陳炳蔚，李勇，王蓉，丁萬隆

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京100193

灰葡萄孢Botrytis cinereaPers 為核盤菌科（Sclerotiniaceae）葡萄孢盤菌屬（Botrytis）病原真菌，其適應(yīng)性強(qiáng)、寄主范圍廣，能侵染草莓、葡萄、番茄等1000 余種植物[1-2]，引起猝倒、爛葉、爛果、花腐等癥狀。1984 年，由灰葡萄孢引起的人參灰霉病在我國渾北河口參場被首次發(fā)現(xiàn)。此后，我國及韓國人參主產(chǎn)區(qū)相繼發(fā)現(xiàn)人參灰霉病[3-5]。近年，灰霉病在我國人參主產(chǎn)區(qū)流行成災(zāi)，造成人參莖葉腐爛及果實(shí)脫落，對整個人參產(chǎn)業(yè)影響較大[6]。

目前，灰霉病主要依賴化學(xué)防治，常用殺菌劑包括苯并咪唑類、二甲酰亞胺類、苯氨基嘧啶類等[7]。由于長期頻繁使用，灰霉病菌已對上述殺菌劑產(chǎn)生了不同程度的抗藥性[8-10]。迄今，人參灰霉病菌抗藥性研究鮮有報道。Kim 等[11]發(fā)現(xiàn)韓國人參灰霉病對多菌靈的抗性頻率高達(dá)96.6%；Lu等[12]研究發(fā)現(xiàn)，吉林撫松人參灰霉病菌對多菌靈、嘧霉胺和異菌脲的抗性頻率分別達(dá)到81.6%、46.1%和31.6%。

近年來，我國人參主產(chǎn)區(qū)灰霉病呈現(xiàn)高發(fā)成災(zāi)態(tài)勢。然而，由于缺乏對我國人參主產(chǎn)區(qū)灰霉病菌抗藥性的整體了解，人參灰霉病防治存在較大的盲目性。大量“無效”化學(xué)農(nóng)藥的使用不僅無助于灰霉病防治，還會造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，加劇人參農(nóng)藥殘留。為此，在課題組前期完成我國人參主產(chǎn)區(qū)灰霉病菌采集及分離基礎(chǔ)上，本研究對上述灰霉病菌開展室內(nèi)抗藥性實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步明確我國人參灰霉病菌整體抗藥性水平、抗藥性菌株組成及地域分布特征，為制定科學(xué)高效的人參灰霉病害防控策略、有效減輕人參產(chǎn)區(qū)生態(tài)環(huán)境污染及人參農(nóng)藥殘留、遏制高抗藥性灰霉菌株產(chǎn)生風(fēng)險提供重要參考。

1 材料

1.1 菌株

供試102 株人參灰霉病菌于2018 年從人參主產(chǎn)區(qū)的人參灰霉病葉上分離獲得。其中，黑龍江、吉林和遼寧人參灰霉病菌分別為36、45、21株[13]。

1.2 儀器

SPX-15C 型生化培養(yǎng)箱（中儀國科科技有限公司）；BSC-1100ⅡA2 型生物安全柜（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）；ME204 型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；LX-B35L 型蒸汽滅菌鍋（合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司）。

1.3 試藥

多菌靈（批號：RNA391，純度≥98%）、異菌脲（批號：ATZ378，純度：96%）、嘧霉胺（批號：AZSZ794，純度：98%）均購于上海畢得醫(yī)藥科技有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar medium，PDA）培養(yǎng)基（批號：20200310，北京奧博星生物技術(shù)有限公司）；七水硫酸鎂（批號：1907061，純度≥99%）、磷酸氫二鉀（批號：1905061，純度≥99%）、氯化鉀（批號：1908061，分析純）、七水硫酸亞鐵（批號：1903061，純度≥99%）均購于西隴科學(xué)股份有限公司；L-天冬酰胺（L-asparagine agar medium，ASP，批號：20190325，純度≥99%）、葡萄糖（批號：20200828，純度≥99.5%）、瓊脂粉（批號：20200604）均購于北京百瑞極生物科技有限公司；丙酮（批號：20200708）、鹽酸（批號：20200614）均購于北京市通廣精細(xì)化工公司；水為蒸餾水。

2 方法

2.1 殺菌劑母液制備

取多菌靈2.5 g，逐滴加入10 mol·L-1鹽酸，全部溶解后置50 mL 量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，配制成50 mg·mL-1的多菌靈母液。取異菌脲1.5 g置50 mL 量瓶中，加丙酮定容至刻度，搖勻溶解后配制成30 mg·mL-1的異菌脲母液。取嘧霉胺1.5 g置50 mL 量瓶中，加丙酮定容至刻度，搖勻溶解后配制成30 mg·mL-1的嘧霉胺母液。

2.2 含藥培養(yǎng)基制備

取PDA 培養(yǎng)基干粉37 g，加蒸餾水定容至1000 mL，高溫滅菌，作為PDA 培養(yǎng)基備用。

取七水硫酸鎂1 g、磷酸氫二鉀1 g、氯化鉀0.5 g、七水硫酸亞鐵0.01 g、ASP 2 g、葡萄糖22 g、瓊脂粉15 g，加蒸餾水定容至1000 mL，高溫滅菌，作為ASP 培養(yǎng)基備用。

參考文獻(xiàn)[14-16]方法，將母液按比例加入培養(yǎng)基中制成含藥平板。平板中殺菌劑質(zhì)量濃度根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果調(diào)整（表1）。

表1 培養(yǎng)基及殺菌劑質(zhì)量濃度

2.3 殺菌劑對灰霉病菌的半數(shù)有效濃度（median effective concentration，EC50）檢測及抗藥性水平評價

采用菌絲生長速率法測定人參灰霉病菌對3 種化學(xué)殺菌劑的敏感性。在生物安全柜中從預(yù)先培養(yǎng)好的灰霉菌菌落上取直徑5 mm菌餅，接種于含藥平板中央，以不含殺菌劑的平板作為空白對照。每個處理3 次重復(fù)。接種好的平板置于生化培養(yǎng)箱中25 ℃黑暗培養(yǎng)3 d 后測量菌落直徑，按公式（1）計(jì)算菌絲生長抑制率。

將生長抑制率轉(zhuǎn)換成幾率值（Y）、藥劑質(zhì)量濃度轉(zhuǎn)換成以10 為底的對數(shù)值（X），求毒力回歸方程Y=aX+b 和r，計(jì)算出殺菌劑對供試菌株菌絲生長的EC50[14]。人參灰霉菌對多菌靈、異菌脲和嘧霉胺的抗性水平按參考文獻(xiàn)[15,17-18]，并適當(dāng)調(diào)整（表2）。

表2 人參灰霉病菌抗性鑒別標(biāo)準(zhǔn)μg·mL-1

2.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)DPS 9.01 用于殺菌劑對人參灰霉病菌菌絲生長的抑制率分析；SPSS 20.0用于判斷不同地區(qū)間EC50的差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 人參灰霉病菌對多菌靈的抗性水平

由表3可知，供試102株人參灰霉病菌均對多菌靈表現(xiàn)高抗藥性（EC50＞640 μg·mL-1），不同產(chǎn)區(qū)人參灰霉病菌對多菌靈的抗藥性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。多菌靈在640 μg·mL-1時對人參灰霉病菌的抑制率為0～41.86%，平均抑制率為14.99%。遼寧本溪人參灰霉病菌對多菌靈最敏感，抑制率為41.86%；黑河、靖宇、通化人參灰霉病菌在該質(zhì)量濃度含藥平板上生長正常，與空白對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 多菌靈對人參灰霉病菌生長的抑制情況

3.2 灰霉病菌對異菌脲的抗性水平

根據(jù)異菌脲抗性將供試人參灰霉病分為敏感、低抗、中抗3個等級（表4）。異菌脲對人參灰霉病菌EC50為0.16～5.43 μg·mL-1，均值為（2.37±0.11）μg·mL-1。其中，敏感菌株24 株（23.53%）、低抗菌株16 株（15.69%）、中抗菌株62 株（60.78 %）。黑龍江、吉林、遼寧敏感菌株分別占33.33%、20%、14.29%，EC50均值分別為（2.12±0.18）、（2.42±0.17）、（2.71±0.25）μg·mL-1。黑龍江遜克人參灰霉病菌對異菌脲的抗藥性最強(qiáng)，與其他人參產(chǎn)區(qū)灰霉病菌對異菌脲抗性的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表4 人參灰霉病菌對異菌脲的抗性情況

3.3 人參灰霉病菌對嘧霉胺的抗性水平

根據(jù)嘧霉胺抗性將供試人參灰霉病菌分為敏感、中抗、高抗3 個等級（表5）。嘧霉胺對人參灰霉病菌的EC50為0.04～78.30 μg·mL-1，均值為（18.42±1.94）μg·mL-1。其中，高抗菌株71株（69.61%）、敏感菌株28 株（27.45%），中抗菌株3 株（2.94%）。嘧霉胺對黑龍江、吉林、遼寧人參灰霉病菌的EC50均值分別為（11.34±2.49）、（23.96±3.28）、（18.69±3.96）μg·mL-1，敏感菌株分別占58.33%、6.67%、19.05%。黑龍江伊春人參灰霉病菌對嘧霉胺最敏感；吉林靖宇人參灰霉病菌對嘧霉胺抗性最強(qiáng)。

表5 人參灰霉病菌對嘧霉胺的抗藥性

4 討論

灰霉病菌具有繁殖快、遺傳變異大、適合度高等特點(diǎn)，極易對殺菌劑產(chǎn)生抗藥性[19]。自20 世紀(jì)70 年代，苯并咪唑類、二甲亞酰胺類、苯氨基嘧啶類等殺菌劑先后引入我國，用于灰霉病防治。但是，不同農(nóng)作物上的灰霉菌很快對上述殺菌劑產(chǎn)生了抗藥性，導(dǎo)致病害田間防效下降甚至完全喪失[18]。

多菌靈、苯菌靈等苯并咪唑類化合物是最早用于灰霉病防治的一類內(nèi)吸性化學(xué)殺菌劑。目前，國內(nèi)外多種農(nóng)作物上的灰霉病菌已對該類殺菌劑產(chǎn)生了較強(qiáng)的抗藥性[7]。本研究檢測發(fā)現(xiàn)，課題組2018 年從我國人參主產(chǎn)區(qū)分離的102 株人參灰霉病菌均對多菌靈表現(xiàn)極強(qiáng)的抗藥性，說明多菌靈在人參灰霉病防治上已經(jīng)失去應(yīng)用價值，建議在人參生產(chǎn)上停止使用多菌靈防治灰霉病。

二甲酰亞胺類殺菌劑是20 世紀(jì)70 年代繼苯并咪唑類殺菌劑之后開發(fā)的一類廣譜殺菌劑，包括異菌脲、腐霉利等。目前生產(chǎn)上也已出現(xiàn)異菌脲、腐霉利抗性灰霉菌株[20]。研究發(fā)現(xiàn)，農(nóng)作物灰霉病菌對異菌脲的抗性頻率呈逐年升高的趨勢[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，我國人參主產(chǎn)區(qū)灰霉病菌未產(chǎn)生異菌脲高抗菌株，而中低水平抗性菌株的EC50也較低，說明異菌脲田間抗性風(fēng)險較低。因此，在人參灰霉病防治上，應(yīng)結(jié)合當(dāng)?shù)鼗颐咕昕顾幮运街贫茖W(xué)合理的防控方案。在異菌脲抗性水平相對較高的地區(qū)（如遜克、長白、集安、本溪等地），建議限制異菌脲的使用；而在其他異菌脲相對敏感的人參產(chǎn)區(qū)，該殺菌劑可以繼續(xù)使用，但應(yīng)加強(qiáng)灰霉病菌對異菌脲的抗藥性監(jiān)測。

苯氨基嘧啶類化合物是20 世紀(jì)90 年代研發(fā)的專門用于灰霉病防治的化學(xué)殺菌劑，嘧霉胺、嘧菌胺和嘧菌環(huán)胺等屬于該類產(chǎn)品。近年研究發(fā)現(xiàn)，我國灰霉病菌對嘧霉胺的抗藥性愈來愈強(qiáng)[18,21]。本研究發(fā)現(xiàn)，供試102 株人參灰霉病菌中嘧霉胺抗性菌株約占70%，且絕大部分為高抗菌株，這與國內(nèi)同類報道結(jié)果基本一致[10]。此外，不同省份人參灰霉病菌對嘧霉胺的抗藥性存在很大差異。吉林人參產(chǎn)區(qū)嘧霉胺高抗菌株已成為人參灰霉病菌中的優(yōu)勢種群，建議吉林省停止將嘧霉胺用于人參灰霉病防治；而黑龍江伊春、遼寧丹東等人參主產(chǎn)區(qū)仍以嘧霉胺敏感菌株為主，建議將嘧霉胺與其他灰霉病殺菌劑混合使用，同時密切關(guān)注嘧霉胺抗性菌株動態(tài)變化，以延緩嘧霉胺高抗藥性菌株的產(chǎn)生。