陳 鑫，李錦峰，陳艷炯，郭昱成

1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)系，陜西西安 710061；西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院：2.口腔醫(yī)學(xué)檢測(cè)中心；3.頜面外科；4.正畸科，陜西西安 710004

口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)是頭頸部最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率占頭頸部惡性腫瘤的90%，其5年生存率相對(duì)較低，約為50%。導(dǎo)致OSCC的危險(xiǎn)因素包括吸煙、大量飲酒、口腔衛(wèi)生差、不健康飲食和微生物感染[1]。由于OSCC的全球患病率增加，其發(fā)生機(jī)制還未清楚，因此需要進(jìn)行深入的多因素分析以了解OSCC發(fā)生的潛在機(jī)制，以及與其他風(fēng)險(xiǎn)因素(尤其是生物病原體)的可能關(guān)聯(lián)[2]。口腔中存在600多種微生物，其最主要的種類(lèi)是假絲酵母菌、擬桿菌、變形桿菌和放線(xiàn)菌[3]。假絲酵母菌是一種二倍體無(wú)性酵母菌，屬于機(jī)會(huì)致病菌，其導(dǎo)致的口腔疾病包括口腔扁平苔蘚、口腔念珠菌病和纖維上皮息肉[4]。正常情況下，微生物在宿主中平衡存在，這種平衡的破壞可引起宿主免疫反應(yīng)，從而可能導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[5]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，長(zhǎng)期暴露于微生物和(或)其產(chǎn)物(內(nèi)毒素、蛋白酶、膠原酶、纖維蛋白溶酶、磷脂酶等)可對(duì)宿主細(xì)胞造成損害，并可能誘導(dǎo)突變，影響細(xì)胞的信號(hào)通路、增殖和凋亡。本研究旨在了解從OSCC患者口腔中分離出的假絲酵母菌的生物膜形成能力及其毒力因子(蛋白酶、磷脂酶、溶血性和酯酶)活性。比較OSCC和健康人假絲酵母菌菌株之間毒力因子的差異，進(jìn)一步揭示假絲酵母菌在OSCC中的致病機(jī)制，為OSCC的診斷、治療奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2018年1月至2020年10月就診于西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院的100例OSCC患者，無(wú)手術(shù)、放化療及其他輔助治療史，所有病例均經(jīng)組織病理學(xué)確診，作為OSCC組。同時(shí)收集該院體檢的年齡與性別相匹配的100例健康人作為對(duì)照組。OSCC組年齡為31～85歲，平均(60.2±11.3)歲，對(duì)照組年齡為26～78歲，平均(59.1±12.4)歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：最近使用含有抗真菌劑的漱口水或藥物的患者、人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)陽(yáng)性患者、糖尿病患者。

1.2儀器與試劑 恒溫培養(yǎng)箱(天津泰斯特)、酶免分析儀(深圳雷杜)。葡萄糖、結(jié)晶紫、亞甲藍(lán)購(gòu)于天津科密歐公司。腦心浸出液肉湯、PBS緩沖液、卵黃乳液、牛血清清蛋白購(gòu)于青島高科海博。MH瓊脂、麥?zhǔn)媳葷峁苜?gòu)于溫州康泰公司。蛋白胨、瓊脂粉購(gòu)于北京奧博星。CaCl2、K2HPO4、吐溫80購(gòu)于天津天力公司。酵母膏粉購(gòu)于杭州天和公司。血瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)于安圖生物。標(biāo)準(zhǔn)菌株白念珠菌ATCC 90028、近平滑念珠菌ATCC 22019購(gòu)于溫州康泰公司。使用文獻(xiàn)[6]中的方法配制牛血清清蛋白培養(yǎng)基、卵黃瓊脂培養(yǎng)基[7]、吐溫80瓊脂培養(yǎng)基[8]及0.5%的結(jié)晶紫儲(chǔ)存液。

1.3方法

1.3.1菌株分離鑒定 所有研究對(duì)象標(biāo)本采集前漱口，采用無(wú)菌拭子收集標(biāo)本，OSCC組收集病灶區(qū)域標(biāo)本，對(duì)照組采集頰黏膜標(biāo)本。標(biāo)本接種于沙保弱瓊脂培養(yǎng)基，于25～30 ℃孵育5～7 d，對(duì)分離的可疑菌落采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間生物質(zhì)譜儀(德國(guó)布魯克)進(jìn)行鑒定。

1.3.24種毒力因子活性檢測(cè) 配制濃度為1麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙?，?0 μL滴于牛血清清蛋白瓊脂培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基倒置放入培養(yǎng)箱，經(jīng)35 ℃、4 d培養(yǎng)檢測(cè)磷脂酶活性。取10 μL滴于卵黃瓊脂培養(yǎng)基，經(jīng)35 ℃、7 d培養(yǎng)檢測(cè)蛋白酶活性。取10 μL滴于吐溫80瓊脂培養(yǎng)基，經(jīng)35 ℃、5 d培養(yǎng)檢測(cè)酯酶活性[9]。取10 μL滴于血瓊脂培養(yǎng)基，經(jīng)35 ℃、48 h培養(yǎng)檢測(cè)溶血活性。試驗(yàn)以白念珠菌ATCC 90028測(cè)定結(jié)果作為陽(yáng)性對(duì)照，近平滑念珠菌ATCC 22019測(cè)定結(jié)果作為陰性對(duì)照。結(jié)果判讀：達(dá)到培養(yǎng)時(shí)間后，平板上菌落周?chē)鷷?huì)出現(xiàn)沉淀圈或透明圈，量取菌落直徑與沉淀區(qū)直徑，并將其計(jì)算為菌落直徑與沉淀區(qū)直徑之比。酶活性的測(cè)定是基于酶活性指數(shù)(EAI),根據(jù)EAI指數(shù)確定活動(dòng)范圍：EAI≤0.99表示產(chǎn)此活性，EAI=1,表示不產(chǎn)此活性[10-11]。

1.3.3生物膜檢測(cè) 采用結(jié)晶紫染色法檢測(cè)其生物膜的形成。將培養(yǎng)液加入96孔板中,使用酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm波長(zhǎng)的吸光度 (A570)，吸光度大于臨界值的樣品為陽(yáng)性，吸光度小于或等于臨界值的樣品為陰性[12]。試驗(yàn)以不含微生物的無(wú)菌BHIB作為陰性對(duì)照，所有試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用LSD-t檢驗(yàn)和單因素方差分析(ANOVA)比較OSCC組與對(duì)照組及不同分離菌種屬之間毒力因子的差異。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1假絲酵母菌菌種檢出情況分布 OSCC組標(biāo)本分離出假絲酵母菌82株，明顯高于對(duì)照組的24株，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。OSCC組和對(duì)照組分離率最高的均為白假絲酵母菌。OSCC組白假絲酵母菌59株(72.0%)、熱帶假絲酵母菌8株(9.7%)、近平滑假絲酵母菌7株(8.5%)、克柔假絲酵母菌5株(6.1%)、杜氏假絲酵母菌3株(3.7%)，且存在9株混合感染，包括2株白假絲酵母菌和熱帶假絲酵母菌混合感染、2株白假絲酵母菌和近平滑假絲酵母菌混合感染、2例近平滑假絲酵母菌和熱帶假絲酵母菌混合感染、3株杜氏假絲酵母菌和熱帶假絲酵母菌混合感染。對(duì)照組檢出白假絲酵母菌[20株(83.3%)]和克柔假絲酵母菌[4株(16.7%)]。

2.2兩組分離株毒力因子的比較 OSCC組不同假絲酵母菌均產(chǎn)生蛋白酶、酯酶、溶血活性及生物膜。兩組標(biāo)本分離的假絲酵母菌產(chǎn)生的磷脂酶活性、蛋白酶活性、酯酶活性、溶血活性及生物膜形成能力進(jìn)行比較，結(jié)果顯示：OSCC組磷脂酶活性平均EAI(0.685)低于對(duì)照組(0.852),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；OSCC組蛋白酶活性平均EAI(0.733)低于對(duì)照組(0.883),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；OSCC組溶血活性平均EAI(0.585)低于對(duì)照組(0.674),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；OSCC組酯酶活性平均EAI(0.714)與對(duì)照組(0.708)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；OSCC組吸光度(2.032)明顯比對(duì)照組(1.017)低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1～5。

表1 兩組不同假絲酵母菌磷脂酶活性比較[n(%)]

表2 兩組不同假絲酵母菌蛋白酶活性比較[n(%)]

表3 兩組不同假絲酵母菌酯酶活性比較[n(%)]

表4 兩組不同假絲酵母菌溶血活性比較[n(%)]

表5 兩組不同假絲酵母菌生物膜比較[n(%)]

2.3不同分離株之間毒力因子比較 在所研究的假絲酵母菌中杜氏假絲酵母菌沒(méi)有磷脂酶活性，將OSCC組中分離出的5種假絲酵母菌毒力因子進(jìn)行比較，不同菌種間的磷脂酶活性、蛋白酶活性、酯酶活性、溶血活性及生物膜形成能力比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表6。

表6 OSCC組中不同假絲酵母菌毒力因子比較(平均EAI/吸光度)

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，OSCC患者口腔中定植的酵母菌具有多樣性，其中白假絲酵母菌的定植率最高，其他依次是熱帶假絲酵母菌及近平滑假絲酵母菌。白假絲酵母菌的存在被認(rèn)為是OSCC的重要危險(xiǎn)因素，但也需要關(guān)注非白假絲酵母菌對(duì)疾病的影響。白假絲酵母菌是一種機(jī)會(huì)致病菌，可通過(guò)攻擊宿主細(xì)胞導(dǎo)致疾病的發(fā)生，其在某些條件下會(huì)引起口腔疾病，尤其是在機(jī)體抵抗力下降時(shí)[13]。酵母菌致病性被認(rèn)為是一個(gè)多因素過(guò)程，其可通過(guò)毒力因子的侵襲機(jī)制參與感染的發(fā)生和發(fā)展[14]。

酵母菌的致病性可歸因于各種毒力因子，如可黏附宿主表面的磷脂酶、蛋白酶、酯酶，其黏附宿主的過(guò)程可調(diào)節(jié)酵母菌在宿主中的定植，同時(shí)這些毒力因子的分泌導(dǎo)致黏膜屏障受損，有助于感染及侵襲的發(fā)生[15]。在本研究中，幾乎所有的OSCC患者口腔中酵母菌都具有磷脂酶、蛋白酶活性，且此兩種酶活性高于健康人，對(duì)照組分離菌株中檢測(cè)出的蛋白酶活性和磷脂酶活性明顯低于OSCC組，表明這些因子在疾病的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。本研究結(jié)果顯示，OSCC組酯酶活性平均EAI與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。OSCC組溶血活性平均EAI低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，可能是不同酵母菌產(chǎn)生的溶血素酶導(dǎo)致從紅細(xì)胞釋放的鐵所致。

酵母菌從孢子到菌絲的形態(tài)轉(zhuǎn)換被認(rèn)為是侵入宿主細(xì)胞的毒力因素。白假絲酵母菌產(chǎn)生的生物膜促進(jìn)了菌絲的廣泛生長(zhǎng)，并成為侵入性酵母菌感染的來(lái)源。微生物黏附是生物膜形成的第一步，酵母菌特別是白假絲酵母菌，通過(guò)與上皮細(xì)胞的互相作用在疾病的發(fā)展中起重要作用，從而導(dǎo)致上皮細(xì)胞侵襲性表現(xiàn)[16]。當(dāng)白假絲酵母菌產(chǎn)生生物膜時(shí)，很有可能發(fā)生上述作用。

綜上所述，OSCC患者口腔分離的假絲酵母菌菌株具多樣性，且分離株的磷脂酶活性、蛋白酶活性、溶血活性、生物膜形成能力均高于健康人，為酵母菌的致病性與疾病損害嚴(yán)重程度之間的聯(lián)系提供了證據(jù)。本研究提示酵母菌在OSCC的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，但酵母菌的具體致癌分子機(jī)制尚需要進(jìn)一步研究，以明確宿主與酵母菌之間的多重復(fù)雜作用，為其進(jìn)一步診斷、治療奠定了基礎(chǔ)。