV S1 蛋白，以重組表達(dá)的S1 蛋白免疫昆明鼠，在小鼠血清中檢測到高效價的PEDV 特異性抗體和中和性抗體，同時有效刺激了細(xì)胞免疫應(yīng)答，這為PEDV S1 蛋白的功能研究和亞單位疫苗的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。