姚 旭，詹秀秀，劉 闖*，張子柯,2

(1.杭州師范大學(xué)阿里巴巴復(fù)雜科學(xué)研究中心 杭州 311121；2.浙江大學(xué)媒體與國(guó)際文化學(xué)院 杭州 310018)

隨著人口的增長(zhǎng)及老齡化，惡性腫瘤(即癌癥)已經(jīng)成為人類死亡主要原因之一，是威脅生命健康的最大因素[1]。腫瘤癌變是環(huán)境因素和遺傳因素引起基因突變?cè)斐傻?，識(shí)別癌癥的致病基因?qū)τ诰_腫瘤學(xué)至關(guān)重要，并且能夠促進(jìn)靶向藥物的開(kāi)發(fā)，對(duì)癌癥的治療具有指導(dǎo)意義[2-4]。

隨著第二代測(cè)序技術(shù)普及，以及人類基因組計(jì)劃、TCGA 計(jì)劃和ICGC 計(jì)劃的推進(jìn)，研究者從大規(guī)模測(cè)序分析結(jié)果中明確了腫瘤存在著廣泛的異質(zhì)性[5]。分布在不同患者個(gè)體中或者同一患者體內(nèi)不同部位中的同種惡性腫瘤細(xì)胞，會(huì)產(chǎn)生從基因型到表型上的差異，相應(yīng)地表現(xiàn)為多樣的基因突變[6]。高通量的測(cè)序數(shù)據(jù)使得科學(xué)家能從蛋白質(zhì)水平中揭示腫瘤細(xì)胞發(fā)生機(jī)制，驗(yàn)證腫瘤的相關(guān)基因突變，在癌癥中的應(yīng)用有著廣泛的前景。文獻(xiàn)[7]證明了乳腺癌的蛋白質(zhì)組學(xué)分析能夠解讀體細(xì)胞突變，縮小了缺失和擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)驅(qū)動(dòng)基因的候選提名范圍，并發(fā)現(xiàn)了相關(guān)治療靶標(biāo)。文獻(xiàn)[8]從蛋白質(zhì)組學(xué)研究入手，發(fā)現(xiàn)了白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor,LIF)是介導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞和星狀細(xì)胞之間信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵因子，并驗(yàn)證了其可以作為胰腺癌治療的靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物。

然而，面對(duì)龐大的腫瘤數(shù)據(jù)，精準(zhǔn)地找到腫瘤關(guān)鍵基因仍面臨著挑戰(zhàn)，僅從生物學(xué)角度研究腫瘤關(guān)鍵基因是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。如今，癌癥這個(gè)復(fù)雜疾病又被稱為“網(wǎng)絡(luò)疾病”，可以從網(wǎng)絡(luò)的角度對(duì)生物學(xué)進(jìn)行研究[9-10]。網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)可以代表生物分子，其相應(yīng)的邊可以看作生物分子之間的功能、物理或化學(xué)相互作用[10]。因此，挖掘腫瘤的致病關(guān)鍵基因，找到潛在的控制疾病進(jìn)展的靶點(diǎn)，可以從網(wǎng)絡(luò)控制入手。復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的控制理論和方法源于經(jīng)典控制理論與復(fù)雜系統(tǒng)研究的結(jié)合，如果網(wǎng)絡(luò)中的一部分節(jié)點(diǎn)能夠在有限時(shí)間內(nèi)將網(wǎng)絡(luò)從任意初始狀態(tài)變?yōu)槿我馄谕淖罱K狀態(tài)，則該網(wǎng)絡(luò)稱為可控網(wǎng)絡(luò)[10-11]。文獻(xiàn)[12]在復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)可控性方面做出了開(kāi)拓性的研究，將網(wǎng)絡(luò)的可控性簡(jiǎn)化為判定網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可控性的問(wèn)題，即忽略網(wǎng)絡(luò)中系統(tǒng)矩陣的邊權(quán)，只需關(guān)注系統(tǒng)內(nèi)部的結(jié)構(gòu)框架及節(jié)點(diǎn)間的連接方式。然而，文獻(xiàn)[12]提出的最大匹配算法只適合在有向網(wǎng)絡(luò)中尋找控制節(jié)點(diǎn)。為了應(yīng)用于無(wú)向網(wǎng)絡(luò)，文獻(xiàn)[13]提出了最小控制集(minimum dominating set,MDS)方法，并發(fā)現(xiàn)MDS 方法在無(wú)標(biāo)度網(wǎng)絡(luò)中只需要較小比例的節(jié)點(diǎn)就可以覆蓋控制網(wǎng)絡(luò)，并且網(wǎng)絡(luò)度分布的異質(zhì)性越強(qiáng)，就越容易控制整個(gè)系統(tǒng)。

如今，復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)控制理論已被廣泛應(yīng)用到各種生物網(wǎng)絡(luò)分析中。文獻(xiàn)[14]在有向人類蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中應(yīng)用最大匹配算法[12]確定了最小驅(qū)動(dòng)蛋白集合，根據(jù)移除驅(qū)動(dòng)節(jié)點(diǎn)后所包含的驅(qū)動(dòng)節(jié)點(diǎn)數(shù)，對(duì)基因進(jìn)行分類。此外，同時(shí)發(fā)現(xiàn)該可控性分析在疾病基因以及藥物靶點(diǎn)上的有關(guān)鍵作用。文獻(xiàn)[15]利用MDS 方法研究了蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的可控性，并確定了驅(qū)動(dòng)蛋白集，分析表明該集合富含必需基因、癌癥相關(guān)基因以及病毒靶向基因，并且這些集合在網(wǎng)絡(luò)調(diào)控(富含轉(zhuǎn)錄因子和蛋白激酶)中有著重要作用。文獻(xiàn)[16]在MDS 模型的基礎(chǔ)上提出了一種中心性校正的最小支配集(centrality corrected-MDS,CC-MDS)模型，該模型比MDS 模型能夠捕獲更多的驅(qū)動(dòng)蛋白。文獻(xiàn)[17]利用網(wǎng)絡(luò)的無(wú)標(biāo)度特性算法[18]巧妙地避開(kāi)了MDS 計(jì)算的復(fù)雜性，利用MDS各個(gè)解集中元素的角色，將節(jié)點(diǎn)分為3 類并應(yīng)用于蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中，首次捕捉到了基因結(jié)構(gòu)可控性、基因致死性和動(dòng)態(tài)共表達(dá)的同步性之間的直接聯(lián)系。雖然網(wǎng)絡(luò)控制的方法可以捕捉生物網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)蛋白及重要的相關(guān)調(diào)控功能，但是其對(duì)于各類癌癥中腫瘤關(guān)鍵基因識(shí)別預(yù)測(cè)方面還未得到分析驗(yàn)證。

本研究利用復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)控制理論的思想，從蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(protein protein interaction network,PPI)入手，通過(guò)對(duì)腫瘤發(fā)生的不同階段PPI 的變化進(jìn)行分析，對(duì)腫瘤關(guān)鍵基因進(jìn)行預(yù)測(cè)研究，可以闡明腫瘤蛋白表達(dá)水平的變化與腫瘤發(fā)生發(fā)展的相互關(guān)系及其規(guī)律。檢測(cè)、分析和確定腫瘤不同時(shí)期的標(biāo)志蛋白，可以作為抗癌藥物篩選的作用靶點(diǎn)。該應(yīng)用不僅對(duì)抗癌藥物發(fā)現(xiàn)具有指導(dǎo)意義，還可形成未來(lái)腫瘤診斷學(xué)、治療學(xué)的基礎(chǔ)理論。

1 研究方法

1.1 腫瘤關(guān)鍵基因預(yù)測(cè)分析流程

為了預(yù)測(cè)對(duì)腫瘤發(fā)展具有關(guān)鍵影響的基因，本文將復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)控制理論應(yīng)用于人類相互作用蛋白數(shù)據(jù)中，結(jié)合控制集和復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)湫再|(zhì)，對(duì)蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中的基因進(jìn)行了篩選，并對(duì)最終預(yù)測(cè)的腫瘤關(guān)鍵基因進(jìn)行了有效的驗(yàn)證。圖1 描述了腫瘤關(guān)鍵基因預(yù)測(cè)分析的流程，主要包含3 個(gè)步驟：1)通過(guò)最小控制集和控制分類模型將蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)中的基因進(jìn)行分類；2)對(duì)得到的各分類中的基因集合利用綜合中心性進(jìn)行排序，進(jìn)行富集分析，篩選出最終可用來(lái)預(yù)測(cè)的腫瘤關(guān)鍵基因；3)將得到的腫瘤關(guān)鍵基因，通過(guò)突變數(shù)據(jù)及相應(yīng)的文獻(xiàn)分析，證明預(yù)測(cè)的腫瘤關(guān)鍵基因?qū)δ[瘤發(fā)展的影響力。Z_score 衡量的是觀測(cè)值與平均值間的差異，p指的是在假設(shè)檢驗(yàn)中，當(dāng)原假設(shè)為真時(shí)所得到的樣本觀察結(jié)果或更極端的結(jié)果出現(xiàn)的概率。

圖1 腫瘤關(guān)鍵基因預(yù)測(cè)分析流程

1.2 最大連通子圖

假設(shè)G=(V,E)表 示一個(gè)無(wú)向圖，其中V={v1,v2,···,vn}為G的 節(jié)點(diǎn)集，N為無(wú)向圖中節(jié)點(diǎn)的個(gè)數(shù)，E為G的 邊集。如果從頂點(diǎn)vi到 頂點(diǎn)vj中有路徑存在，則稱vi和vj連 通。存在子圖G′，如果其中的任意兩個(gè)頂點(diǎn)之間都連通并且為連通的子圖中最大的一個(gè)圖，則該圖G′為 無(wú)向圖G的最大連通子圖。

在蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中，節(jié)點(diǎn)代表蛋白質(zhì)，邊代表兩個(gè)蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系。其最大連通子圖就是蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中的最大的一個(gè)連通網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)中任意兩個(gè)蛋白質(zhì)之間都能夠直接(或間接)相連通。

1.3 最小控制集模型

圖G=(V,E)中 存在一個(gè)節(jié)點(diǎn)集S?V，如果節(jié)點(diǎn)vi∈V，其要么是節(jié)點(diǎn)集S的一部分，要么與節(jié)點(diǎn)集S里一個(gè)元素相鄰，則稱這樣的節(jié)點(diǎn)集S為控制集(如圖1a 中間網(wǎng)絡(luò)中的紅色方形節(jié)點(diǎn))?？刂萍疭里的這些節(jié)點(diǎn)是圖1a 中的最優(yōu)節(jié)點(diǎn)集，它對(duì)整個(gè)圖的結(jié)構(gòu)有著支撐作用，除此之外的每個(gè)節(jié)點(diǎn)都能夠通過(guò)一條連邊與控制集S里的一個(gè)節(jié)點(diǎn)相連。本文定義在圖G的所有可能的控制集當(dāng)中節(jié)點(diǎn)數(shù)最少的集合為MDS。

MDS 的概念屬于圖的控制理論。由于控制問(wèn)題是經(jīng)典的NP 完全問(wèn)題，要解決這個(gè)未知能否在多項(xiàng)式時(shí)間內(nèi)求解的問(wèn)題，需要把它歸結(jié)為一個(gè)二進(jìn)制的整數(shù)規(guī)劃問(wèn)題(integer linear programming,ILP)來(lái)計(jì)算。本文通過(guò)尋找二進(jìn)制向量x來(lái)最小化具有線性約束下的線性函數(shù)f(x)。圖G=(V,E)中每個(gè)節(jié)點(diǎn)vi的都有一個(gè)值為0 或1 的二進(jìn)制整數(shù)變量xi，屬于控制集的節(jié)點(diǎn)的二進(jìn)制變量取值為1，否則為0。于是，線性函數(shù)f(x)的約束表示為：

并且滿足約束：

式中，N(i)表 示節(jié)點(diǎn)vi的 鄰居；而n是圖中的節(jié)點(diǎn)總數(shù)。

最小控制集能夠提供對(duì)整個(gè)網(wǎng)絡(luò)起控制作用的節(jié)點(diǎn)集。蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中的這些最小控制集，能夠通過(guò)其相互作用影響整個(gè)PPI 網(wǎng)絡(luò)。解決最小控制集這個(gè)二進(jìn)制整數(shù)規(guī)劃問(wèn)題，可以利用分支限界算法來(lái)尋找這二進(jìn)制線性函數(shù)約束問(wèn)題的最優(yōu)解。

1.4 控制分類模型

在一個(gè)連通的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中，尋找控制基因集的最優(yōu)解，往往會(huì)有多種符合最優(yōu)解的解決方案。單純地將其中的一個(gè)最小控制基因集作用于復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)中，并不能確定始終能夠影響整個(gè)網(wǎng)絡(luò)的一些關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的角色(即對(duì)整個(gè)癌癥網(wǎng)絡(luò)有確定影響的基因集)，因此需要對(duì)集合進(jìn)行進(jìn)一步的分類。為了解決這個(gè)問(wèn)題，文獻(xiàn)[13,17]根據(jù)每個(gè)節(jié)點(diǎn)在不同配置中參與的角色，提出了分類算法，構(gòu)建了控制分類模型：始終存在于配置方案的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)(critical)、從不參與任何配置方案的冗余節(jié)點(diǎn)(redundant)、屬于某些配置方案但不存在于其他配置方案的間歇性節(jié)點(diǎn)(intermittent)。這3 類節(jié)點(diǎn)分別對(duì)應(yīng)著圖1a 右側(cè)網(wǎng)絡(luò)的紅色、藍(lán)色和紫色的圓形節(jié)點(diǎn)。為了優(yōu)化計(jì)算速度，文獻(xiàn)[13,17]在分類之前利用所證實(shí)的推論，對(duì)網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)進(jìn)行了預(yù)處理，利用拓?fù)湫再|(zhì)提前確定了一些節(jié)點(diǎn)的類型。

推論1 關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)推論。如果節(jié)點(diǎn)vi有兩個(gè)或兩個(gè)以上的度為1 的鄰居結(jié)點(diǎn)，那么這個(gè)節(jié)點(diǎn)vi被定義為一個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。

推論2 冗余節(jié)點(diǎn)推論。如果節(jié)點(diǎn)vi所有的鄰居結(jié)點(diǎn)都是關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，那么這個(gè)節(jié)點(diǎn)vi被定義為一個(gè)冗余節(jié)點(diǎn)。

本文整合了該控制分類模型，并將網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)進(jìn)行了分類，算法流程如下所示。

算法1 節(jié)點(diǎn)的控制分類

輸入：節(jié)點(diǎn)集V、邊集E

輸出：關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)集Gcritical、冗余節(jié)點(diǎn)集Gredundant、間歇性節(jié)點(diǎn)集Gintermittent

利用控制分類模型，將蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中的基因從復(fù)雜的相互作用關(guān)系中分類出3 部分，每部分集合中的基因之間對(duì)網(wǎng)絡(luò)控制的作用相同。

1.5 綜合中心性

文獻(xiàn)[19]提出的中心性-致命性規(guī)則指出，蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中高度連接的蛋白質(zhì)往往是必不可少的。中心性是衡量網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)重要性的重要指標(biāo)，能夠刻畫(huà)節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的地位。如度中心性描述了一個(gè)節(jié)點(diǎn)對(duì)其他節(jié)點(diǎn)的直接影響；介數(shù)中心性刻畫(huà)了經(jīng)過(guò)一個(gè)節(jié)點(diǎn)的最短路徑數(shù)，表明這個(gè)節(jié)點(diǎn)對(duì)網(wǎng)絡(luò)最短傳輸?shù)目刂屏?；接近中心性反映了一個(gè)節(jié)點(diǎn)與其他節(jié)點(diǎn)之間的接近程度，此節(jié)點(diǎn)可以通過(guò)鄰居節(jié)點(diǎn)能夠迅速地覆蓋到整個(gè)網(wǎng)絡(luò)。綜合中心性是通過(guò)加權(quán)的方法，將度中心性、介數(shù)中心性、接近中心性歸一化，并結(jié)合起來(lái)衡量節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的綜合表現(xiàn)。為了精確地篩選腫瘤基因集中的更為關(guān)鍵的基因，本文利用綜合中心性來(lái)衡量基因?qū)ι锞W(wǎng)絡(luò)的重要程度，并對(duì)從蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中分離出來(lái)的腫瘤基因集進(jìn)行了排序。相關(guān)中心性的定義為：

式中，Cd(vi)表 示節(jié)點(diǎn)vi的 度中心性；ki表示節(jié)點(diǎn)vi的 鄰居節(jié)點(diǎn)的數(shù)目；N表示節(jié)點(diǎn)個(gè)數(shù)；N?1指節(jié)點(diǎn)可能的最大度值。

式中，Cb(vi) 表 示節(jié)點(diǎn)vi的介數(shù)中心性；σs,t表示節(jié)點(diǎn)s與節(jié)點(diǎn)t之 間最短路徑總數(shù)；σs,t(i)表 示節(jié)點(diǎn)s與節(jié)點(diǎn)t之間經(jīng)過(guò)節(jié)點(diǎn)vi的最短路徑數(shù)目。

式中，Ccl(vi)表 示節(jié)點(diǎn)vi的 接近中心性；d(vi,vj)表示節(jié)點(diǎn)vi與節(jié)點(diǎn)vj的距離。

式中，Cintgr(vi)表 示節(jié)點(diǎn)vi的 綜合中心性；Cd,max,Cb,max,Ccl,max分 別為{Cd},{Cb},{Ccl}中的最大值。

2 數(shù) 據(jù)

2.1 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

本文首先整合了多個(gè)人類蛋白-蛋白互作數(shù)據(jù)庫(kù)的PPI 數(shù)據(jù)(包含InnateDB[20]、PINA[21]、BioGrid[22]及HINT[23]等)，刪除其中重復(fù)的邊和自環(huán)，構(gòu)成了由15 474 個(gè)蛋白形成的170 631 條邊的網(wǎng)絡(luò)。本文從TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)[24]中收集了包括乳腺癌(BRCA)、腎透明細(xì)胞癌(KIRC)、肺腺癌(LUAD)、結(jié)腸腺癌(COAD)和頭頸鱗狀細(xì)胞癌(HNSC)在內(nèi)的5 種癌癥類型及其相應(yīng)的正常樣本的RNA-Seq (RPKM)數(shù)據(jù)，對(duì)于每個(gè)基因?qū)?，?jì)算其共表達(dá)的皮爾森相關(guān)系數(shù)及相應(yīng)的p值。將不同的癌癥類型的共表達(dá)關(guān)系嵌入到PPI 網(wǎng)絡(luò)中，選擇顯著的連邊(p<0.05)構(gòu)成癌癥特異性蛋白-蛋白網(wǎng)絡(luò)[25]。

2.2 生物通路數(shù)據(jù)

本文從WiKiPathways 代謝通路數(shù)據(jù)庫(kù)[26]中收集了上述5 種癌癥類型的生物通路數(shù)據(jù)集，并利用一些已知與癌癥相關(guān)的生物通路，進(jìn)一步得到每個(gè)與癌癥相關(guān)的生物通路的基因集，這些基因?qū)Ω魃锕δ芷鹬{(diào)控作用。

2.3 顯著基因集

本文收集了SMG (significantly mutated genes)[3],CGC (cancer gene census)[27]這兩個(gè)腫瘤基因集，這些基因集的基因在癌癥變化發(fā)展中所起到的重要作用都已被廣泛證實(shí)。

2.4 突變數(shù)據(jù)集

本文從TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載了上述5 種癌癥類型的腫瘤病人的體細(xì)胞突變數(shù)據(jù)。

3 實(shí)驗(yàn)與分析

3.1 基于網(wǎng)絡(luò)控制理論的基因分類

本文對(duì)TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中的5 種癌癥類型的蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)進(jìn)行了處理，從中提取出了具有顯著意義的連邊(即p<0.05)，并利用最大連通子圖的定義，剔除了一些在網(wǎng)絡(luò)中最大連通子圖之外的小簇基因集，重構(gòu)了蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，各個(gè)網(wǎng)絡(luò)的統(tǒng)征如表1 所示。

表1 腫瘤不同階段的最大連通子圖的節(jié)點(diǎn)連邊情況

為了從各個(gè)階段復(fù)雜的蛋白質(zhì)相互作用對(duì)中，找到對(duì)腫瘤發(fā)展具有關(guān)鍵影響的基因集，本文利用復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)控制理論中的最小控制集模型，并通過(guò)控制分類模型將各癌癥網(wǎng)絡(luò)各階段的基因進(jìn)行了分類，研究這些基因?qū)W(wǎng)絡(luò)產(chǎn)生的具體影響。通過(guò)方法1.3 和1.4，得出了各癌癥網(wǎng)絡(luò)各階段的3 種類型的基因集：關(guān)鍵(critical)基因集、間歇性(intermittent)基因集、冗余(redundant)基因集，其包含的基因情況如表2 所示。從最小控制集模型和控制分類模型的定義中，可以了解到關(guān)鍵基因集中的基因是滿足所有最小控制集配置方案的集合，即不管最小控制集的配置如何變化，這些基因始終包含在控制集中，其他非控制集中的基因都可以通過(guò)這些基因相互作用而到達(dá)。因此，關(guān)鍵基因集這一分類更有可能符合對(duì)腫瘤關(guān)鍵基因的研究預(yù)測(cè)集合的預(yù)期，于是本文提出了一個(gè)猜想：關(guān)鍵基因集中的基因能夠控制影響腫瘤的變化發(fā)展，在腫瘤突變中較為顯著。

表2 各腫瘤不同階段的基因分類個(gè)數(shù)

3.2 腫瘤關(guān)鍵基因集的篩選

為了驗(yàn)證本文的猜想，即關(guān)鍵基因集所包含的基因?qū)Π┌Y發(fā)展的影響顯著明顯于其他兩種類型的基因集，本文將獲取的癌癥相關(guān)的生物通路數(shù)據(jù)集和顯著基因集與這3 種類型的基因集進(jìn)行了富集分析。顯著基因集包含了CGC 基因集和SMG 基因集，它們所涉及的基因已被廣泛地被證實(shí)對(duì)癌癥具有重要影響；生物通路數(shù)據(jù)集中包含了多個(gè)與癌癥相關(guān)的生物功能作用，每個(gè)功能都有與其作用相關(guān)的基因組。結(jié)合并利用上述數(shù)據(jù)，分析3 種類型的基因集合在其中的富集情況，評(píng)估它們預(yù)測(cè)癌癥關(guān)鍵基因的性能。本文從網(wǎng)絡(luò)中隨機(jī)生成了10 000次與3 種類型基因集同等大小的集合作為參考，并與獲取的數(shù)據(jù)集做了交集，來(lái)衡量這3 種類型基因集相對(duì)于隨機(jī)基因集的顯著程度。本文利用了ZScore 值來(lái)表示3 種基因集的顯著性，圖2 顯示了腫瘤樣本Tumor 的3 種類別的基因集在共有的7 種生物通路功能和顯著基因集(SMG 和CGC)的富集程度(正常樣本Normal 的富集情況與其類似)。圖中橫坐標(biāo)中C 表示critical；I 表示intermittent；R 表示redundant，縱坐標(biāo)中AG 表示angiogenesis；CC 表示cell cycle；DDR 表示DNA damage response；ICP 表示integrated cancer pathway；MR 表示mismatch repair；SPIG 表示signaling pathways in glioblastoma；TN 表示TP53 network。從圖中可以看到：關(guān)鍵基因集具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，富集度明顯優(yōu)于間歇性基因集、冗余基因集。結(jié)果表明，關(guān)鍵基因集能夠很好地解釋其在生物通路(血管生成、細(xì)胞周期、DNA損傷反應(yīng)、綜合癌癥通路、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤信號(hào)通路、TP53 通路)上的重要程度，以及富含癌癥驅(qū)動(dòng)基因的良好表現(xiàn)。在本階段工作中，本文從復(fù)雜的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中初步篩選出了腫瘤關(guān)鍵基因集，使得本文可以從該基礎(chǔ)上進(jìn)一步地縮小規(guī)模，預(yù)測(cè)更為重要的腫瘤關(guān)鍵基因。

圖2 5 種癌癥Tumor 階段各類集合富集分析

對(duì)各類癌癥的多階段的關(guān)鍵基因集的作用情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，如圖3 所示，發(fā)現(xiàn)上述分類統(tǒng)計(jì)的腫瘤關(guān)鍵基因在整體中占比相近。為了進(jìn)一步挖掘可預(yù)測(cè)的關(guān)鍵基因，本文利用顯著基因集(SMG,CGC)對(duì)這3 個(gè)部分進(jìn)行富集占比分析，評(píng)估各個(gè)部分在腫瘤的突變過(guò)程中的作用效果，最終篩選出對(duì)腫瘤突變產(chǎn)生至關(guān)影響的部分。圖4 給出了各癌癥不同的集合在這兩個(gè)顯著基因集中的不同占比情況，可以發(fā)現(xiàn)：僅在Tumor 階段為關(guān)鍵基因的集合(Tumor-Normal)更具有研究意義，其存在于顯著基因集的占比在大多數(shù)情況下(BRCA、COAD、HNSC、KIRC、LUAD)都要優(yōu)于另外兩個(gè)交集集合。相比顯著基因集在Normal 或者Tumor 中的占比，除了個(gè)別情況外(存在于癌癥的COAD、HNSC 集合中顯著基因集CGC 的占比)，僅在Tumor 階段為關(guān)鍵基因的集合所存在的比例仍優(yōu)于前者?？紤]到單階段(Normal 或Tumor)的關(guān)鍵基因集，不能反應(yīng)腫瘤在突變過(guò)程的變化，解釋不了其基因的突變以及對(duì)整個(gè)癌癥的影響趨勢(shì)，綜合Normal、Tumor 兩個(gè)階段選擇的關(guān)鍵基因集的研究要優(yōu)于單階段的關(guān)鍵基因集。圖4 的COAD、HNSC 中，Normal 階段的關(guān)鍵基因集與僅在Tumor階段為關(guān)鍵基因的集合的比例相差在0.5%內(nèi)，但這并不影響本文對(duì)結(jié)果(僅在Tumor 階段為關(guān)鍵基因的集合)的選擇。

圖3 5 種癌癥類型Normal 階段和Tumor 階段關(guān)鍵基因集的韋恩圖

圖4 各癌癥各階段各部分的關(guān)鍵基因集與SMG、CGC 基因的占比情況

3.3 腫瘤關(guān)鍵基因分析

上述研究工作對(duì)腫瘤關(guān)鍵基因集進(jìn)行了篩選，最終選擇了僅存在于Tumor 階段(Tumor-Normal)的腫瘤關(guān)鍵基因集，用于對(duì)驅(qū)動(dòng)癌癥發(fā)展及突變的關(guān)鍵基因的預(yù)測(cè)。本文綜合了復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的度量指標(biāo)，利用綜合中心性對(duì)最終的關(guān)鍵基因集按照分?jǐn)?shù)進(jìn)行降序排列，排名較高的基因更有可能驅(qū)動(dòng)癌癥的發(fā)展，可作為潛在的靶點(diǎn)基因。接著利用SMG、CGC 顯著基因集，排除了已知被廣泛證實(shí)有驅(qū)動(dòng)作用的一些關(guān)鍵基因。最后，對(duì)剩下的關(guān)鍵基因進(jìn)行了分析，同時(shí)來(lái)驗(yàn)證本文所預(yù)測(cè)的未知的驅(qū)動(dòng)基因在癌癥發(fā)展變化過(guò)程中的顯著表現(xiàn)。

在乳腺癌(BRCA)的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中，本文選取了綜合中心性排名靠前的SIRT7 基因作為驗(yàn)證。圖5a 描述了SIRT7 的鄰居節(jié)點(diǎn)中SMG、CGC 基因的富集程度。為了排除一般基因(通常表現(xiàn)為低度)對(duì)結(jié)果的影響，實(shí)驗(yàn)選取了排名在前40%的度較高的基因作為參考標(biāo)準(zhǔn)。其中圖5a 中的紅色標(biāo)記為SIRT7 的鄰居中SMG 和CGC 的基因個(gè)數(shù)，紫色標(biāo)記則為其他參考基因集與顯著基因集的交集基因分布情況。本文將交集個(gè)數(shù)大于等于觀察值的基因與總體的占比作為顯著性檢驗(yàn)(p)的衡量標(biāo)準(zhǔn)。從結(jié)果可以看出，SIRT7 基因的鄰居節(jié)點(diǎn)相對(duì)于其他基因的鄰居節(jié)點(diǎn)，在兩個(gè)顯著基因集中都顯著富集(SMG 下p為4.73×10?3，CGC 下p為8.76×10?4)。實(shí)驗(yàn)證明，SIRT7 對(duì)腫瘤網(wǎng)絡(luò)的控制有著重要作用，不僅從它作用性質(zhì)的角度，而且可以通過(guò)它本身的突變帶動(dòng)其周圍鄰居基因的突變，同時(shí)這些鄰居基因中富集了與癌癥相關(guān)的顯著基因。圖5b 展示了SIRT7 和它的鄰居基因的總體突變分布，其突變分布在T 檢驗(yàn)中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=2.20×10?28)，突變頻率明顯大于整體，在癌癥中具有較高的突變頻次。先前有實(shí)驗(yàn)研究表明SIRT7 的表達(dá)可作為乳腺癌的預(yù)后生物標(biāo)志物[28-29]。深圳大學(xué)健康科學(xué)中心的研究人員發(fā)現(xiàn)，SIRT7 與乳腺癌肺轉(zhuǎn)移相關(guān)，SIRT7 通過(guò)轉(zhuǎn)化因子?β 信號(hào)調(diào)節(jié)EMT，能夠抑制乳腺癌向肺部的轉(zhuǎn)移，提供了有效的乳腺癌轉(zhuǎn)移治療策略[28]。深圳大學(xué)附屬第一醫(yī)院的研究人員發(fā)現(xiàn)，SIRT7 可能是乳腺癌瘤體免疫浸潤(rùn)相關(guān)的預(yù)后生物標(biāo)志物[29]。

圖5 乳腺癌中的SIRT7 基因的重要性分析

在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(HNSC)的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中，本文選擇了ETS1 基因作為驗(yàn)證，圖6a描述了ETS1 基因的鄰居為SMG、CGC 基因的情況，結(jié)果表明ETS1 的鄰居顯著基因數(shù)要明顯多于所參考的基因集(SMG 下p為1.66×10?2,CGC 下p為4.56×10?2)，這也驗(yàn)證了基因的度中心性較高的基因更有可能與更多的顯著基因相鄰。ETS1 基因在癌癥中的表達(dá)變化，影響著與其相關(guān)的顯著基因，在發(fā)生癌變的過(guò)程中擔(dān)任著重要角色。圖6b顯示了ETS1 基因和它的鄰居相對(duì)于蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中所有基因及其鄰居的表現(xiàn)情況，結(jié)果表明ETS1 基因以及它的鄰居的突變分布要高于網(wǎng)絡(luò)整體水平(p=3.49×10?4)，可作為致頭頸癌產(chǎn)生癌變的關(guān)鍵基因。已有研究表明ETS1可以作為治療頭頸癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)[30-31]。美國(guó)紐約州立大學(xué)的研究人員發(fā)現(xiàn)ETS1 是頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的生物標(biāo)志物，它在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中的過(guò)度表達(dá)與預(yù)后不良相關(guān)，并且是關(guān)鍵上皮性向間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)基因的主要調(diào)節(jié)因子，為腫瘤亞型特異性的靶向治療提供新途徑[30]。文獻(xiàn)[31]發(fā)現(xiàn)SRC-ETS1生存通路的上調(diào)與頭頸部鱗狀細(xì)胞癌HNSC 的細(xì)胞增殖、存活、遷移、侵襲和順鉑耐藥有關(guān)。

圖6 頭頸癌中的ETS1 基因的重要性分析

4 結(jié)束語(yǔ)

網(wǎng)絡(luò)控制理論能夠揭示預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)的相互作用機(jī)制，能夠從復(fù)雜的生物網(wǎng)絡(luò)中識(shí)別出腫瘤關(guān)鍵基因，為癌癥的藥物設(shè)計(jì)及預(yù)后生物標(biāo)志物預(yù)測(cè)提供了很好的借鑒。本文利用復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)控制理論的方法對(duì)來(lái)自TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中5 種癌癥網(wǎng)絡(luò)腫瘤基因進(jìn)行了分類篩選，并結(jié)合腫瘤基因在兩個(gè)階段中的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)相互作用情況，進(jìn)一步確認(rèn)了腫瘤的關(guān)鍵基因集合。利用網(wǎng)絡(luò)的綜合中心性，除去已知被證實(shí)為顯著基因，對(duì)其他腫瘤關(guān)鍵基因集進(jìn)行排序，得到潛在的腫瘤關(guān)鍵基因。通過(guò)驗(yàn)證研究分析，在網(wǎng)絡(luò)中具有生物學(xué)統(tǒng)計(jì)意義的關(guān)鍵基因在腫瘤發(fā)展過(guò)程中的研究可能有著重要影響，它們能夠作為藥物靶點(diǎn)或者作為預(yù)后生物標(biāo)志物，推動(dòng)癌癥的治療及防控的研究。

本文利用復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)控制理論和基因網(wǎng)絡(luò)分析，結(jié)合生物醫(yī)療數(shù)據(jù)對(duì)腫瘤的關(guān)鍵基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，為網(wǎng)絡(luò)控制在生物醫(yī)療方面的研究提供了良好的思路。但是本研究中只考慮了Normal 和Tumor 兩個(gè)階段的癌癥蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，如果進(jìn)一步地結(jié)合Tumor 不同時(shí)期的數(shù)據(jù)細(xì)化腫瘤關(guān)鍵基因的識(shí)別，可以更好地進(jìn)行腫瘤演化方面的分析，這也是未來(lái)工作中的研究方向。