陳冉，張艷欣，王丹丹

上海上藥杏靈科技藥業(yè)股份有限公司，上海 201203

銀杏Ginkgo bilobaL.是一種藥食同源的植物，其葉片可以產(chǎn)生黃酮、內(nèi)酯等次生代謝物，這些化合物具有增加腦血流量、降低腦血管阻力、改善腦血管循環(huán)功能、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、增加冠狀動(dòng)脈血流量、改善心臟供血、防止心絞痛及心肌梗死形成的功能[1]。生長(zhǎng)環(huán)境及土壤營(yíng)養(yǎng)通常被認(rèn)為是影響藥材質(zhì)量的主要因素，近年來(lái)，人們逐漸認(rèn)識(shí)到內(nèi)生菌對(duì)于植物藥用成分的合成與積累起著非常重要的作用[2]。研究人員發(fā)現(xiàn)，與植物共生的某些內(nèi)生菌可促進(jìn)宿主植物次生代謝產(chǎn)物的合成與積累，甚至產(chǎn)生與宿主相同或相似的活性次生代謝產(chǎn)物[3]，也通過(guò)培養(yǎng)篩選出能產(chǎn)生活性次生代謝物的內(nèi)生菌[4]。然而，在自然界中，大部分內(nèi)生菌都是不可培養(yǎng)的，難以從植物組織中分離。因此，植物體內(nèi)生菌與植物次生代謝物之間相關(guān)性尚不明確。本研究運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)和超高效液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜法（UPLC-Q-TOF/MS）檢測(cè)，分別對(duì)都江堰、平邑、崇明3個(gè)產(chǎn)地的銀杏葉內(nèi)生細(xì)菌和真菌進(jìn)行多樣性分析，比較不同產(chǎn)地銀杏葉片內(nèi)生菌群落多樣性及群落結(jié)構(gòu)，分析銀杏葉內(nèi)生菌多樣性與其主要化學(xué)成分含量的相關(guān)性，通過(guò)生物信息學(xué)分析技術(shù)預(yù)測(cè)化學(xué)成分與菌群之間的互作關(guān)系，從而指導(dǎo)可協(xié)作產(chǎn)生藥用成分菌株的篩選，利用內(nèi)生菌促進(jìn)藥用成分的代謝累積，可為異源獲得銀杏藥效成分提供參考。

1 材料

1.1 試藥

選取四川省都江堰市（DY）、上海市崇明島（CY）、山東省平邑縣（PY）3 個(gè)銀杏生產(chǎn)基地作為采樣區(qū)。銀杏樹(shù)于4月初開(kāi)始萌發(fā)初芽，直至7月開(kāi)始采收，本研究所有樣品均采于2019年4—7月的每月中旬，為較完整的銀杏生長(zhǎng)-采收期，采樣地點(diǎn)均選取遠(yuǎn)離道路的種植區(qū)，以避免汽車尾氣等其他生產(chǎn)生活因素對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。采集樣品時(shí)，每個(gè)產(chǎn)地隨機(jī)選取3～4個(gè)5 m×5 m的樣方作為采樣點(diǎn)（A、B、C、D），每個(gè)樣方內(nèi)按5 點(diǎn)取樣法采集銀杏葉片，將5點(diǎn)的葉片樣品充分混合形成1個(gè)樣品，裝入無(wú)菌的自封袋中，做好標(biāo)記，儲(chǔ)存于干冰/冰袋中帶回實(shí)驗(yàn)室，并保存于-80 ℃冰箱用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。樣品采收時(shí)間和編號(hào)見(jiàn)表1。

表1 不同產(chǎn)地銀杏葉藥材來(lái)源信息

對(duì)照品銀杏內(nèi)酯A（批號(hào)：W25A7K13730）、銀杏內(nèi)酯B（批號(hào)：D15D8G50608）、銀杏內(nèi)酯C（批號(hào)：C28S6G3986）、白果內(nèi)酯（批號(hào)：P08J9F52398）、銀杏內(nèi)酯J（批號(hào)：D29J9G53845）、蘆?。ㄅ?hào)：Y16M9S61523）、山柰酚-3-O-蕓香糖苷（批號(hào)：Y15N8H48277）、碟豆素（批號(hào)：M13J10S90494）、槲皮素3-O-葡萄糖基（1→2）鼠李糖苷（批號(hào)：M13J10S90493）、水仙苷（批號(hào)：S08A8D33447）、3-O-（2-O-[6-O-（β-羥基-反-香豆酰）-葡萄糖基]-鼠李糖基）山柰酚（批號(hào)：M13J10S90492）、3-O（2-O-[6-O（β-羥基-反-香豆酰）-葡萄糖基]-鼠李糖基）槲皮素（批號(hào)：M13J10S90491）、銀杏雙黃酮（批號(hào)：GR-133-150405）、金松雙黃酮（批號(hào)：P03M9F55041）、白果雙黃酮（批號(hào)：Y15J9L63710）、銀杏酸（C17∶1）（批號(hào)：Y18J10H73680）、銀杏酸（C13∶0）（批號(hào)：P11D8F50448）、D-（-）奎寧酸（批號(hào)：A06N11L130218）均購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；穗花杉雙黃酮（批號(hào)：10412）、銀杏酸（C15∶1）（批號(hào)：1130）、原兒茶酸（批號(hào)：5668）、莽草酸（批號(hào)：863）均購(gòu)于上海詩(shī)丹徳生物技術(shù)有限公司；所有對(duì)照品純度均≥98%；DNeasy?Plant Mini Kit（50）試劑盒（德國(guó)Qiagen公司）；瓊脂糖（Sigma 公司）；三（羥甲基）氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl）、TAE電泳緩沖液[生工生物工程（上海）股份有限公司]；DNA 凝膠回收試劑盒（美國(guó)Axygen Biosciences 公司）；三氯甲烷、異戊醇、無(wú)水乙醇（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；液氮（上海氯閔氣體有限公司）；超純水；植物內(nèi)生細(xì)菌引物（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）。

1.2 儀器

Waters Xevo G2-XS 型Q-TOF 飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源（ESI）；Waters ACQUITY UPLC型超高效液相色譜儀，含二元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列（DAD）檢測(cè)器、Masslynx 4.1 軟件；Proflex base 型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀、NanoDrop2000 型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)、Sorvall Legend Micro 17R 型離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；Mini-Sub Cell GT 型電泳儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）；QuantiFluor?-ST 型微型熒光計(jì)（美國(guó)Promega 公司）；5200 multi 型凝膠成像儀（上海天能科技有限公司）；KQ5200DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Direct-Q 3UV 型超純水機(jī)（美國(guó)Millipore 公司）；Illumina MiSeq型高通量測(cè)序平臺(tái)（美國(guó)Illumina公司）。

2 方法

2.1 銀杏葉片表面無(wú)菌處理

將銀杏葉表面用雙蒸水（ddH2O2）清洗，用濾紙吸干表面水分。將樣品放入超凈操作臺(tái)中，在培養(yǎng)皿中用75%的乙醇浸泡1～2 min，ddH2O2清洗后放入0.1 mol·L-1的磷酸鹽緩沖液（PBS）中，超聲清洗1 min，渦旋10 s，重復(fù)2 次，最后用無(wú)菌水沖洗2 次，用無(wú)菌濾紙吸干表面水分。

2.2 銀杏葉片內(nèi)生菌基因組提取及測(cè)序

將無(wú)菌處理后的葉片放入研缽，加液氮研磨至粉碎，采用DNeasy?Plant Mini Kit（50）試劑盒提取內(nèi)生菌DNA。使用NanoDrop 2000 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 濃度、純度與完整性。將獲得的DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，引物見(jiàn)表2，該引物通過(guò)巢式PCR 方法，極大降低宿主污染比例。內(nèi)生真菌引物選擇ITS1F_ITS2R。

表2 銀杏葉內(nèi)生菌引物

使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR 產(chǎn)物，利用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化，Tris-HCl 洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測(cè)。利用微型熒光計(jì)進(jìn)行檢測(cè)定量。根據(jù)Illumina MiSeq高通量測(cè)序平臺(tái)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建PE 2×300 的文庫(kù)。使用Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，R 3.3.1軟件作圖。

2.3 銀杏葉主要化學(xué)成分檢測(cè)

2.3.1 供試品溶液制備 將葉片洗干凈后，60 ℃烘干，研磨過(guò)篩后干燥，儲(chǔ)存?zhèn)溆?。銀杏葉雙黃酮和烷基酚類成分檢測(cè)樣品處理如下：稱取銀杏葉中粉粉末約0.1 g，用乙醇5 mL 超聲提取10 min，3000 r·min-1（離心半徑為16 cm）離心10 min，吸取上清液，重復(fù)超聲提取3 次，合并上清液，加入10.189 μg·mL-1格列本脲內(nèi)標(biāo)乙醇中間液500 μL 并定容至25 mL 量瓶中。其他成分檢測(cè)樣品處理如下：稱取銀杏葉中粉粉末0.1 g，用50%甲醇5 mL 超聲提取10 min，3000 r·min-1（離心半徑為16 cm）離心10 min，吸取上清液，重復(fù)超聲提取3次，合并上清液，加入內(nèi)標(biāo)50%甲醇中間液（10.189 μg·mL-1）500 μL 并定容至25 mL量瓶中。

2.3.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取干燥至恒重的編號(hào)為1～22的對(duì)照品（表3），加入50%甲醇制成質(zhì)量濃度分別為9.89、14.46、9.28、4.71、21.19、8.91、5.89、6.21、5.91、6.85、15.90、16.34、9.84、4.07、8.04、9.51、179.68、90.97、16.11、41.10、2.02、97.50 μg·mL-1的儲(chǔ)備液，逐級(jí)稀釋得不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液。

2.3.3 色譜條件 色譜柱Waters ACQUITY UPLC C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相為含0.05%甲酸的甲醇溶液（A）-0.05%甲酸水溶液（B）；梯度洗脫（0～1 min，98%A；1.0～13.5 min，98%～2%A；13.5～16.5 min，2%A；16.5～20.0 min，2%～98%A）；檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm；流速為0.4 mL·min-1；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣量為5 μL。

2.3.4 質(zhì)譜條件 負(fù)離子條件下，采用Sensitivity模式，掃描時(shí)間為20 min；毛細(xì)管電壓為2.5 kV；離子源溫度為120 ℃；脫溶劑氣流速為800 L·h-1；脫溶劑氣溫度為400 ℃；樣品錐孔電壓為35 V；萃取錐孔電壓為4.0 V。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 精密吸取不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣2 次，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）、峰面積為縱坐標(biāo)（Y），得到不同對(duì)照品線性方程，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 銀杏葉成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍

2.4.2 精密度試驗(yàn) 取山東省平邑縣PY4A樣品，按2.3.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.3.3項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算各成分色譜峰出峰時(shí)間和峰面積的RSD，結(jié)果均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取山東省平邑縣PY4A 樣品，按2.3.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.3.3項(xiàng)下色譜條件分別在0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣，計(jì)算各個(gè)成分色譜峰出峰時(shí)間和峰面積的RSD，結(jié)果均小于3%，表明該方法在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取山東省平邑縣PY4A 樣品，按2.3.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.3.3項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算各成分含量的RSD，結(jié)果均小于3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 分別精密稱取已測(cè)含量的銀杏樣品粉末0.05 g，共6 份，分別按含量的50%、100%和150%量加入對(duì)應(yīng)量的22 個(gè)對(duì)照品，按2.3.1 項(xiàng)下供試品制備方法制備，每個(gè)加入量平行制備2 份供試品溶液。計(jì)算得到22 個(gè)化合物的回收率為90%～105%，RSD均小于3%。

2.4.6 樣品測(cè)定 取2.3.1項(xiàng)下供試品溶液1.0 mL，12 000 r·min-1（離心半徑為7 cm）離心10 min，吸取上清液進(jìn)樣分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同產(chǎn)地銀杏葉內(nèi)生細(xì)菌、真菌群落多樣性分析

選擇97%相似度的分類單元（OTU），利用mothur 計(jì)算不同隨機(jī)抽樣下的α多樣性指數(shù)，利用R 語(yǔ)言工具制作曲線圖。Shannon曲線趨向平坦，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量足夠大，可以反映樣本中絕大多數(shù)的微生物多樣性信息，該測(cè)序結(jié)果中包含了大多數(shù)微生物類群，能夠真實(shí)地反映3 個(gè)產(chǎn)區(qū)葉片樣品中微生物的群落組成，見(jiàn)圖1。

圖1 3個(gè)產(chǎn)地不同月份銀杏葉內(nèi)生真菌、細(xì)菌的稀釋性曲線

Chao 指數(shù)反映群落豐富度，Shannon 指數(shù)反映群落多樣性，結(jié)合2個(gè)指數(shù)分析，由圖2可知，平邑地區(qū)銀杏葉片內(nèi)生真菌的多樣性最低，都江堰相對(duì)較高；內(nèi)生真菌的豐富度也是平邑最小，都江堰相對(duì)較大；3 個(gè)產(chǎn)地內(nèi)生真菌多樣性、豐富度隨月份變化無(wú)明顯規(guī)律。

圖2 3個(gè)產(chǎn)地不同月份銀杏葉內(nèi)生真菌α多樣性指數(shù)

由圖3 可知，3 個(gè)產(chǎn)地的銀杏葉內(nèi)生細(xì)菌在多樣性上4、5 月份變化不大，而在采收季7 月份都江堰和崇明的多樣性最低，多樣性隨著月份的變化整體呈降低趨勢(shì)；在內(nèi)生細(xì)菌豐富度上，3 產(chǎn)地銀杏葉都在6月份的時(shí)候呈最高；3個(gè)產(chǎn)地銀杏葉內(nèi)生細(xì)菌多樣性和豐富度隨月份的變化趨勢(shì)較一致。

圖3 3個(gè)產(chǎn)地不同月份銀杏葉內(nèi)生細(xì)菌α多樣性指數(shù)

在門水平上，3產(chǎn)地銀杏葉內(nèi)生優(yōu)勢(shì)真菌菌群為子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota），隨著月份的變化群落結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定；在屬水平上對(duì)優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌菌屬（將比例＜5%的菌屬合并為others）進(jìn)行分析，結(jié)果表明，崇明和平邑的優(yōu)勢(shì)真菌屬為鏈格孢屬（Alternaria），但都江堰的優(yōu)勢(shì)真菌屬為烏氏霉屬（Uwebraunia）；而平邑在7 月采收季出現(xiàn)了大量的Septoria。3 產(chǎn)地的銀杏葉片內(nèi)生真菌在門水平上的群落結(jié)構(gòu)非常一致，而在屬水平的真菌群落結(jié)構(gòu)在組成比例上有明顯差異（圖4）。

在門水平上，3 產(chǎn)地銀杏葉優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌菌群為變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）；3個(gè)產(chǎn)地銀杏葉在7月采收季都是變形菌門的量達(dá)到最多，而厚壁菌門量均降低；在屬水平上對(duì)優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌菌屬（將比例＜5%的菌屬合并為others）進(jìn)行分析，結(jié)果表明，甲基桿菌屬（Methylobacterium）、鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas）在初芽期極少，但是在采收季占比最大；3 產(chǎn)地樣品在門、屬水平的內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)具有一定相似性（圖5）。

圖5 3個(gè)產(chǎn)地不同月份銀杏葉內(nèi)生細(xì)菌群落豐度占比

3.2 不同產(chǎn)地的銀杏葉主要化學(xué)成分含量

采用UPLC-Q-TOF/MS 模式分析銀杏葉提取物，總離子流圖見(jiàn)圖6。利用UNIFI質(zhì)譜軟件，基于保留時(shí)間、精確相對(duì)分子質(zhì)量和二級(jí)碎片離子信息對(duì)色譜峰進(jìn)行指認(rèn)，并通過(guò)對(duì)照品的比對(duì)，確定了22 個(gè)主要化學(xué)成分（圖7）。

圖6 銀杏葉主要成分總離子流圖

圖7 銀杏葉中22種主要化學(xué)成分總離子流圖

基于UPLC-Q-TOF/MS 技術(shù)，以內(nèi)標(biāo)法（格列本脲為內(nèi)標(biāo)）對(duì)銀杏葉中22 個(gè)化合物進(jìn)行含量測(cè)定，建立了22 個(gè)化合物的含量測(cè)定方法。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到3 個(gè)產(chǎn)地不同月份銀杏葉中主要化學(xué)成分含量，并將22 個(gè)成分歸類為萜內(nèi)酯類（銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B、銀杏內(nèi)酯C、白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯J）、黃酮醇苷類{蘆丁、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、碟豆素、槲皮素-3-O-葡萄糖基（1→2）鼠李糖苷、水仙苷、3-O-（2-O-[6-O-（β-羥基-反-香豆酰）-葡萄糖基]-鼠李糖基）山柰酚、3-O-（2-O-[6-O-（β-羥基-反-香豆酰）-葡萄糖基]-鼠李糖基）槲皮素}、有機(jī)酸類[D-（-）奎寧酸、原兒茶酸、莽草酸]、烷基酚類[銀杏酸（C17∶1）、銀杏酸（C15∶1）、銀杏酸（C13∶0）]、雙黃酮類（銀杏雙黃酮、穗花杉雙黃酮、金松雙黃酮、白果雙黃酮）5類（表4）。

表4 3個(gè)產(chǎn)地銀杏葉不同月份的主要化學(xué)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)（n=3）%

3.3 不同產(chǎn)地的銀杏葉主要化學(xué)成分與內(nèi)生菌群落的相關(guān)性分析

通過(guò)計(jì)算銀杏葉主要化學(xué)成分含量與其內(nèi)生菌基因組高通量數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性系數(shù)（Spearman 等級(jí)相關(guān)系數(shù)、Pearson 相關(guān)系數(shù)等），將獲得的數(shù)值矩陣通過(guò)Heatmap 直觀展示。在銀杏葉片內(nèi)生細(xì)菌中，萜內(nèi)酯與其相關(guān)性??；黃酮醇苷與其大多呈正相關(guān)，如假單胞菌（Pseudomonas）、羅姆布茨菌（Romboutsia）、葡萄球菌（Staphylococcus）、unclassified_f_Burkholderiaceae等；有機(jī)酸與其也大多呈正相關(guān)，如短波單胞菌（Brevundimonas）、假單胞菌、紅球菌屬（Rhodococcus）、葡萄球菌；內(nèi)生細(xì)菌與烷基酚和雙黃酮大多呈顯著負(fù)相關(guān)。銀杏葉片中內(nèi)生真菌中，萜內(nèi)酯大部分與內(nèi)生真菌呈顯著負(fù)相關(guān)；黃酮醇苷與內(nèi)生真菌多數(shù)呈負(fù)相關(guān)，但黃酮醇苷與鏈格孢屬（Alternaria）、枝孢屬（Cladosporium）、球腔菌屬（Mycosphaerella）呈顯著正相關(guān)；有機(jī)酸與其多數(shù)呈正相關(guān)，尤其與鏈格孢屬、球腔菌屬、擲孢酵母屬（Sporobolomyces）、匍柄霉屬（Stemphylium）呈顯著正相關(guān)；烷基酚與內(nèi)生真菌相關(guān)性較小；雙黃酮與擔(dān)孢酵母屬（Erythrobasidium）、烏氏霉屬（Uwebraunia）呈顯著正相關(guān)（圖8）。

圖8 3個(gè)產(chǎn)地銀杏葉內(nèi)生菌與其主要化學(xué)成分的相關(guān)性

4 討論

內(nèi)生菌在植物體內(nèi)特殊的生態(tài)環(huán)境中與宿主植物長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化，產(chǎn)生或者參與合成同植物次生代謝物相似的次級(jí)代謝產(chǎn)物[5-7]。因此藥用植物內(nèi)生菌也是影響中藥材品質(zhì)的重要因素，內(nèi)生菌的組成受多種因素的影響，如取樣部位不同[8]、生長(zhǎng)階段[9]及地域差異[10]等環(huán)境因素。在本研究中，隨著月份的變化，3 產(chǎn)地的銀杏葉內(nèi)生菌多樣性和豐富度都有明顯的波動(dòng)變化，表明了季節(jié)是影響銀杏葉內(nèi)生菌多樣性和豐富度的因素之一。已有文獻(xiàn)報(bào)道從銀杏中分離的內(nèi)生細(xì)菌主要有枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），具有抑制病原菌侵染的作用[11-12]，在本研究結(jié)果中也發(fā)現(xiàn)了類似的厚壁菌門（Firmicutes）下芽孢桿菌群落，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了甲基桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬等為優(yōu)勢(shì)菌。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)產(chǎn)內(nèi)酯類成分的內(nèi)生真菌有毛霉屬（Mucor）、鐮孢菌屬（Fusarium）；分離出產(chǎn)黃酮類化合物的內(nèi)生真菌有卷枝毛霉（Mucor circinelloides）、刺盤孢屬（Colletotrichura）、匐柄霉（Stemphylium botryosum）、交鏈孢屬（Alternaria）、赤霉屬（Gibberella）、蜜孢霉（Sphacelia）和放線菌屬（Actinomyces）[13-14]，本研究豐富了銀杏葉內(nèi)生細(xì)菌和內(nèi)生真菌的種類與資源。

本研究采用UPLC-Q-TOF/MS 建立了快速靈敏測(cè)定銀杏葉中的萜內(nèi)酯類、黃酮醇類、雙黃酮類、有機(jī)酸類、烷基酚等類化合物含量的方法，并對(duì)都江堰、崇明、平邑3 個(gè)不同地區(qū)銀杏葉內(nèi)生真菌、細(xì)菌多樣性與其主要化學(xué)成分進(jìn)行了相關(guān)性分析，期望找到與銀杏葉關(guān)鍵次生代謝產(chǎn)物呈正相關(guān)關(guān)系的內(nèi)生菌[15]。通過(guò)相關(guān)性分析，在銀杏葉片內(nèi)生細(xì)菌中，萜內(nèi)酯與其相關(guān)性小；黃酮醇苷與其大多呈正相關(guān)，如假單胞菌、羅姆布茨菌、葡萄球菌等。銀杏葉片中內(nèi)生真菌中，萜內(nèi)酯大部分與內(nèi)生真菌呈顯著負(fù)相關(guān)；黃酮醇苷與內(nèi)生真菌多數(shù)呈負(fù)相關(guān)，但黃酮醇苷與鏈格孢屬、枝孢屬、球腔菌屬呈顯著正相關(guān)。這為進(jìn)一步探究該類菌對(duì)銀杏葉次生代謝產(chǎn)物影響的機(jī)制提供了研究基礎(chǔ)，為提高銀杏次生代謝產(chǎn)物的含量及質(zhì)量提供了理論依據(jù)。在后續(xù)研究中，將進(jìn)一步對(duì)銀杏葉內(nèi)生菌進(jìn)行培養(yǎng)做相互驗(yàn)證，深入研究?jī)?yōu)勢(shì)菌的功能，為銀杏葉品質(zhì)形成、合理采收提供科學(xué)依據(jù)。