邱競瑤，何 崗，白文鳳，金 麗*，張建坡

1.吉林化工學(xué)院 化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林 吉林 132022

2.吉林石化精細(xì)化學(xué)品廠，吉林 吉林 132022

孔雀石綠其實(shí)不含有孔雀石的成分，其得名是因?yàn)槎哳伾嗨贫?，孔雀石綠不僅是一種染料，還是可以殺真菌、細(xì)菌、寄生蟲的藥物，但它是一種有毒的三苯甲烷類化合物，長期過量食用具有致癌作用，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部明令禁止將孔雀石綠用于水產(chǎn)品之中。但是由于孔雀石綠對魚體和魚卵水霉病有特效，而市場上目前沒有可以短時(shí)間治愈水霉病的特效藥，因此水產(chǎn)業(yè)養(yǎng)殖戶仍會違規(guī)使用孔雀石綠。此外，在運(yùn)輸過程中，魚販也常使用孔雀石綠延長鱗受損魚的生命，因而市場上仍在售賣孔雀石綠。

近年來，不同的檢測方法被用于孔雀石綠的分析，例如表面增強(qiáng)拉曼法(SERS)[1]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[2-3]、免疫法[4]、電化學(xué)法[5]、熒光法[6-7]。其中熒光法具有快速、靈敏度高、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)。Ju等[8]利用雙波長金納米簇基于能量共振轉(zhuǎn)移對孔雀石綠進(jìn)行了檢測；Luo等[9]研發(fā)的RNA適配體可以與孔雀石綠特異性結(jié)合，實(shí)現(xiàn)熒光“關(guān)-開”檢測；Hu等[10]則采用Se、N、Cl摻雜碳點(diǎn)對孔雀石綠進(jìn)行了定量分析；周剛[11]基于QuEChERS方法，采用電噴霧正離子多反應(yīng)監(jiān)測模式，建立同時(shí)測定水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫及其代謝物殘留量的LC-MS/MS檢測方法；王蓓蓓等[12]建立了一種高效液相色譜法-串聯(lián)質(zhì)譜法，可適用于水產(chǎn)品中孔雀石綠和隱色孔雀石綠的測定；賴姝毓等[13]基于溶膠-凝膠法建立了孔雀石綠快速直讀顯色檢測與半定量方法；肖佳敏等[14]將富含多糖的內(nèi)源真菌Phyllostictacapitalensis的粉末菌劑作為生物吸附劑，可對孔雀石綠染料廢水進(jìn)行吸附處理。

液相色譜及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法雖然靈敏度較高，但是前處理步驟多，檢測成本高。目前的檢測技術(shù)手段或步驟煩瑣、耗時(shí)長，或方法不夠靈敏，不能達(dá)到理想的檢測效果。然而，基于量子點(diǎn)熒光猝滅法定量分析孔雀石綠相關(guān)的報(bào)道還比較少。因此，開發(fā)簡便、高效且成本低廉的檢測方法是未來發(fā)展方向。

作者以硫脲和檸檬酸為原料，在電爐上直接加熱，15 s快速合成出了發(fā)射藍(lán)光的氮硫摻雜的石墨烯量子點(diǎn)(N,S-GQDs)，最大發(fā)射波長為449 nm。進(jìn)一步研究了N,S-GQDs與孔雀石綠的相互作用，討論了檢出限的測定和猝滅反應(yīng)機(jī)理，得出N,S-GQDs熒光強(qiáng)度的降低與孔雀石綠的濃度呈正比例關(guān)系，建立了一種用于孔雀石綠定量的分析方法。本研究針對水中孔雀石綠殘留構(gòu)建的熒光探針法，在食品安全快速分析領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

孔雀石綠(ARS)：天津鼎盛鑫化工有限公司；硫脲和檸檬酸：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。所有試劑均為分析純，使用前未做任何處理。水為雙蒸水(>18 MΩ·cm)。

1.2 儀器與設(shè)備

F-280熒光分光光度計(jì)：天津港東科技發(fā)展股份有限公司；UV-2500紫外可見分光光度計(jì)：日本島津公司；FLS920穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀：海森堡公司；BWS465-532S拉曼光譜儀：必達(dá)泰克科技股份有限公司；Tecnai G220 電子顯微鏡：FEI公司；Thermos Scientific K-AlphaX 射線光電子能譜儀：廈門裕洲商貿(mào)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 氮硫摻雜石墨烯量子點(diǎn)的合成

根據(jù)文獻(xiàn)[15-16]的方法，并進(jìn)行了修改，具體如下：將0.4 g檸檬酸和硫脲混合物(質(zhì)量比1∶ 1)加入50 mL燒瓶中，在電爐上直接加熱2 min，直至混合物變?yōu)闇\黃色，超聲下加入10 mL氫氧化鈉溶液(濃度為0.3 mol/L，已加熱)。所得溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除大部分的水，80 ℃烘干2 h，得淺黃色晶體。稱質(zhì)量后，溶解(質(zhì)量濃度為5 mg/mL)，4 ℃保存。

1.3.2 氮硫摻雜石墨烯量子點(diǎn)用于孔雀石綠的定量分析

將10 μL孔雀石綠(濃度根據(jù)測試要求而定)加入60 μL N,S-GQDs中，定容至2 mL(pH=9)，室溫下孵育1 min，測得熒光發(fā)射光譜，激發(fā)波長370 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫都為5.0 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮硫摻雜石墨烯量子點(diǎn)的表征

采用透射電鏡對所合成的N,S-GQDs進(jìn)行表征，結(jié)果如圖1a所示。由圖1a可知，N,S-GQDs納米粒子分散比較均勻，為近球形，粒度范圍為2～8 nm。采用X射線光電子能譜(XPS)對N,S-GQDs中的元素和表面基團(tuán)進(jìn)行分析，結(jié)果如圖1b所示。由圖1b可知，XPS光譜在531、399、288、163 eV處的峰為O1s、N1s、C1s和S2p的特征峰，在化合物中各原子的含量依次為32.90%、12.94%、48.53%、5.62%，說明成功地將氮硫摻雜到石墨烯量子點(diǎn)中。

通過熒光光譜對N,S-GQDs的光學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了分析，測得在不同激發(fā)波長下(300～390 nm)的熒光發(fā)射波長。最大熒光發(fā)射波長未發(fā)生明顯的變化(圖2a)，但是熒光發(fā)射強(qiáng)度(圖2b)先增大后減小，這可能是因?yàn)榘l(fā)射位點(diǎn)的不同[17]，當(dāng)激發(fā)波長為 370 nm時(shí)熒光發(fā)射強(qiáng)度最大，最大熒光發(fā)射波長為 449 nm。

2.2 氮硫摻雜石墨烯量子點(diǎn)與孔雀石綠的相互作用的機(jī)理討論

將一系列濃度的孔雀石綠(MG)加入N,S-GQDs中，N,S-GQDs的最大熒光發(fā)射波長隨著MG濃度的增加而增大(發(fā)生紅移，從449 nm到530 nm)，而且N,S-GQDs的熒光發(fā)射強(qiáng)度也會隨之降低，熒光發(fā)射峰的形狀也發(fā)生了變化。

圖3 添加MG前后N,S-GQDs的熒光衰減曲線與不同濃度MG對N,S-GQDs的熒光發(fā)射光譜的影響

根據(jù)許金鉤的理論，猝滅劑(本文中為MG)可以引起熒光物質(zhì)(本文中為N,S-GQDs)熒光強(qiáng)度明顯的降低，該過程為熒光猝滅過程。猝滅劑對熒光物質(zhì)的熒光猝滅過程可分為靜態(tài)猝滅和動態(tài)猝滅[18]。通過變溫曲線測定、紫外吸收光譜繪制和計(jì)算，用以確定MG所引起的N,S-GQDs猝滅方式。如圖4所示，在20 ℃、30 ℃和40 ℃下，將一系列濃度的MG加到N,S-GQDs溶液后，N,S-GQDs熒光強(qiáng)度的降低(F0/F)仍與所加入MG的濃度成正比例關(guān)系。根據(jù)許金鉤提出的猝滅原理，熒光猝滅符合公式F0/F=1+Kqτ0M=1+KsvM，其中τ0代表N,S-GQDs的平均熒光壽命，M代表MG的濃度，Kq代表熒光衰減常數(shù)，Ksv代表回歸線的斜率。由圖4可知，隨著溫度的升高，回歸線的斜率隨之減小，這是靜態(tài)猝滅的特征之一。斜率隨著溫度升高而減小，這是因?yàn)闇囟壬咭鹋浜衔锏姆€(wěn)定度下降，從而減小靜態(tài)猝滅程度。測得熒光衰減曲線后(譜圖未給出)，通過平均加權(quán)計(jì)算法[19]得到了N,S-GQDs的τ0為5.05 ns。通過公式Kq=Ksv/τ0可得20 ℃、30 ℃和40 ℃時(shí)的Kq分別為2.015×1013、1.768×1013、1.612×1013mol·L-1·s-1，均大于最大靜態(tài)猝滅常數(shù)(2×1010mol·L-1·s-1)，這也與許金鉤提出的靜態(tài)猝滅的理論相符合。

圖4 不同溫度下MG的濃度和N,S-GQDs熒光強(qiáng)度的線性關(guān)系

此外，加入MG后N,S-GQDs的紫外吸收光譜(圖5)發(fā)生了明顯的變化，MG位于420 nm處的吸收峰發(fā)生明顯的增高，而且415 nm處出現(xiàn)新的吸收峰，該處的吸收峰會隨著MG濃度的增加而增大，如圖5插入圖所示。這些均符合靜態(tài)猝滅的特點(diǎn)，也說明N,S-GQDs和MG二者之間形成了復(fù)合物。綜上所述，MG所引起的N,S-GQDs熒光猝滅過程為靜態(tài)熒光猝滅過程。

圖5 N,S-GQDs添加MG前后的紫外吸收光譜

2.3 氮硫摻雜石墨烯量子點(diǎn)用于孔雀石綠的定量分析

為了進(jìn)一步應(yīng)用，優(yōu)化了pH值對該猝滅體系的影響。由圖6可知，pH值會引起該體系熒光強(qiáng)度較大的波動，通過反復(fù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)pH值為9時(shí)熒光強(qiáng)度比較穩(wěn)定，因而選擇pH值為9。此外，該體系隨著時(shí)間變化，熒光強(qiáng)度變化不大，為了使試驗(yàn)數(shù)據(jù)具有可比性，選擇孵育時(shí)間為1 min。為了操作方便，采用室溫作為孵育溫度。

圖6 溶液pH值對猝滅體系熒光強(qiáng)度的影響

在最優(yōu)條件下，測定該猝滅體系的最低檢出限，如圖7所示。MG濃度范圍為8.22～13.70 nmol/L時(shí)，回歸方程為F0/F=0.005 18M+0.963 8，根據(jù)文獻(xiàn)[20]計(jì)算可得最低檢出限為4.83 nmol/L(1.76 ng/mL)。此時(shí)所采用的N,S-GQDs質(zhì)量濃度為0.1 g/L，熒光激發(fā)狹縫為5 nm，發(fā)射狹縫為10 nm。由表1可知，與其他熒光檢測方法[6,7,9]相比，本研究方法具有更低的檢出限，雖然檢測范圍略窄，但是在實(shí)際樣品檢測中可以通過稀釋樣品溶液滿足測試的要求。雖然SERS[5]方法具有更低的檢出限，但是該方法用到了復(fù)合金的四氧化三鐵納米粒子，檢測成本遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于本方法。

圖7 不同濃度的MG與N,S-GQDs熒光強(qiáng)度(F0/F)的關(guān)系

表1 本研究和其他幾種檢測孔雀石綠的方法的比較

2.4 水樣品分析

將該熒光體系用于實(shí)際樣品的分析，水樣取自市場中養(yǎng)魚的水。通過向其中加入確定量的MG溶液得到待分析試樣，之后采用本熒光體系進(jìn)行定量分析。由表2可知，當(dāng)未加入MG時(shí)，采用本熒光體系未檢出MG的含量。當(dāng)不同量的MG被加入水樣中后，回收率為95.80%～116.30%，說明本方法可以用于樣品中MG的定量分析。

表2 水樣中MG含量分析

3 結(jié)論

研究了表面具有羧基、硫基和氨基的N,S-GQDs的快速合成方法。所合成材料粒徑為2～8 nm，分布比較均勻，結(jié)晶度良好，晶格間距0.33 nm。基于N,S-GQDs與MG之間存在靜態(tài)猝滅的過程，設(shè)計(jì)N,S-GQDs熒光探針，用于MG的定量分析，最低檢出限可達(dá)到4.83 nmol/L(1.76 ng/mL)。