李高天， 王紅青， 彭 彥， 尹湘君， 季旭明， 阮家釗*

(1.杭州市食品藥品檢驗研究院，浙江 杭州 310022；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310053)

利巴韋林是一種嘌呤核苷類似物，能抑制多種核酸病毒引起的疾病，曾廣泛應(yīng)用于治療動物病毒性傳染病，如雞痘、雞傳染性喉氣管炎等[1]。但利巴韋林具有一定的遺傳、生殖毒性和致癌性，禽畜濫用可能會導(dǎo)致藥物殘留，使其通過食物鏈進入人體從而影響人體健康[2-3]。

我國中藥材資源豐富，動物源性藥材使用廣泛[4-5]。人們熟知的中成藥烏雞白鳳丸由烏雞、黃芪等 20 味藥材組成，收載于《中國藥典》[6]；雞內(nèi)金是雞的砂囊內(nèi)壁，其藥用價值可溯源于《神農(nóng)本草經(jīng)》[7]。養(yǎng)殖戶為了提高雞的抵抗力，往往會在養(yǎng)殖過程中濫用利巴韋林，導(dǎo)致雞肉、雞骨、砂囊等各組織中會有利巴韋林及其代謝物的殘留和蓄積[8-9]，給含雞源成分中成藥的質(zhì)量安全帶來較大隱患。

雞肉食品中利巴韋林及其代謝物總殘留檢測目前主要的檢測方法有 ELISA法、HPLC法、HPLC-MS/MS等[10-14]，然而含雞源成分中成藥中利巴韋林及其代謝物總殘留卻未見相關(guān)的檢測依據(jù)。本研究采用親水作用色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HILIC-MS/MS)結(jié)合酶解-QuEChERS凈化法對含雞源成分中成藥中利巴韋林及其代謝物總殘留進行測定。

1 材料

1.1 儀器 AB SCIEX Qtrap 4000超高效液相色譜-串聯(lián)線性離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國AB SCIEX公司，配置島津LC-30AD超高效液相色譜儀)；Mili-Q 去離子水發(fā)生器(美國Millipore 公司)；KQ3200V超聲波發(fā)生器(昆山市超聲儀器有限公司)；SHZ-B 水浴恒溫振蕩儀(上海智誠分析儀器制造有限公司)；MS3 旋渦混合器(德國IKA公司)；SBEQ-CR1012 固相萃取裝置(美國Waters 公司)；4-16K高速離心機(德國Sigma 公司)；N-EVP-111 氮吹濃縮儀(美國Organomation Assicociates 公司)。

1.2 試劑與藥物 利巴韋林對照品(德國Dr.Ehrenstorfer公司，批號G154277，純度99.3%)；13C5利巴韋林內(nèi)標(加拿大Toronto Research Chemicals公司，批號10-MRS-156-1，含量99.4%)；酸性磷酸酶(美國Sigma公司，批號SLBV3717，活性≥0.4 unit/mg)；親水脂平衡(HLB)、陽離子交換(MCX)、苯硼酸基弱陽離子(PBA)固相萃取小柱、15 mL QuEChERS凈化管(含400 mg PSA、400 mg C18、1 200 mg無水硫酸鎂)，購于美國Agilent公司。烏雞白鳳丸(北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠，批號18035367)；復(fù)方雞內(nèi)金片(石藥控股集團河北永豐藥業(yè)有限公司，批號00519040141)。甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純，購于德國Merck公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Waters ACQUITY UPLC BHE HILIC色譜柱 (2.1 mm×100 mm, 1.7 μm)；流動相 5 mmol/L乙酸銨(含0.2%甲酸)(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～2 min，5%A；2～4 min，5%～30%A；4～5 min，30%～60%A；5～5.1 min，60%～5%A；5.1～10 min，5%A)；體積流量0.4 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量5 μL。

2.2 質(zhì)譜條件 正離子電離 (ESI+)；霧化氣壓力379 kPa；氣簾氣壓力172 kPa；噴霧電壓5 500 V；去溶劑氣溫度500 ℃；去溶劑氣壓力345 kPa；碰撞氣壓力69 kPa；多反應(yīng)監(jiān)測 (MRM)模式；碰撞室出口電壓 (CXP)12.5 V；射入電壓 (EP)10 V。其他質(zhì)譜參數(shù)見表1，MRM定量離子圖見圖 1。

表1 質(zhì)譜參數(shù)

圖1 MRM定量離子圖

2.3 對照品溶液制備 精密稱取100%水平利巴韋林對照品10 mg，置于100 mL量瓶中，甲醇溶解至刻度，質(zhì)量濃度為100 mg/L，-20 ℃避光保存，臨用前稀釋成2 mg/L；將13C5利巴韋林內(nèi)標用甲醇定容至100 mL，配成 100 mg/L貯備液，臨用前稀釋至1 mg/L，即得。

2.4 供試品溶液制備 取烏雞白鳳丸、復(fù)方雞內(nèi)金片適量，研細，烘干，精密稱取5.0 g 粉末，置于50 mL 離心管中，精密加入1 mg/L 內(nèi)標工作液25 μL，加30 mL含乙腈(1%乙酸)渦旋混勻5 min，超聲提取10 min，加酸性磷酸酶50 μL，在37 ℃下酶解60 min，4 000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液，再加入10 mL含1%乙酸的乙腈至殘渣中，渦旋混勻，離心，合并上清液至50 mL，吸取12 mL，置于15 mL QuEChERS凈化管內(nèi)，渦旋混勻2 min，靜置5 min使樣液與填料充分接觸，4 000 r/min離心2 min，轉(zhuǎn)移10 mL上清液于另一試管中，氮氣吹干，加入1 mL乙腈溶解殘渣，0.22 μm濾膜過濾。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察 為了消除基質(zhì)效應(yīng)對測定結(jié)果的影響，本實驗在烏雞白鳳丸、復(fù)方雞內(nèi)金片中添加標準工作液，使其含量分別為1.0、2.5、5.0、10.0、50.0、100.0 μg/kg，按”2.4”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”“2.2”項條件下進樣測定。以進樣量為橫坐標(X)，定量離子與內(nèi)標校正離子峰面積之比為縱坐標(Y)進行回歸，得方程分別為Y=0.201 1X-0.014 5(R2=0.999 8)、Y=0.219 5X-0.044 8(R2=0.999 4)，在1.0～100 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。再以 3 倍信噪比(S/N)為檢出限，10倍信噪比(S/N)為定量限，測得兩者分別為0.3、1.0 μg/kg。

2.5.2 方法回收率、精密度試驗 取空白樣品適量，分別以1、2、10倍定量限進行方法回收率試驗，日內(nèi)每個添加水平每天平行測定 6 次，連續(xù)3 d，結(jié)果見表2。

表2 利巴韋林方法回收率、精密度試驗結(jié)果

2.6 利巴韋林及其代謝物總殘留測定 采用MRM 模式，利巴韋林有 2個檢測通道，每個通道對應(yīng)1個監(jiān)測離子對，若 2個通道中均出現(xiàn)與對照品保留時間一致的色譜峰，并且 2個子離子相對豐度與對照品一致，則可判定檢出該成分。各成分豐度均符合歐盟2002/657/EC 法規(guī)關(guān)于定性判斷時相對離子豐度得允許偏差范圍[15]，可判斷這些子離子相對豐度一致。根據(jù)定量監(jiān)測離子對離子流圖中的色譜峰峰面積，采用內(nèi)標法計算7批烏雞白鳳丸、4批復(fù)方雞內(nèi)金片中利巴韋林及其代謝物總殘留，結(jié)果見表 3，可知均未檢出。

表 3 利巴韋林及其代謝物總殘留測定結(jié)果

3 討論

3.1 提取溶劑選擇 采用已報道的20 g/L三氯乙酸、0.1%甲酸-20 mmol/L乙酸銨/甲醇、乙腈(1%乙酸)對樣品進行提取[16-18]，發(fā)現(xiàn)三氯乙酸提取液在后續(xù)氮吹濃縮時無法完全吹干，影響后續(xù)QuECHERS凈化便利性；甲酸-乙酸銨/甲醇提取液在氮吹時有大量粘稠狀物質(zhì)附著于試管底部，嚴重影響利巴韋林的回收率和精密度，可能是甲醇體系對樣品中的雜質(zhì)共萃取較多，而凈化過程又無法完全吸附導(dǎo)致；乙酸乙腈與前兩種提取液相比，提取的雜質(zhì)較少，有利于后續(xù)的QuECHERS凈化和氮吹濃縮。因此，本實驗采用乙腈(1%乙酸)作為提取劑。

3.2 凈化條件選擇 采用親水親脂平衡、磺酸基強陽離子、苯硼酸基弱陽離子三種固相萃取小柱和QuECHERS凈化管凈化，發(fā)現(xiàn)三種固相萃取小柱雖然去除雜質(zhì)效果較好，但回收率明顯偏低(HLB柱凈化回收率為40.1%～55.4%，MCX柱為45.1%～59.4%，PBA柱為 59.2%～66.5%)。QuECHERS凈化管內(nèi)的PSA能有效去除烏雞白鳳丸內(nèi)的蜂蜜和復(fù)方雞內(nèi)金片的外包糖衣中的多糖類雜質(zhì)，C18能有效吸附動物組織中的油脂等非極性成分[19]。實驗結(jié)果表明QuECHERS凈化管的回收率明顯高于固相萃取柱，并且操作簡單，凈化時間短。

3.3 色譜-質(zhì)譜條件優(yōu)化 本實驗考察了Waters X-Bridge C18(4.6 mm×50 mm, 2.5 μm)、Agilent ZORBAX SB-Aq(2.1 mm×100 mm, 1.8 μm)、Waters ACQUITY UPLC BHE HILIC (2.1 mm×100 mm, 1.7 μm)，發(fā)現(xiàn)同一質(zhì)量濃度利巴韋林(1.0 μg/L)的峰面積分別為2 293、1 975、2 265。雖然Waters X-Bridge C18反相柱和Waters ACQUITY UPLC BHE HILIC親水柱響應(yīng)相近，但利巴韋林在Waters X-Bridge C18柱上不易保留，和基質(zhì)中的尿苷類似物難以基線分離，而尿苷類似物相對分子質(zhì)量均為244.2，在質(zhì)譜ESI+源中的碎片離子質(zhì)荷比與利巴韋林也相同[20]，因此在實際樣品檢測時無法準確定量。Agilent ZORBAX SB-Aq柱的響應(yīng)與其他兩種柱子相比略低，可能是超高比例水相作為流動影響了利巴韋林的離子化[21]。Waters ACQUITY UPLC BHE HILIC親水填料色譜柱起始的水相比例為95%，對目標物的離子化影響小，且通過調(diào)整流動相梯度變化確定了“2.1”項下的色譜條件。

將0.5 mg/L利巴韋林對照品及其13C5內(nèi)標溶液以10 μL/min體積流量注入離子源，在正離子檢測方式下進行母離子掃描，得到準分子離子[M+H]+峰；優(yōu)化各離子對的去簇電壓、碰撞能量等，得到最佳的二級質(zhì)譜條件[22]；選擇響應(yīng)值高、基線噪音低的離子對作為監(jiān)測離子對，確定了“2.2”項下的質(zhì)譜條件。

4 結(jié)論

本研究建立酶解-QuEChERS凈化法結(jié)合親水作用色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定含雞源成分中成藥中利巴韋林及其代謝物總殘留的分析方法。該方法簡便、快速、靈敏度高，抗干擾能力強，可滿足實際樣品檢測的需要，同時也為其他動物源性中成藥的殘留檢測提供參考。