張力凡，陳 潔，許 飛，汪 磊，易 熠

河南工業(yè)大學 糧油食品學院，河南 鄭州 450001

銀耳(Tremellafuciformis)，又名白木耳、雪耳等，是一種分布廣泛的真菌。銀耳呈膠狀，顏色大多為白色或淡黃色，已發(fā)展成為中國和亞洲其他國家最受歡迎的栽培真菌之一[1]，目前我國以福建古田銀耳和四川通江銀耳最為出名，其中福建省古田縣銀耳栽種歷史悠久，是銀耳之鄉(xiāng)。其栽種的銀耳品相好、品質(zhì)優(yōu)良、營養(yǎng)價值高，古田銀耳更是中國食用菌行業(yè)中的第一個馳名商標，獲得了中國地理標志保護產(chǎn)品稱號[2]。

銀耳具有較高的營養(yǎng)價值及藥用價值。近年來，隨著對銀耳研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)銀耳諸多的功能均與銀耳多糖有關(guān)。銀耳多糖是一種主要以甘露糖為主鏈的酸性雜多糖，含量占銀耳的60%～70%，具有抗腫瘤[3]、抗氧化[4]、降血糖[5]及降血脂[6]等作用。劉培勛等[7]提取銀耳多糖并對其抗氧化活性進行研究，通過清除超氧陰離子自由基、清除ABTS自由基、抗過氧化氫誘導的紅細胞氧化溶血試驗，證明其具有一定的清除氧自由基、ABTS自由基能力和抑制紅細胞溶血活性的功效。田春雨等[8]研究發(fā)現(xiàn)，銀耳多糖能有效地降低2型糖尿病模型大鼠的血糖,調(diào)節(jié)血脂。薄海美等[9]通過試驗證明銀耳多糖具有明顯的降低糖尿病大鼠血糖和血漿HbAlc含量、增加Ins分泌的作用,改善胰島素抵抗。

銀耳多糖的提取方法為熱水提取法[10]、酸堿提取法[11]及酶提取法[12]等。酸堿會在一定程度上影響多糖的結(jié)構(gòu)，而酶的成本相對較高，熱水提取法則能較大程度上保留多糖的原有結(jié)構(gòu)，操作也較為簡便，但提取時間相對較長。故選取熱水提取法進行粗多糖的提取。

目前，大多數(shù)學者均聚焦于銀耳多糖的生物活性研究，對提取多糖的銀耳品種研究相對較少。作者選取福建古田新鮮銀耳制成的干料，研究銀耳粗多糖的提取工藝及其理化性質(zhì)、功能活性，通過與現(xiàn)有研究結(jié)果的對比來展示福建古田銀耳提取的粗多糖在得率、總糖含量、抗氧化活性等方面的優(yōu)勢。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

銀耳：福建古田。

α-淀粉酶(50 U/mg)、pNPG(對硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷)、膽固醇、水合膽酸鈉、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼、α-D-葡萄糖苷(10 U/mg)、D-葡萄糖醛酸、間羥聯(lián)苯均購買于Macklin；阿卡波糖購買于Sigma-Aldrich。試驗所用試劑和化學品均為分析純。

1.2 儀器與設備

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；冷凍干燥機：北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；ICS 3000離子色譜系統(tǒng)：美國Thermo Fisher Scientific公司；高效液相色譜儀：美國Agilent公司；傅里葉紅外光譜儀：美國Thermo Scientific公司；紫外分光光度計：北京普析有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 銀耳粗多糖制備工藝流程

銀耳粉末→熱水提取→上清液減壓濃縮→脫蛋白、減壓濃縮→醇沉→沉淀復溶于蒸餾水→透析→冷凍干燥→銀耳粗多糖。

對液料比、提取溫度、提取時間進行單因素試驗，在此基礎上進行三因素三水平正交試驗進一步優(yōu)化提取工藝。

1.3.2 基本成分測定

總糖含量測定：采用苯酚-硫酸法，參照文獻[13]。蛋白質(zhì)含量測定：采用考馬斯亮藍法，參照文獻[12]。糖醛酸含量測定：采用間羥聯(lián)苯比色法，參照文獻[14]。

1.3.3 單糖組成測定

使用ICS 3000離子色譜系統(tǒng)測定銀耳粗多糖單糖組成，具體步驟參考文獻[15]中的方法。

1.3.4 分子量測定

通過高效液相色譜儀測定銀耳粗多糖分子量，具體步驟參考文獻[15]中的方法。

1.3.5 傅里葉紅外光譜測定

稱取5 mg銀耳粗多糖樣品，放入研缽中并加入KBr進行研磨，充分混勻后采用壓片法放入機器內(nèi)進行測試，在400～4 000 cm-1的區(qū)間內(nèi)進行掃描。

1.3.6 抗氧化活性測定

1.3.6.1 DPPH自由基清除能力

參考文獻[15]中的方法。取各濃度的樣品溶液2 mL與2 mL DPPH 溶液(75 μmol/L)均勻混合，室溫下避光反應1 h后在517 nm處測定吸光度，Vc為對照。計算公式如下。

式中：A樣品、A本底對照和A空白分別代表樣品、本底對照(甲醇溶液替代DPPH溶液)及空白對照(蒸餾水代替樣品)的吸光度。按照以上公式計算清除率，以銀耳粗多糖質(zhì)量濃度作為橫坐標，清除率作為縱坐標，計算自由基清除率為50%時的銀耳粗多糖質(zhì)量濃度，即半抑制率(IC50)，下同。

1.3.6.2 ABTS自由基清除能力

參考文獻[16]中的方法。在734 nm 波長下測定吸光度，VC為對照。

式中：A空白為空白對照(蒸餾水替代樣品溶液)的吸光度；A樣品為樣品溶液的吸光度。

1.3.6.3 羥基自由基清除能力

參考文獻[12]中的方法。于510 nm波長處測定吸光度。

式中：Ac表示空白對照(蒸餾水代替H2O2溶液)的吸光度；Ai表示樣品溶液的吸光度；Aj表示不加H2O2溶液的本底對照吸光度。

1.3.7 銀耳粗多糖對α-淀粉酶的抑制作用

參考文獻[17]中的方法。在540 nm 波長處測定吸光度，以阿卡波糖為對照。

式中：Asample表示銀耳粗多糖、酶及淀粉混合液的吸光度；Acontrol-1表示將緩沖溶液代替酶溶液后混合液的吸光度；Acontrol-2表示將緩沖溶液代替樣品溶液后混合液的吸光度。

1.3.8 銀耳粗多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

參考文獻[18]中的方法。于405 nm波長處測定吸光度，以阿卡波糖為對照。

式中：Asample表示銀耳粗多糖、酶及pPNG混合液的吸光度；Acontrol-1表示將緩沖溶液替代酶溶液后混合物的吸光度；Acontrol-2表示將緩沖溶液替代樣品溶液后混合液的吸光度。

1.3.9 銀耳粗多糖體外膽固醇結(jié)合能力的測定

參考文獻[19]中的方法。取0.1 g樣品與10 mL膽固醇標準溶液(1 mg/mL)均勻混合，37 ℃放置1 h，8 000 r/min離心30 min，取4 mL上清液，在560 nm處測定吸光度。由標準曲線計算膽固醇含量，膽固醇結(jié)合率(CBC)計算如下。

式中：C1表示膽固醇結(jié)合前的質(zhì)量，g；C2表示膽固醇結(jié)合后的質(zhì)量，g；W1表示樣品質(zhì)量，g。

1.3.10 銀耳粗多糖體外膽酸鈉結(jié)合能力的測定

參考文獻[20]中的方法。在387 nm波長處測定吸光度，從標準曲線中得出膽酸鈉濃度，膽酸鈉結(jié)合率計算如下。

式中：C表示從標準曲線中得出的膽酸鈉濃度，mmol/L；V表示上清液體積，mL；4表示膽酸鈉濃度與所用體積(mL)的乘積，mmol。

1.3.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

每個樣品進行3次平行試驗，結(jié)果以平均值±標準差表示。采用Excel進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計、SPSS進行數(shù)據(jù)分析、Origin 2017進行圖像繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 銀耳粗多糖熱水提取方法分析

2.1.1 單因素試驗結(jié)果

固定提取溫度(90 ℃)、提取時間(3 h)，考察液料比對銀耳粗多糖得率的影響，結(jié)果如圖1a所示。由圖1a可知，當液料比(mL/g)從40∶ 1變化至70∶ 1時，粗多糖得率從9.11%升高至17.57%，在70∶ 1處達到最大值。說明液料比過高或者過低均不利于銀耳粗多糖的提取，液料比較低時，原料未充分吸水，提取液較為黏稠，會增加抽濾過程中的操作難度[21]；液料比較高時，原料雖充分吸水，但較多的提取液對后續(xù)工藝會產(chǎn)生一定的負擔，造成成本增加及能源的損耗[22]。因此以70∶ 1為最佳液料比。

固定液料比70∶ 1、提取時間3 h，考察提取溫度對銀耳粗多糖得率的影響，結(jié)果如圖1b所示。由圖1b可以看出,銀耳粗多糖得率隨溫度的升高先升高后降低，在90 ℃達最大值17.57%。說明溫度過高會降低粗多糖得率，過高的溫度可能導致多糖的性質(zhì)及分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，同時還可能會使一些其他物質(zhì)溶出[22]；溫度過低則可能多糖未充分溶出，致使得率較低。因此，選擇90 ℃作為粗多糖提取的最佳溫度。

固定液料比70∶ 1、提取溫度90 ℃，考察提取時間對銀耳粗多糖得率的影響，結(jié)果如圖1c所示。由圖1c可以看出，隨著提取時間的增加，粗多糖得率從10.94%增加到17.98%，在4 h后增加趨勢有所減緩。說明4 h時粗多糖的提取已較為充分；提取時間較短時，水與銀耳未充分接觸，致使提取不夠充分，得率較低[22]。結(jié)合實際生產(chǎn)，選擇4 h為最佳提取時間。

注：不同小寫字母表示具有顯著差異(P<0.05)，相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)。圖4和圖5同。

2.1.2 正交試驗結(jié)果

根據(jù)上述單因素試驗，以液料比、提取溫度、提取時間為影響因素，進行三因素三水平的正交試驗，因素與水平見表1，試驗結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表1 正交試驗因素與水平

由表2可以看出，各因素影響銀耳粗多糖提取得率的主次順序為A(液料比)>B(提取溫度)>C(提取時間)。從表3可看出，僅液料比對銀耳粗多糖得率影響顯著(P<0.05)，說明極差分析結(jié)果與方差分析結(jié)果相一致。銀耳粗多糖提取的最佳工藝組合為A3B2C2，即液料比為70∶ 1，提取溫度為90 ℃，提取時間為4 h。以此條件進行試驗，粗多糖得率達19.06%，因此選擇液料比70∶ 1、提取溫度90 ℃、提取時間4 h為銀耳粗多糖最佳提取工藝。Chen[23]從西安購入銀耳，并利用熱水提取法進行銀耳粗多糖的提取，粗多糖得率為3.05%；余華等[24]選用四川通江產(chǎn)地的銀耳200 g，利用熱水提取法進行粗多糖的提取，制得粗多糖10.57 g，得率為5.29%；周帥飛等[10]選用山東濟南所產(chǎn)銀耳，采取熱水提取法提取銀耳粗多糖，得率為16.81%?？烧f明使用熱水提取法，福建古田銀耳提取的粗多糖得率較高。

表2 正交試驗結(jié)果

表3 正交試驗方差分析

2.2 銀耳粗多糖結(jié)構(gòu)特性分析

2.2.1 化學組成

銀耳粗多糖化學組成如表4所示，可看出粗提物中多糖是主要成分?？偺呛繛?0.56%，高于國內(nèi)部分產(chǎn)地銀耳粗多糖的總糖含量，如馬素云[14]選用浙江產(chǎn)地的銀耳，采用熱水提取法得到銀耳粗多糖，并用苯酚-硫酸法測得粗多糖總糖含量為39.1%；Zhang等[25]選用四川產(chǎn)地的銀耳，熱水提取銀耳粗多糖，苯酚-硫酸法測得其總糖含量為47.63%；鄧佳穎[26]選用浙江產(chǎn)地的銀耳，苯酚-硫酸法測得銀耳粗多糖中總糖含量為55.42%。蛋白質(zhì)含量偏低說明脫蛋白操作中蛋白脫除得較為干凈，提取效果較好。糖醛酸則是一種酸性的黏多糖。單糖組成試驗結(jié)果顯示，銀耳粗多糖主要由巖藻糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、葡萄糖醛酸組成，其中甘露糖的摩爾分數(shù)最大(49.50%)，半乳糖的摩爾分數(shù)最小(1.20%)。

表4 銀耳粗多糖化學組成

2.2.2 分子量分布

采用高效凝膠滲透色譜法測定銀耳粗多糖的分子量分布，如圖2所示。采用普魯蘭系列標準品建立的分子量標準曲線方程為lgMw=-0.198 5x+12.509，R2=0.996 4。由圖2可看出，銀耳粗多糖含有兩個分子量分布不同的粗多糖，出峰時間分別是29.3 min、40.1 min。經(jīng)計算分析出它們的平均分子量分別約為4.86×106和3.70×104。Zhang等[25]選用四川產(chǎn)地的銀耳，熱水提取銀耳粗多糖，測得粗多糖平均分子量為6.00×105。

圖2 銀耳粗多糖分子量分布

2.2.3 紅外光譜分析

圖3 銀耳粗多糖的傅里葉紅外光譜圖

2.3 銀耳粗多糖功能特性分析

2.3.1 抗氧化活性分析

銀耳粗多糖對DPPH、ABTS和羥基自由基清除率的影響如圖4所示。從圖4a可看出，隨著銀耳粗多糖質(zhì)量濃度的增加，銀耳粗多糖清除DPPH自由基的能力逐步增強，當粗多糖質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL時，其對DPPH自由基的清除率達56.80%。銀耳粗多糖和Vc清除DPPH自由基的IC50分別為0.05 mg/mL和0.02 mg/mL。本結(jié)果低于魏華等[28]、Wu等[29]、吳振等[30]的試驗結(jié)果。魏華等[28]選用的銀耳購于南京，利用熱水提取法制備銀耳粗多糖，測得其在質(zhì)量濃度為6.4 mg/mL時, 對DPPH的清除率接近42%；Wu等[29]選用的銀耳購于廣州，測得銀耳粗多糖質(zhì)量濃度在0.05 mg/mL時，對DPPH自由基的清除率小于50%；吳振等[30]選用的銀耳采于重慶市黔江區(qū)，熱水提取得到銀耳粗多糖，粗多糖清除DPPH自由基的IC50為1.64 mg/mL。

由圖4b可以看出，銀耳粗多糖質(zhì)量濃度在0.5～2.5 mg/mL時，對ABTS自由基的清除率從21.76%升高至68.22%。銀耳粗多糖和Vc清除ABTS自由基的IC50分別為1.72 mg/mL和0.05 mg/mL。

由圖4c可看出，隨著粗多糖質(zhì)量濃度的升高，銀耳粗多糖清除羥基自由基的能力逐漸增強，但低于同質(zhì)量濃度范圍內(nèi)Vc的清除能力。銀耳粗多糖和Vc清除羥基自由基的IC50分別為0.14 mg/mL和0.07 mg/mL，略低于張磊等[31]、Zhang等[25]的試驗結(jié)果。張磊等[31]選用的銀耳購于山東，熱水提取得銀耳粗多糖，測得當粗多糖質(zhì)量濃度在0.50 mg/mL時，對羥基自由基清除率為10.36%；Zhang等[25]選用四川產(chǎn)地的銀耳，熱水法制備粗多糖，測得當粗多糖質(zhì)量濃度在0.20 mg/mL時，對羥基自由基清除率低于50%。上述數(shù)據(jù)說明古田銀耳提取的銀耳粗多糖具有一定的DPPH、ABTS、羥基自由基清除能力，清除率與粗多糖質(zhì)量濃度呈一定的正相關(guān)，且抗氧化活性略高于其他產(chǎn)地提取的粗多糖。

圖4 銀耳粗多糖對DPPH、ABTS和羥基自由基清除能力的影響

2.3.2 銀耳粗多糖對α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的抑制作用

銀耳粗多糖對α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的抑制作用如圖5所示。由圖5a可看出,銀耳粗多糖對α-淀粉酶的抑制作用隨著銀耳粗多糖質(zhì)量濃度的升高而逐步增強。銀耳粗多糖與阿卡波糖抑制α-淀粉酶的IC50分別為1.09 mg/mL和3.02 μg/mL。

由圖5b可看出，隨著銀耳粗多糖質(zhì)量濃度的升高，其對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率增大；同時，銀耳粗多糖抑制α-葡萄糖苷酶的IC50為4.15 mg/mL，小于對照組阿卡波糖的4.47 mg/mL。說明銀耳粗多糖對α-葡萄糖苷酶的活性具有較強的抑制作用。因此，銀耳粗多糖具有一定的降血糖作用。

圖5 銀耳粗多糖對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

2.3.3 銀耳粗多糖體外結(jié)合膽固醇、膽酸鈉能力的測定

銀耳粗多糖體外膽固醇、膽酸鈉結(jié)合率如表5所示。根據(jù)試驗數(shù)據(jù)計算得出膽固醇標準曲線方程：y=4.808x+0.125 7，R2=0.995 1。通過標準曲線計算出銀耳粗多糖膽固醇結(jié)合率為16.96%，對照組纖維素的膽固醇結(jié)合率為15.72%，可見銀耳粗多糖具有較強的膽固醇結(jié)合能力。銀耳粗多糖體外膽酸鈉結(jié)合率為51.41%，略低于對照組纖維素，其與膽酸鈉結(jié)合率為57.25%，說明銀耳粗多糖具有一定的膽酸鈉結(jié)合能力，以上兩個數(shù)據(jù)表明銀耳粗多糖具有一定的降血脂能力。

表5 銀耳粗多糖體外膽固醇、膽酸鈉結(jié)合率

3 結(jié)論

選用福建古田新鮮銀耳制成的干料為原料，在單因素試驗的基礎上，用正交試驗對銀耳粗多糖提取條件進行了優(yōu)化，得出熱水法最佳提取工藝為液料比70∶ 1 (mL/g)、提取溫度90 ℃、提取時間4 h，此條件下的粗多糖得率為19.06%。利用最佳工藝提取粗多糖，試驗得出銀耳粗多糖主要含有兩個組分，其平均分子量約為4.86×106和3.70×104，總糖含量80.56%。銀耳粗多糖主要含有巖藻糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖和葡萄糖醛酸6種單糖，其摩爾分數(shù)分別為11.20%、1.20%、15.00%、15.30%、49.50%、7.70%。紅外光譜分析表明，3 399 cm-1、2 932 cm-1及1 420 cm-1處的特征峰說明銀耳粗多糖是一種酸性雜多糖。銀耳粗多糖具有一定的抗氧化、降血糖和降血脂能力。銀耳粗多糖清除DPPH、ABTS、羥基自由基的IC50分別為0.05、1.72、0.14 mg/mL。銀耳粗多糖抑制α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的IC50分別為1.09、4.15 mg/mL，銀耳粗多糖體外膽固醇結(jié)合率16.96%、膽酸鈉結(jié)合率51.41%。與現(xiàn)有研究結(jié)果對比可知，選用福建古田銀耳進行熱水提取粗多糖，得率、總糖含量等略高于其他產(chǎn)地銀耳，同時也能較大程度地發(fā)揮其生物活性，為后續(xù)將銀耳粗多糖應用到食品中奠定了一定的基礎。