郭獻平，邊藝偉，王東升，吳中營，王合中，連曉東，郭 鵬

（1. 河南省農(nóng)業(yè)科學院園藝研究所，河南 鄭州 450002；2. 河南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，河南 鄭州 450002；3. 河南農(nóng)業(yè)大學園藝學院，河南 鄭州 450002）

梨樹在缺鐵條件下易發(fā)生缺鐵黃化病。發(fā)生缺鐵黃化的原因較多，經(jīng)常發(fā)生缺鐵的土壤類型是堿性土壤，尤其是石灰性土壤。石灰性土壤pH 值一般在7.4～8.5,并具有高重碳酸鹽[1]。石灰性土壤面積占世界陸地面積的30%以上[2]。我國的石灰性土壤分布很廣，約占耕地面積的1/2[3]。西班牙西洋梨Blanquilla[4]，美國華盛頓西洋梨Anjou[4]，中國新疆庫爾勒香梨[5]，安徽省碭山酥梨[6]、鴨梨和黃金梨[6]，湖北省湘南梨和棠梨[7]，浙江省上虞市海涂地黃花梨[8]，河北省泊頭市鴨梨[9]，陜西省蒲城縣碭山酥梨[10]，天津市秋白梨[11]，四川省漢源縣黃金梨[12]均有報道因缺鐵導致的梨樹黃化病。缺鐵條件下，梨樹葉片表現(xiàn)為缺鐵黃化，同時梨樹生長量、果實產(chǎn)量和品質(zhì)均下降。據(jù)報道，庫爾勒香梨黃化樹單果質(zhì)量比正常樹降低29.3%，可溶性固形物含量下降15.2%，維生素C 含量降低41.4%，硬度和可滴定酸含量升高[13]。

葉面噴施鐵肥是矯治缺鐵黃化的有效途徑之一[14]。鐵肥的種類較多，常見的有無機鐵肥、螯合鐵肥與有機復合鐵肥，如FeSO4·7H2O、Fe-EDTA（乙二胺四乙酸鐵鈉）、木質(zhì)素磺酸鐵等。無機鐵肥FeSO4·7H2O 價格低，但其在空氣中很快會被氧化成為三價鐵沉淀物，導致噴施效果差；螯合鐵肥效果好，但Fe-EDTA 在自然條件下EDTA 轉(zhuǎn)化成乙二胺三乙酸，再經(jīng)過環(huán)化，變成二酮哌嗪，成為持久性有機污染物并在環(huán)境中積累[15]；有機復合鐵木質(zhì)素磺酸鐵在環(huán)境中易降解，不存在環(huán)境污染的問題，但其含鐵量低，性質(zhì)不穩(wěn)定。納米材料由于具有獨特的理化性質(zhì)，如表面效應、小尺寸效應、量子尺寸效應、宏觀量子尺寸效應以及介電限域效應[16]，在生物醫(yī)藥、材料加工和能源環(huán)境等領域均有應用。納米科技與農(nóng)業(yè)科技的相互滲透，為農(nóng)業(yè)科學發(fā)展提供了新的理論、方法和技術手段[17]。比如肥料方面，納米幾丁質(zhì)促進N 代謝超過C 代謝，使冬小麥產(chǎn)量提高27.56%[18]。納米二氧化鈦利用TiO2的光化學效應，可增加種子的抗逆性[19]。從天然纖維素中提取的納米纖維素（Cellulose nanocrystals，CNC），有資源豐富、可自然降解等優(yōu)點，同時賦予它納米粒子的特性，為其形成各種功能性復合材料提供了可能，具有廣闊的應用前景[20]。如納米纖維素與銀螯合，CS-DCNC-AgNPs（殼聚糖-二醛纖維素納米晶-銀納米粒）復合物具有良好的機械強度和疏水性，抗菌活性高，細胞毒性小，是一種有前途的、安全的抗菌藥物[21]。本研究采用溶解級軟木硫酸紙Temalfa 95A，通過水解法獲得性能良好的納米纖維素，將其與硫酸亞鐵螯合形成新型可生物降解的鐵螯合劑（納米纖維素-鐵螯合物，CNC-Fe）；通過對杜梨缺鐵黃化葉片噴施FeSO4和CNC-Fe 并進行相關生理指標和轉(zhuǎn)錄組測序分析，研究CNC-Fe 矯治梨樹缺鐵黃化癥的效果及分子機制，為梨樹抗黃化癥機制等研究提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料及處理

采用改良后的硫酸水解法制備納米纖維素[22]。將Rayonier Advanced Materials 公司贈送的溶解級軟木硫化紙（Temalfa 95A）粉碎后，取20 g 纖維素粉加入500 mL 三頸燒瓶，在水浴鍋中預熱至45 ℃。按1∶100 的反應比例向燒瓶中緩緩倒入200 mL 預熱至45 ℃的64%硫酸；開啟攪拌器，在45 ℃的恒溫條件下反應45 min 后，用4 倍體積預冷的去離子水（4 ℃）終止反應。然后在4 ℃條件下9 000 r/min 離心15 min。棄上清，加入適量去離子水振蕩潤洗沉淀，倒入透析袋中，用去離子水透析10～15 d，除去游離酸。最后在冰浴中超聲處理25 min，超聲破碎功能設置為35%輸出功率，工作5 s，間歇5 s，即可得到納米纖維素水懸浮液。

杜梨幼苗長出6 片真葉后，選擇高度均一的幼苗移至水培槽培養(yǎng)杜梨黃化苗，水培槽中營養(yǎng)液為1×10-8mol/L EDTA-Fe 改良的Hogland 營養(yǎng)液，pH 值約6.5[23]。杜梨幼苗長至25 cm左右時移至人工氣候箱，每盆3 株黃化杜梨苗，設定16 h 光照（26 ℃）、8 h黑夜（18 ℃）。選擇SPAD值10～30的葉片做標記。

試驗設計3 個處理，處理1（T1）噴施4 mmol/L FeSO4，處理2（T2）為納米纖維素與FeSO4按照電荷比1∶3 000螯合后噴施，每個處理均添加0.15%吐溫80，對照（CK）噴施去離子水，每個處理重復3 次。處理72 h 后測定相關生理指標，并取葉片轉(zhuǎn)至液氮速凍，置于-80 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 納米纖維素粒徑、Zeta電位和綜合電荷密度的測定

利用動態(tài)光散射法，用馬爾文納米粒度儀（Nanosizer，ZS 90）測定納米纖維素的流體動力學粒徑和Zeta電位。使用雷磁電導率儀（DDS-307）通過電導滴定法測定納米纖維素的磺酸基綜合電荷密度[24]。

1.3 葉片活性鐵、葉綠素相對含量（SPAD值）和凈光合速率的測定

活性鐵含量采用酸消解ICP 法測定[25‐26]。葉片在105 ℃殺青30 min，然后在70 ℃條件下烘干7 d至恒定質(zhì)量后，稱取干燥后葉片0.1 g，加入10 mL 1.0 mol/L 鹽酸浸提，連續(xù)振蕩24 h，過濾后用ICP 法測定浸提液中鐵含量。葉綠素相對含量利用spad-502 便攜式葉綠素測定儀測定。采用漢莎光合作用測定儀（CIRAS-3）測定凈光合速率。

1.4 轉(zhuǎn)錄組測序

轉(zhuǎn)錄組測序所用材料為3 種處理72 h 后的葉片，3次生物學重復。RNA 提取采用總RNA 提取試劑盒，RNA 質(zhì)量檢測使用Qubit，保證RNA 質(zhì)量滿足建庫使用。測序工作委托蘇州金唯智生物科技有限公司基于Illumina HiSeqTM 2500 測序平臺完成，采用Hisat2（V2.0.1）軟件進行序列比對，Htseq 軟件（V0.6.1）計算基因FPKM（Fragments per kilo bases per million reads）值[27]。鐵蛋白家族基因表達量采用Z-score歸一法處理。

1.5 差異表達基因篩選與功能注釋

利用DESeq2（V1.6.3）進行差異表達基因分析，以差異基因表達變化2 倍以上，且Q-vaule≤0.05 進行篩選。將獲得的差異基因進行GO（Gene ontology）和KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）注釋和富集分析。果膠甲酯酶（PME）和果膠甲酯酶抑制子（PMEI）結(jié)構(gòu)域利用SMART（http://smart.embl‐heidelberg.de/）分析驗證。

1.6 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）驗證

對參與KEGG 通路的8 個差異表達基因（Differentially expressed genes，DEGs）表達模式通過實時熒光定量PCR 進一步分析。采用qRT-PCR 內(nèi)參基因歸一化2-ΔΔCt法進行轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的驗證，3 個生物學重復。使用在線軟件Primer Premier 5設計引物，梨Actin基因作為內(nèi)參，引物序列見表1。

表1 實時熒光定量PCR引物Tab.1 qRT-PCR primers

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用SPSS 22.0 進行統(tǒng)計分析，采用Excel 和Origin 8.5進行數(shù)據(jù)處理和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 納米纖維素的表征

經(jīng)馬爾文納米粒度儀測定，納米纖維素的流體動力學粒徑和Zeta 電位分別為（84.3±0.1）nm 和（-47.30±1.0）mV，說明納米纖維素帶負電荷（圖1）。通過電導滴定法檢測納米纖維素水懸浮液的綜合電荷密度，納米纖維素綜合電荷密度的電導率滴定曲線為典型的V 形滴定曲線，與文獻[22‐24]中的結(jié)果一致，其綜合表面帶電荷量為（108.5±3.1）mmol/kg（圖2）。

圖1 納米纖維素粒徑和Zeta電位Fig.1 Particle size and Zeta potential of CNC

圖2 納米纖維素綜合電荷密度的電導率滴定曲線Fig.2 Conductometric titration curves for the determination of integrated charge density of CNC

2.2 不同處理對杜梨葉片活性鐵含量、SPAD值和凈光合速率的影響

因FeSO4易被氧化成為三價鐵沉淀物降低復綠效果[28]，處理72 h 后，T1（噴施FeSO4）部分復綠，而T2（噴施CNC-Fe）基本復綠（圖3）?！拌F素黃化悖論”說明缺鐵黃化葉片的全鐵含量與葉綠素含量相關性極低，而葉片活性鐵與葉綠素含量之間則呈現(xiàn)高度正相關[29‐30]。由表2 可知，T1 與T2 均提高葉片的活性鐵含量，T1 和T2 葉片活性鐵含量分別比CK 提高110.7%和235.8%，差異均顯著。T2 葉片活性鐵含量比T1顯著提高59.4%。

圖3 不同處理72 h后杜梨葉片表型Fig.3 Phenotypes of Pyrus betulifolia leaves after 72 h of different treatments

SPAD 值能夠反映葉片黃化程度，因與葉綠素含量有較好的相關性，被廣泛用于評價作物缺鐵狀況[31]。由表2 可知，T1 和T2 不同程度地提高杜梨葉片的SPAD 值，T1、T2 的SPAD 值比CK 分別提高26.1%和61.7%，差異均顯著；且T2 比T1 的SPAD 值顯著提高28.2%。T1、T2 凈光合速率比CK 分別提高70.1%、98.5%，差異均顯著。

表2 不同處理72 h后杜梨葉片活性鐵含量、SPAD值和凈光合速率Tab.2 Active iron content，SPAD value and net photosynthetic rate of Pyrus betulifolia leaves after 72 h of different treatments

綜上可知，噴施CNC-Fe比單獨噴施FeSO4更能提高黃化葉片的活性鐵和葉綠素含量以及光合能力，說明CNC-Fe矯治缺鐵黃化癥的能力更強。

2.3 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量分析

由表3 可知，利用Illumina HiSeqTM 2500 測序平臺分別對T1、T2 和CK 葉片進行轉(zhuǎn)錄組測序。測序結(jié)果顯示，葉片GC 含量均大于48%，Q20、Q30 值都高于91%，表明轉(zhuǎn)錄組測序的質(zhì)量較高，可以進行下一步分析。經(jīng)聚類圖分析，表明每組重復性較好（圖4）。

圖4 不同處理杜梨葉片樣品間基因表達量聚類Fig.4 Cluster diagram of gene expression among Pyrus betulifolia leaves samples of different treatments

表3 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)Tab.3 Data assembly for transcriptome sequencing

2.4 基因表達水平分析

由圖5 可知，與CK 相比，T1、T2 分別有1 033、1 943 個差異基因。T1 上調(diào)基因527 個，下調(diào)基因506 個；T2 上調(diào)基因861 個，下調(diào)基因1 082 個。不同處理間相比，T1較T2有650個上調(diào)基因，329個下調(diào)基因。通過韋恩圖分析，T1、T2 與CK 相比，分別特有DEGs 為586、1 496 個，說明T1 和T2 對矯治缺鐵黃化癥的調(diào)控方式存在較大差異。

圖5 不同處理杜梨葉片中上調(diào)和下調(diào)DEGs的數(shù)量與DEGs韋恩圖Fig.5 Numbers of up-regulated and down-regulated genes and Venn diagram of DEGs in Pyrus betulifolia leaves under different treatments

2.5 差異表達基因GO功能富集分析

通過差異表達基因GO 功能富集分析，T2 比T1多26 個GO 項。由圖6 可知，GO 功能富集分析提取了分子功能（Molecular function，紅色部分）、細胞組分（Cellular component，藍色部分）和生物過程（Biological process，綠色部分）前10 個GO 項。與CK 相比，T1 和T2 中共有GO 通路包括GO∶0046872金屬離子固定（Metal ion binding）、GO∶0016491 氧化還原酶活性（Oxidoreductase activity）、GO:0016020膜（Membrane）、GO∶0009507 葉綠體（Chloroplast）、GO∶0055114 氧化還原過程（Oxidation‐reduction process）和 GO∶0009765 光 合 捕 光 過 程（Photosynthesis,light harvesting）。其中葉綠體和光合捕光過程的差異表達基因均上調(diào)，說明T1 和T2可能通過調(diào)節(jié)金屬離子固定、氧化還原酶、膜、葉綠體和光合捕光系統(tǒng)等相關基因的活性，提高活性鐵、葉綠素含量和光合能力。

圖6 不同處理杜梨葉片差異基因的GO富集分析Fig.6 GO enriched analysis of differentially expressed genes in Pyrus betulifolia leaves under different treatments

與CK 相比，T2 特有的GO 通路有GO∶0005506鐵離子固定（Iron ion binding）、GO∶0030599 果膠甲酯酶活性（Pectinesterase activity）、GO∶0045490 果膠分解代謝過程（Pectin catabolic process）和GO∶0042545 細胞壁修飾（Cell wall modification）。在T1 vs T2 中，GO 富集的主要通路除了包含果膠甲酯酶活性、果膠分解代謝過程、細胞壁修飾，還包括GO:0005618細胞壁（Cell wall），經(jīng)分析這些GO項差異基因為PME4（Pectin methyl‐esterase 4）、LOC103943418（Probable pectinesterase/pectinesterase inhibitor 34）、LOC103962785（Probable pectinesterase/pectinesterase inhibitor 51）、LOC103948035（Probable pectinesterase/pectinesterase inhibitor 34），均為果膠甲酯酶，CK、T1 和T2 的PME4表達量分別為81.57、55.27、8.75，LOC103943418表達量為47.77、34.44、10.30，LOC103962785表達量為0.31、0.50、0.01，LOC103948035表達量為111.23、123.79、43.41，PME4和LOC103943418表達量由高到低依次均為CK、T1 和T2，LOC103962785和LOC103948035表達量由高到低依次均為T1、CK 和T2，噴施CNC-Fe螯合物的葉片72 h 后果膠甲酯酶表達量均低于噴施FeSO4和CK。

2.6 差異表達基因KEGG富集分析

KEGG 富集分析結(jié)果（圖7）顯示，與CK 相比，T1 處理中僅有55 個差異表達基因注釋到4 個通路中；而T2 處理中有712 個差異基因注釋到18 條通路，說明T2能夠調(diào)動更多的通路促進葉片復綠。其中光合作用-天線蛋白（Photosynthesis‐antenna proteins）和光合作用（Photosynthesis）2個通路，在T1和T2 處理中都呈顯著富集。T1 中光合作用-天線蛋白通路共有8 個差異表達基因，全部為上調(diào)；T2中注釋到17 個差異表達基因，也全部為上調(diào)。T1中光合作用通路注釋到9 個差異表達基因（8 個上調(diào)，1個下調(diào)）；在T2中光合作用通路注釋到41個差異表達基因（40 個上調(diào)，1 個下調(diào)）。此外，與CK 相比，T1 中植物病原互作（Plant‐pathogen interaction）和脂肪酸伸長（Fatty acid elongation）也為富集通路；T2 中代謝途徑（Metabolic pathways）、次生代謝產(chǎn)物生物合成（Biosynthesis of secondary metabolites）、碳代謝（Carbon metabolism）和光合組織的碳固定（Carbon fixation in photosynthetic organisms）等呈現(xiàn)顯著富集。T1 與T2 相比，木栓質(zhì)和蠟的生物合成（Cutin，suberine and wax biosynthesis）、脂肪酸生物合成（Fatty acid biosynthesis）、脂肪酸代謝（Fatty acid metabolism）、甘油磷脂代謝（Glycerophospholipid metabolism）、硫代謝（Sulfur metabolism）、Ras 信號通路（Ras signaling pathway）等共11 個通路呈現(xiàn)顯著富集。

圖7 不同處理杜梨葉片差異基因的KEGG顯著富集分析Fig.7 KEGG analysis of differentially expressed genes in Pyrus betulifolia leaves under different treatments

2.7 鐵蛋白（Ferritin）家族基因表達趨勢

梨基因組中鐵蛋白家族共有4 個基因，分別為Fer1（LOC103930157）、Fer2（LOC103958648）、Fer3（LOC103965102）和Fer4（LOC103937157）。通過轉(zhuǎn)錄組中鐵蛋白家族基因熱圖分析（圖8）可知，T2的4種鐵蛋白基因表達量均高于T1，除CKFer2表達量高于T1 和T2 外，T1 和T2Fer1、Fer3、Fer4表達量均高于CK，說明T2葉片鐵離子貯存能力強于T1。

圖8 不同處理杜梨葉片鐵蛋白家族基因熱圖Fig.8 Heat map of ferritin family gene in Pyrus betulifolia leaves under different treatments

2.8 光合作用相關的差異表達基因

與CK 相比，T1 和T2 共有的通路是光合作用-天線蛋白，有58 個基因上調(diào)表達，其中56 個基因表現(xiàn)出T2中表達量最高。在光合作用-天線蛋白通路中（圖9），編碼光合作用-天線蛋白LHCⅠ基因家族有5 類基因，與CK 相比，T1 和T2 有3 類5 個基因表達上調(diào)，分別為Lhca1（編碼捕光復合體Ⅰ葉綠素a/b-1 結(jié)合蛋白）、Lhca2（編碼捕光復合體Ⅰ葉綠素a/b-2 結(jié)合蛋白）、Lhca4（編碼捕光復合體Ⅰ葉綠素a/b-4 結(jié)合蛋白）；編碼LHCⅡ蛋白基因家族有7 類基因，與CK 相比，T1、T2 有6 類13 個基因呈現(xiàn)上調(diào)表達，分別為Lhcb1（編碼捕光復合體Ⅱ葉綠素a/b-1 結(jié)合蛋白）、Lhcb2（編碼捕光復合體Ⅱ葉綠素a/b-2 結(jié)合蛋白）、Lhcb3、Lhcb4、Lhcb5、Lhcb6。在以上所有上調(diào)表達基因中，T2 表達量均高于T1，說明CNC-Fe能更加有效地向反應中心輸送能量。

圖9 參與光合作用-天線蛋白通路的DEGs表達情況Fig.9 Summary of DEGs in the photosynthesis-antenna proteins pathway

光合作用通路中編碼PSⅡ系統(tǒng)相關的Psb基因家族有27 類基因（圖10），與CK 相比，T1 和T2 有7 類14 個基因呈現(xiàn)上調(diào)表達，分別為PsbO（編碼光系統(tǒng)Ⅱ-1 放氧增強蛋白）、PsbP（編碼光系統(tǒng)Ⅱ-2放氧增強蛋白）、PsbQ（編碼光系統(tǒng)Ⅱ-3 放氧增強蛋白）、PsbR（編碼光系統(tǒng)Ⅱ10kDa 蛋白）、PsbW（編碼光系統(tǒng)ⅡPsbW 蛋白）、PsbY（編碼光系統(tǒng)ⅡPsbY蛋白）、Psb27（編碼光系統(tǒng)ⅡPsb27 蛋白）。編碼PSⅠ系統(tǒng)相關的Psa基因家族有16類基因，這些亞基蛋白主要參與PSⅠ反應中心的組成，與CK 相比，T1、T2 有8 類15 個基因呈現(xiàn)上調(diào)表達，分別為PsaD（編碼光系統(tǒng)Ⅰ-Ⅱ亞基）、PsaE（編碼光系統(tǒng)Ⅰ-Ⅳ亞基）、PsaF（編碼光系統(tǒng)Ⅰ-Ⅲ亞基）、PsaG（編碼光系統(tǒng)Ⅰ-Ⅴ亞基）、PsaH（編碼光系統(tǒng)Ⅰ-Ⅵ亞基）、PsaK（編碼光系統(tǒng)Ⅰ-Ⅹ亞基）、PsaN（編碼光系統(tǒng)Ⅰ-PsaN 亞基）、PsaO（編碼光系統(tǒng)Ⅰ-PsaO 亞基）；編碼細胞色素b6/f復合物和光合電子傳輸過程的相關蛋白Pet基因家族有12類基因，有3類6個基因上調(diào)表達，分別為PetC（編碼細胞色素b6-f 復合鐵硫亞基）、PetE（編碼質(zhì)體藍蛋白）、PetF（編碼鐵氧還蛋白），PetH（編碼鐵氧還蛋白-NADP+還原酶）下調(diào)表達。編碼F 型ATP 酶相關蛋白有8 類基因，其中有3 類5 個基因上調(diào)表達，分別為gamma（F 型H+轉(zhuǎn)運ATPase-gamma 亞基）、delta（F 型H+轉(zhuǎn)運ATPasedelta亞基）、b（F型H+轉(zhuǎn)運ATPase-b 亞基）。在以上40 個上調(diào)表達基因中，有38 個基因T2 表達量高于T1，說明CNC-Fe能更有效促進杜梨的光反應效率。

圖10 參與光合作用通路的DEGs表達情況Fig.10 Summary of DEGs in the photosynthesis pathway

2.9 相關差異表達基因的定量驗證

對參與光合作用中PSⅡ、PSⅠ、細胞色素b6/f復合物、光合電子傳輸?shù)南嚓P8 個DEGs 進行qRTPCR 分析，結(jié)果顯示，與RNA-seq 分析的表達模式類似（圖11）。參與PS Ⅱ的4 個DEGs 分別為LOC103946003、LOC103967609、LOC103948373、LOC103949857， 參 與 PS Ⅰ 的 DEGs 為LOC103945111，參與細胞色素b6/f 復合物的DEGs為LOC103944475，參與光合電子傳輸?shù)? 個DEGs分別為LOC103927331、LOC103946316。

圖11 候選基因的實時熒光定量PCR驗證Fig.11 Quantitative real-time PCR validation of candidate genes

3 結(jié)論與討論

3.1 噴施CNC-Fe比FeSO4能調(diào)動更多的基因和代謝通路，促進杜梨黃化葉片復綠

鐵是植物中生長的必需微量元素，參與了多種代謝途徑，比如葉綠素生物合成、光合作用、呼吸作用，另外還作為輔助因子參與電子傳遞[32]。處理杜梨72 h 后，通過對其葉片進行轉(zhuǎn)錄組測序與分析，解釋了鐵素代謝、光合作用等相關基因轉(zhuǎn)錄表達情況。與CK相比，T2比T1上調(diào)表達基因329個，下調(diào)表達基因650個；T2比T1 GO富集多26項，KEGG富集多14 個代謝通路。說明CNC-Fe 能夠刺激更多基因和代謝通路促進杜梨黃化葉片復綠。

3.2 CNC-Fe比FeSO4能改善鐵素代謝相關基因表達，提高杜梨葉片的活性鐵含量

植物鐵蛋白是存在于植物細胞質(zhì)體中的一種專門儲存鐵的蛋白質(zhì)，約80%的鐵存在于質(zhì)體內(nèi)的鐵蛋白中[33]。植物鐵蛋白由24 個亞單位組成，在其結(jié)構(gòu)的空腔中可儲存4 500 個鐵原子[34]。本研究T1和T2 處理杜梨葉片活性鐵含量比CK 分別提高110.7%和235.8%，差異均顯著；T2 葉片活性鐵含量比T1 顯著提高59.4%。T2 的4 種鐵蛋白基因表達量均高于T1，4 種鐵蛋白基因的增幅各不相同。賈兵等[35]在外源噴施0.2%FeSO4處理缺鐵黃化碭山酥梨葉片研究中，處理8 d 和12 d 后Fer1、Fer2、Fer3、Fer4相對表達量和活性鐵含量顯著高于清水處理黃化葉片。在碭山酥梨輕度、中度和重度缺鐵條件下4種鐵蛋白基因表達量分析中，與正常葉片相比，PbFer1、PbFer3和PbFer4的表達量均呈現(xiàn)隨著缺鐵程度的增加表達量逐漸降低，而PbFer2在輕度缺鐵條件下的表達量高于正常葉片，中度和重度條件下逐漸降低[36]。本研究結(jié)果表明，F(xiàn)er1、Fer3基因表達量更能體現(xiàn)葉片貯存鐵的能力。

果膠是植物細胞壁的主要成分之一，并且是陽離子的主要結(jié)合位點。果膠甲酯酶普遍存在于高等植物的不同組織器官，如根、莖、葉、果實等，其對細胞壁組成和降解、根尖延伸、抗病等方面具有重要作用[37‐38]。缺鐵條件下，植物根系果膠甲酯酶活性增強，使果膠產(chǎn)生較多的游離羧基即陽離子吸附位點，增加與鐵的結(jié)合能力[39]。植物果膠甲酯酶抑制子與果膠甲酯酶結(jié)合形成1∶1的可逆復合物抑制其活性[40]。本研究轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果表明，T2 處理的葉片果膠甲酯酶表達量均低于T1 和CK，T1 處理PME4的表達量為T2 的6.3 倍，CKPME4的表達量為T2 處理的9.3 倍，說明CNC-Fe 可能通過抑制果膠甲酯酶表達量而降低果膠甲酯酶活性，減少質(zhì)外體對鐵離子的固定，使更多的鐵通過鐵素相關代謝轉(zhuǎn)運至質(zhì)體內(nèi)，最終提高葉片活性鐵含量使葉片復綠。

3.3 CNC-Fe比FeSO4更能提高葉綠素含量和光反應效率，增強杜梨葉片的光合能力

本研究中，T1 和T2 處理杜梨葉片SPAD 值分別比CK 顯著提高26.1%和61.7%，凈光合速率顯著提高70.1%和98.5%。轉(zhuǎn)錄組分析光合作用-天線蛋白和光合作用2 個通路中，T1 和T2 處理共有58 個基因上調(diào)，其中T2處理有56個基因表達量高于T1。以上說明，噴施CNC-Fe比FeSO4更能提高葉綠素含量和光反應效率，增強杜梨葉片的光合能力。

綜上可知，噴施CNC-Fe 能調(diào)動更多的基因和代謝通路，使其矯治梨樹缺鐵黃化癥的能力強于FeSO4。