魯憲坤， 翟鑫源， 李方紅， 王 蕭， 張富坤， 張珊珊， 趙 盼， 趙東升*

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，山東 濟(jì)南 250355)

隨著機(jī)體的衰老，一些內(nèi)源性抗氧化酶的活力逐漸降低，使得小分子活性氧自由基在體內(nèi)蓄積過多，細(xì)胞膜中的不飽和脂肪酸被過多的活性氧自由基損害，引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[1-2]，這類反應(yīng)會(huì)對(duì)細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生損害，并且引起細(xì)胞受損甚至死亡，導(dǎo)致心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病和癌癥等疾病[3-6]。為了降低脂質(zhì)過氧化對(duì)機(jī)體造成的損傷，研發(fā)抗氧化劑已成為熱點(diǎn)，而中藥作為優(yōu)良的天然抗氧化劑，正獲得了人們青睞。

補(bǔ)骨脂為豆科補(bǔ)骨脂屬植物補(bǔ)骨脂PsoraleacorylifoliaL.的干燥成熟果實(shí)，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、食品、化妝品等多個(gè)領(lǐng)域，具有多種生物作用，如抗氧化、抗菌、雌激素樣、抗抑郁、抗腫瘤、抗骨質(zhì)疏松等[7-9]，主要含有黃酮、苯并呋喃、單萜酚、香豆素、擬雌內(nèi)酯等活性成分[7-8,10]，現(xiàn)已從中分離出黃酮、二氫黃酮、異黃酮、查爾酮等五十余種黃酮[7-8]。目前，對(duì)補(bǔ)骨脂黃酮的研究大多為補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚等單一成分，或醇提黃酮的藥理活性或構(gòu)-效關(guān)系[9,11-13]，鮮有涉及總黃酮提取工藝。

中藥所含成分復(fù)雜，僅憑借個(gè)別化合物含量高低來評(píng)價(jià)其提取工藝的優(yōu)劣具有一定局限性，若能采用提取率與生物活性相整合的方法，則可更綜合全面地進(jìn)行評(píng)價(jià)[14-16]。因此，本實(shí)驗(yàn)在整合“成分-抗氧化活性”的模式下，以提取率、體外抗氧化活性為指標(biāo)，采用雙響應(yīng)面法優(yōu)化補(bǔ)骨脂總黃酮提取工藝，以期為該成分的深入研發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑與藥物 蘆丁對(duì)照品(純度大于98%，上海源葉生物科技有限公司)。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，純度≥97%)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。補(bǔ)骨脂(產(chǎn)地四川)購自安徽亳州中藥材批發(fā)市場(chǎng)，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)孫稚穎教授鑒定為豆科補(bǔ)骨脂屬植物補(bǔ)骨脂PsoraleacorylifoliaL.的干燥成熟果實(shí)。亞硝酸鈉(分析純，中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司)；硝酸鋁(分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠)；氫氧化鈉(分析純，天津市匯杭化工科技有限公司)；無水乙醇(分析純，天津富宇精細(xì)化工有限公司)。

1.2 儀器 X-5紫外可見分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)；ST 16R高速冷凍離心機(jī)(賽默飛世爾科技有限公司)；KQ-500GVDV雙頻恒溫?cái)?shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液制備 精密稱取0.5 g藥材粉末，置于50 mL離心管中，超聲提取后13 000 r/min離心25 min，取上清液，即得。

2.2 總黃酮含量測(cè)定

2.2.1 方法學(xué)考察

2.2.1.1 線性關(guān)系考察 采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法[17]，分別精密吸取0.2 mg/mL蘆丁對(duì)照品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，置于10 mL量瓶中，加水至2.5 mL，加入0.4 mL 5%NaNO2溶液，搖勻，反應(yīng)6 min；0.4 mL 10%Al(NO3)3溶液，搖勻，反應(yīng)6 min；6.0 mL 4%NaOH溶液，無水乙醇定容至刻度，搖勻，室溫靜置15 min，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，平行3次，取平均值，以吸光度為縱坐標(biāo)(A)，蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行回歸，得方程為A=11.936X-0.003 4(r=0.999 2)，在0～0.05 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.1.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取0.2 mg/mL蘆丁對(duì)照品溶液0.5 mL，按“2.2.1.1”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度6次，測(cè)得其RSD為1.23%，表明儀器精密度良好。

2.2.1.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.1”項(xiàng)下供試品溶液0.2 mL，于0、2、4、8、24、48 h按“2.2.1.1”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，測(cè)得其RSD為1.53%，表明溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.1.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取0.5 g藥材粉末，平行6份，按“2.1”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.2.1.1”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，測(cè)得其RSD為0.74%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.1.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取總黃酮含量已知的藥材粉末0.5 g，平行12份，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，其中3份為空白，其他9份每3份分別加入高、中、低質(zhì)量濃度蘆丁對(duì)照品溶液，按“2.2.1.1”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率。結(jié)果，蘆丁平均加樣回收率為101.35%，RSD為1.13%。

2.3 單因素試驗(yàn) 精密稱取0.5 g藥材粉末，分別設(shè)定乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、70%、80%、90%、100%，液料比為10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1，提取溫度為30、40、50、60、70 ℃，提取時(shí)間為20、30、40、50、60 min，提取功率為250、300、350、400、450 W。

2.3.1 乙醇體積分?jǐn)?shù) 由圖1可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)在70%～90%范圍內(nèi)時(shí)，總黃酮提取率明顯升高(P<0.05)，在90%時(shí)達(dá)到最大值，但在100%時(shí)略有降低；DPPH清除率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的變化趨勢(shì)與總黃酮提取率呈現(xiàn)較好的一致性。因此，選擇80%～100%作進(jìn)一步優(yōu)化。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取率、DPPH清除率的影響

2.3.2 液料比 由圖2可知，隨著液料比升高，總黃酮提取率、DPPH清除率均大體呈先升后降的趨勢(shì)，在40∶1時(shí)均達(dá)到最大值。因此，選擇30∶1～50∶1作進(jìn)一步優(yōu)化。

圖2 液料比對(duì)總黃酮提取率、DPPH清除率的影響

2.3.3 提取溫度 由圖3可知，隨著提取溫度升高，總黃酮提取率、DPPH清除率均呈先升后降的趨勢(shì)，在30～50 ℃時(shí)兩者一致性良好；在50 ℃后DPPH清除率急劇下降，總黃酮與提取率一致性較差，這可能是由于過高的溫度在很大程度上破壞了具有體外抗氧化活性成分的結(jié)構(gòu)，從而使其清除率顯著降低。因此，選擇30～50 ℃作進(jìn)一步優(yōu)化。

圖3 提取溫度對(duì)總黃酮提取率、DPPH清除率的影響

2.3.4 提取時(shí)間 由圖4可知，提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率無明顯影響。從節(jié)約成本、DPPH清除率角度考慮，選擇30 min并不再作進(jìn)一步優(yōu)化。

圖4 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率、DPPH清除率的影響

2.3.5 提取功率 由圖5可知，提取功率對(duì)總黃酮提取率無明顯影響。從節(jié)約成本、DPPH清除率角度考慮，選擇350 W并不再作進(jìn)一步優(yōu)化。

圖5 提取功率對(duì)總黃酮提取率、DPPH清除率的影響

2.4 Box-Behnken響應(yīng)面法 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、液料比(B)、提取溫度(C)作為影響因素，總黃酮提取率(Y1)、DPPH清除率(Y2)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用Design-Expert 8.0.6軟件安排試驗(yàn)，因素水平見表1，結(jié)果見表2。

表1 因素水平

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

采用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸和二項(xiàng)式分析，得方程分別為Y1=83.68+18.59A+2.60B+2.50C-0.177 5AB+1.40AC-0.355 0BC-17.72A2-1.69B2-0.755 3C2、Y2=34.71+0.277 5A+0.788 8B+0.251 2C+0.775 0AB-0.025 0AC-0.532 5BC-3.16A2-2.49B2-2.13C2，方差分析見表3～4。由此可知，2個(gè)模型顯著性均很強(qiáng)(P<0.01)，但失擬項(xiàng)均不顯著(P>0.05)，表明其擬合度較好[19]；Y1、Y2相關(guān)系數(shù)r分別為0.992 9、0.987 2，表明自變量分別可反映99.29%、98.72%響應(yīng)值的變化[20]；以Y1為響應(yīng)值時(shí)，因素A、B、C、A2具有顯著性(P<0.05，P<0.01)，說明A對(duì)其影響不僅是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系[21]，而以Y2為響應(yīng)值時(shí)，因素B、A2、B2、C2、AB、BC具有顯著性(P<0.05，P<0.01)；各因素對(duì)Y1的影響程度依次為A>B>C，對(duì)Y2的影響程度依次為B>A>C。

表3 總黃酮提取率方差分析

表4 DPPH清除率方差分析

采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，見圖6～7。由此可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)與液料比、液料比與提取溫度對(duì)DPPH清除率的交互影響較顯著[22]；響應(yīng)值均隨著自變量的變化先升后降，但在各因素最高、最低水平之間等高線稀疏，響應(yīng)曲面較緩和，故其所對(duì)應(yīng)兩因素之間的交互作用并不顯著，與方差分析結(jié)果一致。

注：左圖為三維曲面圖，右圖為等高線圖。圖6 各因素響應(yīng)面圖(總黃酮提取率)

注：左圖為三維曲面圖，右圖為等高線圖。圖7 各因素響應(yīng)面圖(DPPH清除率)

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 采用Design-Expert 8.0.6軟件得到最優(yōu)提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)92.78%，液料比42.39∶1，提取溫度41.18 ℃，總黃酮提取率為88.31%，DPPH清除率為34.63%，結(jié)合實(shí)際操作，將其修正為乙醇體積分?jǐn)?shù)93%，液料比42∶1，提取溫度41 ℃。按上述優(yōu)化工藝進(jìn)行3批驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得平均總黃酮提取率為(88.56±0.09)%，DPPH清除率為(34.52±0.15)%，與預(yù)測(cè)值88.31%、34.63%接近，表明該工藝穩(wěn)定可行。

3 討論

鑒于“成分反映活性，活性指向功能”的中藥質(zhì)量控制新模式，中藥提取工藝的研究不應(yīng)僅以其所含成分提取率為唯一評(píng)價(jià)指標(biāo)，還應(yīng)綜合考慮其他相關(guān)因素，如活性、毒性等。同時(shí)，在中醫(yī)藥研究所需動(dòng)物模型不完善的情況下，若采用活性成分提取率和體外活性整合的雙指標(biāo)評(píng)價(jià)方法，則可更綜合全面地控制和優(yōu)化中藥提取工藝。因此，本實(shí)驗(yàn)以提取率與抗氧化活性為指標(biāo)，通過雙響應(yīng)面法優(yōu)化補(bǔ)骨脂總黃酮提取工藝，所得最優(yōu)工藝參數(shù)穩(wěn)定可行，不僅有利于該成分作為天然抗氧化劑，在食品、藥品、化妝品、功能性食品、保健品等領(lǐng)域中的推廣應(yīng)用，也為其他中藥提取工藝的研究提供了創(chuàng)新思路和方法。