陳美霞, 王澤榕, 石 玲, 阮俊峰, 鄭世仲, 劉 偉

(1.寧德師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建 寧德 352100; 2.福建省科技廳產(chǎn)學(xué)研合作示范基地，福建 寧德 352100; 3.福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)學(xué)院,福建 福州 350002; 4.寧德市林業(yè)局，福建 寧德 352100)

油茶(Camelliaoleifera)是我國木本類油料的主栽物種，也是世界四大木本食用油料植物之一。油茶含有較高的不飽和脂肪酸，可降低血脂、肝脂，預(yù)防血栓、冠心病和動脈粥樣硬化[1]。炭疽屬(Colletotrichum)真菌可侵染油茶，造成落葉、落花、落果，阻礙油茶產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[1]。當(dāng)溫度為25～30 ℃、濕度88%時，油茶炭疽病發(fā)病率達(dá)到高峰，病斑沿葉片中間、邊緣發(fā)生，多呈現(xiàn)半圓形或者不規(guī)則形狀，顏色為黑褐色或褐色，內(nèi)輪生小黑點[2]。

目前對引起油茶炭疽病的主要病原菌尚無定論。李河等[3]首次報道引起油茶炭疽病的病原菌為果生刺盤孢菌(Colletotrichumfructicola)。朱英芝等[4]通過形態(tài)學(xué)和多基因系統(tǒng)分析，鑒定了廣西油茶炭疽病的病原菌為膠孢炭疽菌(ColletotrichumgloeosporioidesPenz.)；李楊等[5]從湖南、江西、海南的油茶炭疽病葉中分離到5株病原菌，經(jīng)鑒定為山茶刺盤孢(Colletotrichumcamelliae)，該病原菌首次在油茶上報道。帥小春等[6]認(rèn)為貴州油茶炭疽病的病原菌為果生炭疽菌(Colletotrichumfructicola)、山茶炭疽菌(Colletotrichumcamelliae)和卡哈瓦炭疽菌(Colletotrichumkahawae)，其中卡哈瓦炭疽菌是首次報道引起油茶炭疽病的病原菌。也有研究者認(rèn)為暹邏刺盤孢菌(Colletotrichumsiamense)[7]、博寧炭疽菌(Colletotrichumboninense)[8]是油茶炭疽病的主要致病菌?？梢?，不同地區(qū)油茶炭疽病致病菌不同，明確其病原菌是今后針對性防治病害的基礎(chǔ)。因此，本研究以福建省寧德市洋中鎮(zhèn)油茶炭疽病病葉為材料，依照科赫氏法則進行病原菌分離，結(jié)合傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)和多基因序列分析對病原菌進行鑒定，以明確當(dāng)?shù)赜筒杼烤也〉闹饕≡?，為科學(xué)防治病害提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

油茶炭疽病病葉采自福建省寧德市蕉城區(qū)洋中鎮(zhèn)萬恒綠園農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司基地。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌的分離純化 采用常規(guī)組織分離法進行病原菌的分離純化。利用菌絲尖端切割分離法，挑取少許病原菌邊緣菌絲，接入PDA培養(yǎng)基中央。將培養(yǎng)皿倒置于26 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d，觀察菌落形態(tài)、反面顏色特征。分離純化5代后，即得到病原菌菌株。

1.2.2 病原菌形態(tài)鑒定及孢子觀察 用內(nèi)徑5 mm的打孔器將病原菌菌株打孔制成菌餅，接種到PDA培養(yǎng)基上。培養(yǎng)10 d后挑取菌絲和孢子，并用顯微鏡觀察病原菌菌絲及分生孢子的形態(tài)。

1.2.3 病原菌致病性測試 用無菌水沖洗油茶葉片30 min，置于鋪有無菌水潤濕濾紙的培養(yǎng)皿中。用無菌接種針輕輕刮傷葉片表皮形成造傷葉片，采用直徑5 mm打孔器將純化后的菌餅接種至傷口處，置于26 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，以空白培養(yǎng)基為對照(CK)。每天觀察葉片發(fā)病癥狀并拍照記錄，待產(chǎn)生病斑后再次分離病原菌。

1.2.4 PCR擴增 將分離純化后的病原菌接種到培養(yǎng)基上，倒置于26 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d后，按照植物基因組DNA試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)提取基因組DNA。采用1%(質(zhì)量比)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度，超微量紫外可見分光光度計Nano Drop 2000c(Thermo Scientific)檢測DNA樣本濃度。檢測合格的樣本參照Weir et al[9]進行ITS通用引物(ITS1:5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)、ACT通用引物(ACT-F:5′-ATGTGCAAGGCCGGTTTCGC-3′，ACT-R:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)、CAL通用引物(CAL-F:5′-GAATTCAAGGAGGCCTTCTC-3′，CAL-R:5′-CTTCTGCATCATGAGCTGGAC-3′)PCR擴增。擴增體系為：DNA模板 1 μL；上下游引物各1 μL；dNTP(10 mmol·L-1) 0.5 μL；Taq DNA聚合酶0.2 μL；Buffer緩沖液2 μL；ddH2O補齊至20 μL。擴增程序為：94 ℃預(yù)變性10 min; 94 ℃變性30 s，退火45 s；72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。其中，ITS、ACT、CAL基因擴增退火溫度分別為55、55、59 ℃。取5 μL PCR擴增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳(120 V, 15 min)，檢測PCR產(chǎn)物片段大小，符合預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物委托福州鉑尚生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.5 系統(tǒng)發(fā)育分析 測序后的基因序列經(jīng)過Clustal W軟件處理后，按照ITS-ACT-CAL的順序依次首尾相連拼接。在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLASTN比對，下載同時含有3個基因序列的炭疽菌株，參照文獻[9]，選取模式菌株序列作為參考序列進行聚類分析。使用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，采用鄰接(neighbor-joining, NJ)聚類分析，經(jīng)1 000次重復(fù)計算檢驗值[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離及形態(tài)學(xué)鑒定

油茶病害葉片分離純化出5株單菌株，命名為DH1、DH2、DH3、DH4和DH5。5株菌株在PDA培養(yǎng)基上邊緣規(guī)則完整，中央顏色稍淺，灰褐色；菌落背面灰白色，中央微黃色后期呈黑褐色，邊緣米白色。顯微鏡下觀察表明，菌絲致密呈棉花狀，不易挑起，分枝，具隔膜，表面干燥。DH1、DH2、DH4、DH5分生孢子呈長橢圓形，無色無隔膜，大小為(14.5～16.2)×(4.8～5.7) μm，初步確認(rèn)為果生炭疽菌。DH3分生孢子光滑，單孢，長橢圓形或圓柱形，兩端圓或一端略粗，大小為(14.8～17.4)×(4.8～6.1) μm，初步確認(rèn)為山茶炭疽菌。菌落及孢子形態(tài)分別如圖1、圖2所示。

A～E分別表示DH1～DH5菌落的正面；F～J分別表示DH1～DH5菌落的背面。圖1 油茶炭疽病病原菌菌落形態(tài)Figure 1 Morphology of the anthracnose pathogen colony of Camellia oleifera

A～E分別表示DH1～DH5的分生孢子；標(biāo)尺為10 μm。圖2 油茶炭疽病病原菌分生孢子與菌絲形態(tài)Figure 2 Morphology of the conidia and mycelium in anthracnose pathogen of Camellia oleifera

2.2 病原菌致病性測定

取5株單菌株的菌絲塊接種至健康油茶成葉，3 d后葉片開始發(fā)病,病斑呈黑褐色或褐色，隨后病斑擴展形成不規(guī)則狀，5 d時葉緣呈紫紅色，與田間病葉癥狀一致，對照組葉片不發(fā)病(圖3)。從病斑處再次分離病原菌，顯微鏡下觀察菌絲和孢子的形態(tài)與接種菌株一致，表明DH1、DH2、DH3、DH4、DH5菌株是油茶炭疽病的主要病原菌，并且是從傷口處侵染。

2.3 PCR克隆及測序

提取5株菌株基因組DNA，電泳檢測發(fā)現(xiàn)，點樣孔附近干凈無雜帶，條帶單一。超微量紫外可見分光光度儀測定DNA濃度分別為50、50、45.2、50、42.5 ng·μL-1，D260 nm/280 nm分別為1.82、1.89、1.89、1.86、1.81，均在1.8～2.0之間，說明提取的核酸DNA效果良好，可用于下一步試驗。

ITS、ACT、CAL基因PCR擴增結(jié)果如圖4。擴增條帶單一、清晰明亮，片段集中在500、250、1 000 bp左右，片段大小與預(yù)期一致，可送至生物公司測序。

A、G為對照組葉片正反面；B～F分別為DH1～DH5葉片正面發(fā)病癥狀；H～L分別為DH1～DH5葉片反面發(fā)病癥狀。圖3 炭疽病病原菌對油茶葉片的侵染Figure 3 Leaves of Camellia oleifera infected by anthracnose artificially

A～C分別表示ITS、ACT、CAL基因PCR擴增；M為2 000 bp marker；1～5分別表示DH1～DH5菌株。圖4 PCR擴增電泳圖Figure 4 The amplification results of PCR

2.4 多基因序列聚類分析

PCR產(chǎn)物序列通過NCBI Blast同源性比對，按照ITS-CAL-ACT的順序依次首尾相連拼接，下載同源性較高的炭疽屬相似種對應(yīng)的18個基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。由圖5可知，分離的DH1、DH2、DH4、DH5菌株與ZJJH、ICMP18613和ICMP18581的果生炭疽菌聚在一起，DH3與GDBL-8的山茶炭疽菌聚在一起，與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果相一致。

3 討論

隨著分子技術(shù)普及以及測序成本的下降，核苷酸序列早已成為病原菌鑒定和檢測的重要依據(jù)。對于炭疽菌屬復(fù)合種而言，培養(yǎng)基形態(tài)、孢子大小、菌株培養(yǎng)特性差異不大，但同屬不同種炭疽菌培養(yǎng)性質(zhì)不穩(wěn)定，易受外界環(huán)境影響[11]。隨著寄主與病原菌之間的相互協(xié)同進化，僅依靠形態(tài)學(xué)差異進行鑒定不夠準(zhǔn)確，而借助單一引物序列PCR擴增，片段太小不足以反映菌株差異，導(dǎo)致準(zhǔn)確性較低。Taylor et al[12]采用多基因譜系識別生物學(xué)種。隨著多基因分析方法的引入，通過不同基因片段擴增位點不同，可以準(zhǔn)確鑒定之前混淆的多種病原菌。

本研究從福建省寧德市蕉城區(qū)洋中鎮(zhèn)采集的油茶病葉中分離到5株病原菌，采用ITS、ACT、CAL基因序列聯(lián)合分析進行分子鑒定，5個菌株聚類成2個組，即果生炭疽菌和山茶炭疽菌聚類組，進一步佐證了形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果。其中4株為果生炭疽菌(占比80%)，為優(yōu)勢種群，1株為山茶炭疽菌(占比20%)，為弱勢種群。Li et al[13]研究表明，油茶炭疽病病原菌有果生炭疽菌、暹邏炭疽菌、膠孢炭疽菌、山茶炭疽菌，其中果生炭疽菌為優(yōu)勢種群，占比83.9%。本研究分離得到的4株果生炭疽菌菌落、孢子形態(tài)相似，但經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫比對，其測序后的序列差異較大，說明同地區(qū)分離到的病原菌雖為同一屬，但不是同一生理小種。因此，對病原菌的鑒定應(yīng)結(jié)合形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)，以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。李河等[3]從湖南、江西、湖北、重慶、海南、福建6個省(市)分離得到23株病原菌，鑒定為果生炭疽菌，說明該菌分布廣泛；系統(tǒng)進化樹顯示，同一地區(qū)分離的菌株并未全部聚在一起，說明地理特異性不明顯。該團隊隨后又分離到5株山茶刺盤孢[6]。從湖南省油茶炭疽病病葉中分離到的病原菌包含果生炭疽菌、暹羅炭疽菌、膠孢炭疽菌、山茶炭疽菌和哈銳炭疽菌5種[14]。Wang et al[15]從8個省(自治區(qū))20個油茶發(fā)病果實和葉片中分離獲得232個菌株，鑒定為山茶炭疽菌、果生炭疽菌、暹羅炭疽菌、隱秘炭疽菌和膠孢炭疽菌，說明同一地區(qū)油茶炭疽病并非僅一種病原菌，而是由多種病原菌共同侵染導(dǎo)致病害爆發(fā)。目前，有關(guān)油茶炭疽病的有效防治措施未見報道。王建偉等[16]認(rèn)為，使用專用有機肥可促進油茶根系和葉片的生長，提高產(chǎn)量，并改善油茶林地土壤氮庫，但需注意合理配施。

本研究明確了引起洋中油茶炭疽病的主要病原菌為果生炭疽菌和山茶炭疽菌，今后將開展孢子萌發(fā)條件、致病機理、病原菌與宿主之間關(guān)系的研究，為有針對性地防治病害提供依據(jù)。