張靜，劉爽，王潔，姚淑暉，宋晶晶，熊偉，黃曉智

大部分肺癌患者為非小細胞肺癌類型，其發(fā)病率逐年上升且早期癥狀不典型，多數(shù)患者明確診斷時已處于晚期[1]。盡管目前放射治療等非小細胞肺癌治療技術不斷進步，更加多樣化和個體化，但其總體治療效果仍不理想[2]。因此，探尋非小細胞肺癌放療抵抗的相關指標及機制，提高放療敏感性，可能對改善預后有重要意義。微小RNA-139-5p(microRNA-139-5p，miR-139-5p)是與多種腫瘤細胞增殖、凋亡及化療敏感性有關的微小核糖核酸[3]。You等[4]研究顯示，miR-139-5p與非小細胞肺癌發(fā)生發(fā)展及預后有關。Song等[5]研究顯示，鈣黏蛋白相關蛋白(cadherin-associated protein beta 1，CTNNB1，又稱β-catenin)是非小細胞肺癌中微小核糖核酸調(diào)控機制中的潛在靶基因。而既往研究顯示，miR-139-5p與CTNNB1存在靶向調(diào)控關系[6]?，F(xiàn)檢測非小細胞肺癌患者癌組織中miR-139-5p、CTNNB1蛋白的表達及其與非小細胞肺癌臨床病理特征、放射敏感性的關系，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年2月—2021年5月于唐山市人民醫(yī)院放化七科和腫瘤內(nèi)科就診且經(jīng)組織病理學及胸部影像學等確診的非小細胞肺癌患者156例為研究對象(研究組)，患者均不適宜手術治療并采用放射治療，其中男89例，女67例；年齡46～78(60.48±10.26)歲，<60歲82例，≥60歲74例；腫瘤直徑：<3.0 cm 70例，≥3.0 cm 86例；腫瘤位置：中央型78例，周圍型78例；無淋巴結轉(zhuǎn)移76例，有淋巴結轉(zhuǎn)移80例；組織分化程度：中/高分化72例，低分化84例；TNM分期[7]：Ⅱ～Ⅲ期69例，Ⅳ期87例；肺腺癌74例(腺癌亞組)，肺鱗癌82例(鱗癌亞組)；通過經(jīng)皮肺穿刺活檢獲取患者肺病變組織。另選取手術治療的非小細胞肺癌患者86例，男51例，女35例,年齡45～79(61.04±10.57)歲；術中獲取癌旁正常肺組織作為對照組。2組年齡、性別比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究通過醫(yī)院倫理委員會審批(RMYY-LLKS-2017-003)，且所有受試者均自愿參加、知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準：①非小細胞肺癌患者均符合“中國原發(fā)性肺癌診療規(guī)范(2015年版) ”中的診斷標準[8]；②入組前未接受過放化療等治療者；③一般資料齊全。(2)排除標準：①妊娠期或哺乳期婦女；②有精神障礙或認知功能障礙疾病者；③伴有其他惡性腫瘤或有惡性腫瘤史者；④有嚴重肝腎等臟器功能異常，其他感染性疾病或免疫性疾病者。

1.3 觀察指標與方法

1.3.1 放射敏感性：研究組患者入院后，仰臥，采用熱塑體膜固定，并采用CT定位，勾畫出腫瘤靶區(qū)及重要器官，制定相應放療計劃。入組患者均實施三維適形調(diào)強放射治療，劑量根據(jù)患者具體情況而定，總劑量為6 000～7 000 cGy，每次放療劑量200 cGy，平均每周5次，觀察病變范圍和體積變化。

1.3.2 miR-139-5p表達水平檢測：采用RNA提取試劑盒(購自美國Life公司)提取肺癌和癌旁正常肺組織總RNA后，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自上海杏園瑞民生物工程有限公司)反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用qRT-PCR儀(購自美國Bio-Rad公司，型號 CFX384)、PCR試劑盒(SYBR Premix Ex Taq Ⅱ，購自日本Takara公司)、熒光定量PCR參比染料(Rox reference dye，購自南京北魚生物科技有限公司)對miR-139-5p及其內(nèi)參U6進行擴增，引物由南京北魚生物科技有限公司合成(引物序列見表1)。 qRT-PCR反應體系為：cDNA模板(50 ng/μl)2 μl，上下游引物各0.8 μl，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μl，Rox reference dye(50×)0.4 μl，ddH2O 6.0 μl。反應條件為：95℃預變性5 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40個循環(huán)，重復3次。采用2-ΔΔCT法計算miR-139-5p的相對表達量。

1.3.3 CTNNB1蛋白表達檢測：將肺癌和癌旁正常肺組織用10%甲醛固定標本后，進行梯度脫水、透明、浸蠟、包埋及切片(厚度4 μm)。采用免疫組織化學法檢測組織CTNNB1蛋白表達，其操作步驟按照免疫組織化學試劑盒(購自上海茁彩生物科技有限公司)說明書嚴格進行，用PBS代替一抗作陰性對照，用已知陽性的肺組織切片作陽性對照。隨機選10個視野(10×40)在顯微鏡(購自日本OLYMPUS公司，型號 CX23)下進行觀察，計數(shù)100個細胞，以胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕褐色或棕黃色定義為陽性細胞。采用半定量法評分，按染色強度計分：棕褐色3分，棕黃色2分，淺黃色1分，無著色計0分；按陽性細胞比例計分：陽性細胞比例<1/3計1分，1/3～2/3計2分，>2/3計3分。根據(jù)兩者乘積為最終得分判定表達情況，≤2分為陰性表達，>2分為陽性表達[9]。

1.4 放療敏感性評定標準 觀察病變范圍和體積變化，采用實體瘤療效評價標準(RECIST 1.1)[10]評定放療敏感性：腫瘤增大>20%，或出現(xiàn)一個或多個新病灶為進展(進展亞組，28例)；腫瘤增大≤20%或減少≤50%為穩(wěn)定(穩(wěn)定亞組，42例)；腫瘤完全消失為完全緩解，腫瘤減少>50%為部分緩解(緩解亞組，86例)。

2 結 果

2.1 各組組織miR-139-5p、CTNNB1蛋白表達比較 研究組癌組織miR-139-5p表達水平低于對照組，CTNNB1蛋白陽性表達率高于對照組(P均<0.05)；腺癌亞組與鱗癌亞組miR-139-5p表達水平、CTNNB1蛋白陽性表達率比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2、圖1。

表2 對照組、研究組及2亞組miR-139-5p、CTNNB1蛋白表達比較Tab.2 Comparison of miR-139-5p and CTNNB1 proteinexpression between control group, study group and two subgroups

2.2 肺癌組織miR-139-5p、CTNNB1蛋白表達在不同臨床/病理特征中差異的比較 根據(jù)非小細胞肺癌(肺腺癌和肺鱗癌)患者癌組織miR-139-5p表達水平平均值(0.62)及CTNNB1蛋白是否陽性表達，將其分為miR-139-5p低表達79例(miR-139-5p表達水平<0.62)，miR-139-5p高表達77例(miR-139-5p表達水平≥0.62)；CTNNB1蛋白陰性表達50例，CTNNB1蛋白陽性表達106例。miR-139-5p、CTNNB1蛋白表達在非小細胞肺癌患者不同性別、年齡、腫瘤直徑、病理類型、腫瘤位置方面比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；miR-139-5p低表達患者中有淋巴結轉(zhuǎn)移、組織分化程度低、TNM分期Ⅳ期患者比例高于miR-139-5p高表達患者(P<0.01)；CTNNB1蛋白陰性表達患者中有淋巴結轉(zhuǎn)移、組織分化程度低、TNM分期Ⅳ期患者比例低于CTNNB1蛋白陽性表達患者(P<0.01)，見表3。

表3 非小細胞肺癌患者癌組織miR-139-5p、CTNNB1蛋白表達在不同臨床/病理特征中差異的比較 [例(%)]Tab.3 Comparison of miR-139-5p and CTNNB1 protein expression in different clinical/pathological features of patients with NSCLC

2.3 肺癌組織miR-139-5p表達與CTNNB1蛋白陽性表達的相關性分析 Spearman分析結果顯示，非小細胞肺癌患者癌組織miR-139-5p表達水平與CTNNB1蛋白陽性表達呈負相關(r=-0.503，P=0.000)。

注：A.癌旁正常肺組織CTNNB1蛋白陽性表達；B.肺腺癌組織CTNNB1蛋白陽性表達；C.肺鱗癌組織CTNNB1蛋白陽性表達；D.癌旁正常肺組織CTNNB1蛋白陰性表達；E.肺腺癌組織CTNNB1蛋白陰性表達；F.肺鱗癌組織CTNNB1蛋白陰性表達

2.4 肺癌組織miR-139-5p、CTNNB1蛋白表達與放射敏感性的關系 結果顯示，緩解亞組、穩(wěn)定亞組、進展亞組miR-139-5p低表達率及CTNNB1蛋白陽性表達率依次升高(P<0.05)，見表4。

表4 非小細胞肺癌患者癌組織miR-139-5p、CTNNB1蛋白表達與放射敏感性的關系 [例(%)]Tab.4 Relationship between the expression of miR-139-5p,CTNNB1 protein and radiosensitivity in patients with NSCLC

2.5 影響非小細胞肺癌患者放射敏感性的多因素Logistic分析 將非小細胞肺癌患者放射治療后是否出現(xiàn)進展作為因變量，以miR-139-5p、CTNNB1蛋白、淋巴結轉(zhuǎn)移、組織分化程度、TNM分期為自變量進行多因素Logistic回歸分析，結果顯示，CTNNB1蛋白陽性表達、TNM分期高是影響放射敏感性的獨立危險因素(P<0.01)，miR-139-5p高表達是影響放射敏感性的保護因素(P<0.01)，見表5。

表5 非小細胞肺癌患者放射敏感性影響因素的多因素Logistic回歸分析Tab.5 Multivariate Logistic regression analysis on influence factors of radiosensitivity in patients with NSCLC

3 討 論

肺癌作為一種源于支氣管黏膜的高度惡性腫瘤，是世界上癌癥死亡的主要原因之一[11-12]。肺癌中最常見的組織類型是非小細胞肺癌，其具體分子機制尚未十分明確，最常見的亞型為鱗狀細胞癌和腺癌[13]。盡管目前放射治療技術日益更新，但非小細胞肺癌臨床總體治療效果仍處于平臺期，尤其是放療不敏感常會引起肺癌治療失控[14]。因此，如何預測或提高放射治療敏感性是現(xiàn)階段醫(yī)學研究需要關注的關鍵問題。

微小核糖核酸是一種基因表達調(diào)控分子，為癌癥分子機制及放化療敏感性的研究提供了新的機遇[15]。本研究中miR-139-5p在肺鱗癌和肺腺癌患者癌組織中均呈異常低表達，且表達水平在2種病理亞型間無顯著差異，提示miR-139-5p在非小細胞肺癌的發(fā)生發(fā)展中可能起抑癌基因作用，與You等[4]研究結果一致。CTNNB1是鈣黏蛋白家族一員，早期被認為是一種黏附因子，在細胞間的黏附過程中扮演重要角色[16-17]。游離型CTNNB1可進入細胞核，對細胞增殖、遷移等進行調(diào)控，進而促進腫瘤發(fā)生[18]。本結果顯示，CTNNB1蛋白陽性表達率在非小細胞肺癌患者癌組織中呈高水平，且與miR-139-5p呈負相關。結合既往研究，推測在非小細胞肺癌的發(fā)生發(fā)展中，miR-139-5p與CTNNB1蛋白間可能有調(diào)控作用，二者共同參與疾病進展。本研究進一步探討miR-139-5p、CTNNB1蛋白的生物學功能，結果表明，二者與淋巴結轉(zhuǎn)移、組織分化程度、TNM分期有關。推測miR-139-5p低表達可上調(diào)CTNNB1蛋白表達量，CTNNB1蛋白通過進一步作用促進腫瘤細胞的生長，抑制腫瘤細胞凋亡，使細胞周期發(fā)生阻滯，推動疾病進展。相關研究表明，miR-139-5p及其相關通路與前列腺癌的放療敏感性及卵巢癌的順鉑敏感性有關[19-20]。He等[21]研究顯示，miR-541-3p可通過下調(diào)CTNNB1增加前列腺癌細胞的放射敏感性。而本結果中，放療療效最差的進展亞組非小細胞肺癌患者，其miR-139-5p低表達率和CTNNB1蛋白陽性表達率最高，表明CTNNB1蛋白、miR-139-5p與放療療效及放射敏感性有一定相關性，推測miR-139-5p低表達通過上調(diào)CTNNB1蛋白表達水平靶向作用于癌細胞，調(diào)控癌細胞的生物學功能，進而調(diào)節(jié)細胞對放射治療的敏感性。進一步多因素Logistic回歸分析結果提示，臨床中需要密切監(jiān)測CTNNB1高表達、miR-139-5p低表達、TNM分期為Ⅳ期的患者，針對此類患者制定個體化治療措施，提高放療敏感性。

綜上所述，在非小細胞肺癌組織中，miR-139-5p表達水平下降、CTNNB1蛋白陽性表達率升高，二者可能分別發(fā)揮抑制和促進腫瘤發(fā)生的作用，且一定程度上影響放射敏感性。然而本研究存在一定的不足之處，miR-139-5p低表達后，CTNNB1蛋白的上調(diào)可能伴隨或?qū)е缕渌嚓P基因表達的變化，有待今后納入更多樣本，采用多層次、多中心的試驗來進一步證實。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

張靜：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；劉爽、王潔：提出研究思路，分析試驗數(shù)據(jù)，論文審核；姚淑暉、宋晶晶：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改；熊偉：進行統(tǒng)計學分析；黃曉智：課題設計