許蘭杰，梁慧珍，余永亮，楊 青，楊紅旗，譚政委，董 薇，李 磊，安素妨，魯?shù)さ?/p>

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院芝麻研究中心，河南 鄭州 450002）

紅花（Carthamus tinctoriusL.）又名草紅花、金紅花或刺紅花，屬菊科1～2年生草本植物，在我國已有2 000 a 以上的栽培歷史。紅花耐旱、耐鹽堿、耐貧瘠、適應(yīng)能力強(qiáng)，是21 世紀(jì)藥油兼用的新型經(jīng)濟(jì)作物，主要分布于新疆、云南、河南、四川等地。紅花管狀花富含紅色素和黃色素，具有活血化瘀功效，還是一種天然的染料[1‐3]。紅花種子富含亞油酸，高達(dá)80%以上，被稱作亞油酸之王[4]。自20 世紀(jì)70 年代，我國開始紅花新品種選育工作，已審定或鑒定紅花品種30 多個(gè)。然而采用傳統(tǒng)育種方法培育一個(gè)紅花品種需要7～10 a，不僅耗時(shí)，而且費(fèi)工[5‐6]?；ㄋ幒托℃咦优囵B(yǎng)能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生胚狀體，獲得單倍體后可經(jīng)染色體加倍得到純合育種材料，加快育種進(jìn)程，單倍體育種已經(jīng)在小麥、大白菜等作物上取得成功并培育了新品種[7‐10]。

選擇正確的小孢子發(fā)育時(shí)期是花藥和小孢子離體培養(yǎng)成功的關(guān)鍵步驟之一。大多數(shù)植物小孢子離體培養(yǎng)的最佳時(shí)期為單核靠邊期[11‐15]。在對(duì)辣椒[16]、紫花苜蓿[17]和蕪菁[18]等多種植物的研究中發(fā)現(xiàn)，煙草以花蕾長(zhǎng)度和花藥長(zhǎng)度作為小孢子發(fā)育的形態(tài)指標(biāo)[19]；辣椒除了花蕾縱徑和橫徑外，還能以花藥長(zhǎng)度和花藥顏色作為小孢子發(fā)育的形態(tài)指標(biāo)[16]；蕪菁[18]和甘藍(lán)[20]以花蕾長(zhǎng)度作為鑒定小孢子發(fā)育的形態(tài)指標(biāo)，其中蕪菁花蕾長(zhǎng)度為2.50～2.99 mm[18]、甘藍(lán)花蕾長(zhǎng)度為4.50～5.49 mm[20]時(shí)小孢子處于單核靠邊期。紅花花器官形態(tài)與小孢子發(fā)育時(shí)期關(guān)系的研究未見報(bào)道，鑒于此，用顯微鏡鏡檢紅花小孢子不同發(fā)育時(shí)期的細(xì)胞學(xué)特征，研究小孢子發(fā)育時(shí)期與花器官形態(tài)特征之間的關(guān)系，選取最佳紅花花器官外觀指標(biāo)值來判斷小孢子所處的發(fā)育時(shí)期，為單倍體育種工作提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試8 個(gè)紅花品種（系）為豫紅花1 號(hào)、QS13、N129、W8、QS12、QS9、YNH1、N75，均由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院芝麻研究中心藥用植物研究室提供，將供試8 個(gè)品種（系）于2020 年12 月17 日種植于河南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究開發(fā)基地。每個(gè)品種（系）種植6 行，行長(zhǎng)4 m、行距0.4 m、株距0.2 m，常規(guī)田間管理[21]。在2021年5月11日（晴天）8：00左右采摘果球，放入冰盒，帶回實(shí)驗(yàn)室置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 紅花花器官形態(tài)特征測(cè)定 取大小不同的新鮮果球，采用數(shù)顯游標(biāo)卡尺測(cè)量果球直徑，記錄數(shù)據(jù)。去除果球外部苞片后，用鑷子取出管狀花，用數(shù)顯游標(biāo)卡尺測(cè)量管狀花長(zhǎng)度。

1.2.2 紅花小孢子發(fā)育時(shí)期細(xì)胞學(xué)特征觀察 取管狀花放到載玻片上，用移液槍加100～200 μL ddH2O，用干凈的圓底玻璃棒輕輕按壓管狀花上部花藥擠壓出小孢子，用鑷子去除管狀花組織殘?jiān)?，置于CX40 series biological microscope DPTOP 顯微鏡（舜宇光學(xué)科技有限公司）下觀察拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2013處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅花小孢子各發(fā)育時(shí)期的細(xì)胞學(xué)特征

8個(gè)紅花品種（系）生育期不同，同一時(shí)期取樣，其小孢子發(fā)育進(jìn)程不同，但小孢子各發(fā)育時(shí)期的細(xì)胞學(xué)特征一致。小孢子母細(xì)胞由胼胝質(zhì)包被，具較大細(xì)胞核（圖1A）。胼胝質(zhì)（Callose）是β-1,3葡聚糖的混合物，廣泛存在于有胚植物分裂細(xì)胞的細(xì)胞壁中[22]。小孢子母細(xì)胞的細(xì)胞核經(jīng)1 次減數(shù)分裂后，形成2個(gè)核，即為二分體（圖1B），二分體經(jīng)2次減數(shù)分裂變成四分體（圖1C），四分體被包圍在同一個(gè)胼胝質(zhì)中。隨著細(xì)胞外圍的胼胝質(zhì)消失，四分體由胼胝質(zhì)中散出，變成單核花粉粒。隨著紅花植株生長(zhǎng)發(fā)育，單核花粉粒經(jīng)歷單核早期、單核中期、單核靠邊期、雙核期等發(fā)育時(shí)期。

2.1.1 四分體時(shí)期 小孢子母細(xì)胞（花粉母細(xì)胞）經(jīng)減數(shù)分裂產(chǎn)生四分體，但是小孢子的體積相對(duì)較小，由胼胝質(zhì)包圍。在光學(xué)顯微鏡下可見紅花小孢子呈十字交叉形（圖2A）或四面體形四分體（圖

圖2 紅花小孢子四分體時(shí)期的細(xì)胞學(xué)特征Fig.2 Cytological characteristics of micro spore at tetrad stage in safflower

2B）。

2.1.2 單核早期 隨著紅花果球的生長(zhǎng)發(fā)育，四分體小孢子外圍的胼胝質(zhì)被酶分解，自共同胼胝質(zhì)壁中釋放出來4 個(gè)獨(dú)立雄配子體（圖3A）。剛分離的小孢子具有不規(guī)則的外形輪廓（圖3B），經(jīng)逐步發(fā)育小孢子由不規(guī)則形很快變成近圓形或圓形（圖3C），細(xì)胞學(xué)特征：小孢子細(xì)胞核較大，并位于細(xì)胞正中央，細(xì)胞質(zhì)中無明顯液泡，此時(shí)期為單核早期。

圖3 紅花小孢子由四分體時(shí)期到單核早期的細(xì)胞學(xué)特征Fig.3 Cytological characteristics microspore from tetrad stage to early-uninucleate stage in safflower

2.1.3 單核中期 隨著紅花果球逐漸膨大，單核早期（圖4A）小孢子胼胝質(zhì)壁外側(cè)凹陷，形成萌發(fā)孔原基。小孢子細(xì)胞核仍較大且位于細(xì)胞中央，細(xì)胞質(zhì)仍無可見的液泡，此時(shí)期為單核中期（圖4B）。

圖4 紅花小孢子單核早期到雙核期的細(xì)胞學(xué)特征Fig.4 Cytological characteristics of microspore from early-uninucleate stage to dikaryophase in safflower

2.1.4 單核靠邊期 隨著單核中期小孢子繼續(xù)發(fā)育，最明顯的細(xì)胞學(xué)特征為細(xì)胞核仍較大，細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)可見液泡。液泡逐漸增多且形成大液泡，大液泡將細(xì)胞核從中心位置擠壓到靠近細(xì)胞壁。細(xì)胞壁出現(xiàn)明顯的萌發(fā)孔（圖4C），此時(shí)為單核靠邊期，是大多數(shù)植物小孢子發(fā)育的最佳時(shí)期[11‐13]。

2.1.5 雙核期 隨著小孢子繼續(xù)發(fā)育經(jīng)過1次有絲分裂，形成1個(gè)營(yíng)養(yǎng)核和1個(gè)生殖核（圖4D）。其中，營(yíng)養(yǎng)核靠近液泡，生殖核貼近細(xì)胞壁，細(xì)胞形狀由圓形逐步變成橢圓形，細(xì)胞壁增厚，萌發(fā)孔外凸，發(fā)育為成熟花粉粒。

2.2 紅花花器官發(fā)育時(shí)期與果球形態(tài)特征關(guān)系

以豫紅花1 號(hào)為例，探尋紅花花器官發(fā)育時(shí)期與果球形態(tài)特征關(guān)系，具體見圖5。紅花果球（圖5A）主要由外部苞片（圖5B）和管狀花（圖5C 和5D）組成，豫紅花1 號(hào)單果球包含52～64 個(gè)苞片，花球由6 圈（80～100 個(gè)）管狀花組成。紅花管狀花由萼片、花藥、柱頭、花粉管和子房等組成。柱頭包含在花藥之間，呈圓柱形。隨著果球的生長(zhǎng)發(fā)育，管狀花長(zhǎng)度逐漸增長(zhǎng)，當(dāng)小孢子發(fā)育成熟后，柱頭由花藥內(nèi)部伸出，完成授粉過程（圖5E）。

圖5 豫紅花1號(hào)果球構(gòu)成及管狀花發(fā)育進(jìn)程Fig.5 Fruit structure and tubular flower development in Yuhonghua 1

對(duì)直徑為1.05 cm 的豫紅花1 號(hào)果球觀察分析發(fā)現(xiàn)，第1 圈管狀花長(zhǎng)度為0.50 cm，小孢子發(fā)育時(shí)期為單核靠邊期；第2—3 圈管狀花長(zhǎng)度為0.42～0.45 cm，小孢子發(fā)育時(shí)期為單核早中期；第4—6 圈管狀花為0.20～0.40 cm，小孢子發(fā)育時(shí)期均為四分體時(shí)期。同一果球同一圈管狀花的小孢子發(fā)育時(shí)期基本一致。

豫紅花1號(hào)果球直徑與管狀花長(zhǎng)度呈極顯著正相關(guān)（r=0.985，P<0.01）。由表1 可知，直徑為1.51、1.40、1.20、1.05、0.95、0.80 cm 的紅花果球管狀花（第1圈）小孢子發(fā)育時(shí)期分別為雙核期、雙核期、雙核期、單核靠邊期、單核早中期、四分體時(shí)期。

表1 豫紅花1號(hào)小孢子各發(fā)育時(shí)期果球直徑和管狀花長(zhǎng)度Tab.1 Fruit diameter and tubular flower length of Yuhonghua 1 at microspore development period cm

2.3 8個(gè)紅花品種（系）小孢子發(fā)育時(shí)期的花器官特征

8 個(gè)紅花品種（系）小孢子單核早中期、單核靠邊期、雙核期果球直徑在大部分品種（系）間差異達(dá)到極顯著水平，而管狀花長(zhǎng)度則表現(xiàn)為大部分品種（系）間差異未達(dá)到極顯著水平（表2）。單核早中期果球直徑為0.90～1.70 cm，單核靠邊期果球直徑為1.00～1.96 cm，雙核期果球直徑為1.05～2.20 cm。單核早中期管狀花長(zhǎng)度為0.37～0.45 cm，單核靠邊期管狀花長(zhǎng)度為0.45～0.50 cm，雙核期管狀花長(zhǎng)度為0.50～0.55 cm。

表2 紅花小孢子發(fā)育時(shí)期的果球特征Tab.2 Fruit characteristics at microspore development period in safflowercm

3 結(jié)論與討論

小孢子培養(yǎng)和花藥培養(yǎng)是植物雄核離體培養(yǎng)最主要的2 種方法，而準(zhǔn)確鑒定小孢子發(fā)育時(shí)期是小孢子培養(yǎng)成功的前提條件。植物小孢子發(fā)育是一個(gè)快速、連續(xù)、動(dòng)態(tài)的過程，大多數(shù)植物小孢子發(fā)育進(jìn)程包括小孢子母細(xì)胞時(shí)期、減數(shù)分裂期、四分體時(shí)期、單核早中期、單核靠邊期、雙核期和成熟花粉粒時(shí)期[11‐13]。本研究對(duì)不同發(fā)育時(shí)期紅花小孢子進(jìn)行細(xì)胞學(xué)特征觀察后發(fā)現(xiàn)，紅花小孢子發(fā)育時(shí)期主要包括四分體時(shí)期、單核早中期、單核靠邊期和雙核期，各發(fā)育時(shí)期細(xì)胞核的數(shù)量、位置等細(xì)胞學(xué)特征明顯，四分體形狀主要分為四面體形和十字交叉形，這與在其他植物上的研究結(jié)果相一致[11‐13]。觀察小孢子發(fā)育時(shí)期的染色方法有4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）熒光染液、中性紅、醋酸洋紅、堿性品紅、卡寶品紅染色法等，其中，醋酸洋紅和卡寶品紅染色法較常被應(yīng)用[11‐13，23‐25]。本研究在實(shí)際操作中，取新鮮果球，直接將管狀花置于ddH2O 溶液中用圓底玻璃棒按壓花藥，釋放小孢子，利用顯微鏡觀察分辨小孢子細(xì)胞學(xué)特征。

紅花屬菊科紅花屬經(jīng)濟(jì)作物，主莖和分枝頂端著生頭狀花序（果球），果球由許多管狀花聚集在花托上，外面包被數(shù)層苞片[26]。不同紅花品種（系）單株果球10～50 個(gè)，其中，以頂果球發(fā)育最早，其次是一級(jí)分枝果球、二級(jí)分枝果球和三級(jí)分枝果球。管狀花由萼片、花藥、柱頭、花粉管和子房組成。柱頭被包圍于花藥之中，呈圓柱形；當(dāng)柱頭從花藥頂部伸出后，完成授粉過程。單果球管狀花有6圈，每圈小孢子發(fā)育進(jìn)程不同；同一品種果球直徑與管狀花長(zhǎng)度呈極顯著相關(guān)，以直徑為1.05 cm 的豫紅花1號(hào)果球?yàn)槔旱?圈管狀花長(zhǎng)度為0.50 cm 時(shí)處于單核靠邊期；第2—3 圈管狀花長(zhǎng)度為0.42～0.45 cm 處于單核早中期；第4—6 圈管狀花長(zhǎng)度為0.20～0.40 cm時(shí)處于四分體時(shí)期。

為簡(jiǎn)化試驗(yàn)操作步驟，較多學(xué)者研究小孢子發(fā)育時(shí)期與花器官關(guān)系，以獲得小孢子離體培養(yǎng)最佳時(shí)期，避免顯微鏡逐個(gè)鏡檢，節(jié)省人力、物力。8 個(gè)紅花品種（系）小孢子單核早中期、單核靠邊期、雙核期果球直徑在大部分品種（系）間差異達(dá)到極顯著水平，而管狀花長(zhǎng)度則表現(xiàn)為大部分品種（系）間差異未達(dá)到極顯著水平。單核早中期果球直徑和管狀花長(zhǎng)度分別為0.90～1.70 cm和0.37～0.45 cm，單核靠邊期果球直徑和管狀花長(zhǎng)度分別為1.00～1.96 cm 和0.45～0.50 cm，因此，在實(shí)際紅花田間取材操作過程中，可先根據(jù)管狀花長(zhǎng)度判斷小孢子發(fā)育時(shí)期，再選擇直徑一致的果球開展紅花小孢子液體培養(yǎng)試驗(yàn)。

目前，在小麥等禾本科植物、大白菜等十字花科植物方面花藥和小孢子培養(yǎng)技術(shù)已取得了成功，其中，適宜的小孢子發(fā)育時(shí)期選擇是關(guān)鍵[7‐20]。小孢子所處發(fā)育時(shí)期過早，對(duì)啟動(dòng)雄核發(fā)育所需要的環(huán)境條件更為嚴(yán)苛，很難產(chǎn)生胚狀體；發(fā)育時(shí)期過晚，成熟花粉含有的激素水平不平衡，導(dǎo)致脫分化能力較差，也不能誘導(dǎo)成胚[7‐20]。不同植物最佳取材時(shí)期有差異，十字花科植物進(jìn)行小孢子培養(yǎng)的最佳時(shí)期是單核靠邊期[12，14‐15]，但也有研究表明懸浮培養(yǎng)中適量雙核期小孢子有助于出胚，但基因型不同要求雙核期小孢子所占比例不同[27‐28]。目前，國內(nèi)外尚未見紅花游離小孢子培養(yǎng)成功的報(bào)道，對(duì)于單核靠邊期是否是紅花小孢子培養(yǎng)的最佳時(shí)期還有待驗(yàn)證。若紅花小孢子培養(yǎng)誘導(dǎo)胚狀體的最佳時(shí)期以單核靠邊期為宜，就可以參考上述標(biāo)準(zhǔn)選取果球，以此免去制片鏡檢等煩瑣工作，實(shí)現(xiàn)田間準(zhǔn)確取材，提高小孢子培養(yǎng)效率，從而為構(gòu)建紅花游離小孢子培養(yǎng)體系奠定基礎(chǔ)。