孫璐

(青海大學畜牧獸醫(yī)科學院 青海省高原放牧家畜動物營養(yǎng)與飼料科學重點實驗室，西寧810016)

玉樹藏族自治州位于青海省西南部青藏高原腹地的三江源頭，生活在這里的人們處于寒冷、缺氧、強紫外線等高海拔環(huán)境中，一年中大部分時間無法補充蔬菜和水果，但是他們能夠在極端環(huán)境中健康生活，很大程度上取決于牦牛乳，其產品構成他們日常飲食的主要組成部分［1］。牦牛乳中含有多種對哺乳動物后代健康很重要的復雜成分，主要包括蛋白質、乳糖和脂肪，以及一些相對分子量較低，具有特殊生物學功能的低聚糖、磷脂和鞘脂等化合物［2］。牦牛乳的產量較荷斯坦牛極低，但其蛋白質、干物質、脂肪及乳糖等營養(yǎng)成分含量高于其他乳，富含共軛亞油酸(CLA)、免疫球蛋白等功能性成分，是一種天然、獨特的濃縮乳，被認為是制造嬰兒、老年人及特殊需求人群食品的優(yōu)質原料乳［3］。牦牛乳營養(yǎng)含量高，含有豐富的微生物群系。牦牛乳中的微生物從各種來源獲得，發(fā)揮著多種作用，如促進乳品發(fā)酵(乳球菌、乳桿菌、鏈球菌、丙酸桿菌和真菌種群)、導致腐敗(假單胞菌、梭狀芽孢桿菌、芽孢桿菌)、有益于健康(乳酸桿菌和雙歧桿菌)或引起疾病(李斯特菌、沙門氏菌、大腸桿菌、彎曲桿菌和產生霉菌毒素的真菌)等［4］。關于微生物早期的研究大多基于培養(yǎng)的方法獲得微生物的組成，對于無法培養(yǎng)的微生物則不能通過該方法解析。高通量測序技術的發(fā)展，克服了微生物培養(yǎng)檢測的局限性，被廣泛用來鑒定和發(fā)現微生物［5］。本文為了解牦牛液態(tài)乳的質量和安全，對青海省玉樹地區(qū)的生鮮牦牛乳源微生物進行高通量測序，為牦牛乳的開發(fā)利用及優(yōu)勢菌群的發(fā)掘等提供參考。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

2019年7～8月，選取玉樹地區(qū)自然放牧，體況、年齡、胎次(4～5胎次)基本一致的泌乳中期母牦牛，母牛和犢牛分開過夜，每天人工擠奶1～2次但不完全擠完。3個樣點采樣方法相同。

采樣地點為青海省玉樹州稱多縣歇武鎮(zhèn)、曲麻萊長江村、玉樹州果青牧場3個樣點。每個樣點采集6個樣(yak1、yak2、yak3)。采樣點基本信息見表1。每份乳約50 mL，取5 mL于無菌無酶凍存管(康寧/Corning公司)中，液氮速凍，運回實驗室后儲存在-80℃冰箱備測。

表1 采樣點基本信息

1.2 儀器與設備

DCC體細胞檢測儀(利拉伐天津有限公司);超低溫冰箱(-80℃，美國Thermo公司);Fresco21型高速冷凍離心機(美國Thermo公司);Tprofessiona PCR儀(德國Biometral公司);Gel DOC XR凝膠成像系統;PowerPacUniversal水平電泳儀;SUBCELL GT電泳槽(20 cm×25 cm，美國Bio-Rad公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 基因組總DNA提取及PCR擴增、測序參照YU［16，17］等 的 方 法 提取3組牦 牛 乳 樣 本 中 的DNA，以16S V4區(qū)引物(515F和806R)進行PCR擴增。通過TruSeq DNA PCR-Free Sample Preparation Kit構建文庫，文庫合格后，使用NovaSeq6000進行上機測序。PCR的擴增、PCR產物的混樣、純化，文庫的構建和上機測序流程均由天津諾禾致源生物信息科技有限公司完成?；谔旖蛑Z禾致源云平臺(https://magic.novogene.com)、SPSS Statistics軟件(version 19.0)、I-Sanger云平臺(https://www.isanger.com/)、R軟件(version 3.5.1)以及ITOL(https://itol.embl.de/)等軟件平臺進行生物信息學及數據統計分析。

1.3.2 環(huán)境因子的獲取利用天寶juno sa無線GPS記錄器定位獲得3個采樣地點的坐標、海拔等信息，在國家氣象科學數據中心(http://data.cma.cn/site/index.ht mL)獲取采樣點年平均氣溫。

1.4 數據計算

1.4.1 測序數據處理測序所得原始序列截去接頭和引物序列后，使用FLASH(version 1.2.7)進行拼接獲得原始Tags數據，原始Tags數據經Qiime(version 1.9.1，http://qiime.org/scripts/split_libraries_fastq.ht mL)質量控制后獲得高質量的Tags數據(Clean Tags)，通過(https://github.com/torognes/vsearch/)與物種注釋數據庫進行比對檢測嵌合體序列，并最終去除其中的嵌合體序列，得到最終的有效數據(Effective Tags)。

1.4.2 微生物多樣性分析Shannon，Observed-OTUs，Chao及Simpson指數使用Qiime軟件(Version 1.9.1)計算，Alpha多樣性的指數組間差異分析使用R軟件(Version 2.15.3)完成。利用QIIME軟件(version 1.17)計算Beta多樣性距離矩陣。相似性分析(Analysis of similarities，ANOSIM)基于bray_curtis距離分析，基于unweighted UniFrac距離對不同海拔牦牛乳微生物進行主坐標分析(PCoA)。對牦牛乳微生物組成進行差異判別分析(LEfSe)，再根據分類學組成對樣本按照不同的分類水平進行線性判別分析(LDA，閾值為4)，找出對樣本劃分產生顯著性差異影響的菌群。

2 結果

2.1 玉樹地區(qū)牦牛乳微生物測序結果及多樣性指數

質控后按照97%相似性進行可操作分類單元(operational taxonomic units，OTU)聚類，共得到12329個OTUs。繪制等級聚類曲線(Rank Abundance)和稀釋曲線(Rarefaction curve)。稀釋曲線是從樣本中隨機抽取一定測序量的數據，統計所代表物種數目(OTUs數目)，以抽取的測速數據量與對應的物種數來構建曲線，稀釋曲線直接反映測序數據量的合理性，間接反映樣本中物種的豐富度，圖1曲線逐漸趨向平坦，表明本試驗的測序數據量合理。

圖1 Alpha多樣性指數稀釋曲線圖

等級聚類曲線是將樣本中OTUs按相對豐度由大到小排序得到對應的排序編號，再以OTUs的排序編號為橫坐標，OTUs中的相對豐度為縱坐標，將這些點用折線連接，可直接反映樣本中物種的豐富度和均勻度。如圖2所示，在水平方向上，曲線橫軸跨度逐漸變大，說明物種豐富度也隨之變大;在垂直方向上，曲線逐漸平滑，說明物種分布均勻。

圖2 等級聚類曲線

通過Shannon和Simpson指數評價微生物的多樣性，Observed species和Chao1評價微生物菌群豐度。由表2可知，青海玉樹地區(qū)不同樣點牦牛乳樣品中微生物的豐度存在顯著差異，但3組樣品的微生物多樣性相似。

表2 Alpha多樣性指數差異

2.2 玉樹地區(qū)牦牛乳微生物組成

2.2.1 物種維恩圖(Venn Diagram)分析對玉樹地區(qū)不同樣點的牦牛乳微生物制作物種Venn圖，由圖3可知，3組樣品共有3104個OTUs。其中玉樹州果青牧場(yak3)的牦牛乳樣品中特有2697個OTUs，是3組中數量最多的;稱多縣歇武鎮(zhèn)歇武村(yak1)牦牛乳樣品中特有的OTUs個數為915;曲麻萊長江村(yak2)的牦牛乳樣品特有OTUs 564個，是3組中最少的。

圖3 韋恩圖

2.2.2 玉樹地區(qū)牦牛乳微生物門分類水平的組成對3組樣品中的微生物進行門水平前10種物種相對豐度分析，結果如圖4。相對豐度排名前10的微生物分別是:變形菌門(Proteobacteria)，厚壁菌門(Firmicutes)，擬桿菌門(Bacteroidetes)，放線菌 門(Actinobacteria)，藍藻門(Cyanobacteria)，浮霉菌門(Planctomycetes)，酸酐菌門(Acidobacteria)，疣微菌門(Verrucomicrobia)，綠彎菌門(Chloroflexi)，軟壁菌門(Tenericutes)。其中，變形菌門在yak1和yak2組中的含量最高，分別占比50.40%和44.52%;yak3組中變形菌門和厚壁菌門含量較多，占比接近，分別為35.09%和36.70%;軟壁菌門在yak1組中的含量最少(0.40%)，疣微菌門在yak2組中的占比最小(0.18%)，浮 霉 菌 門 在yak3中 的 含 量 最 少(0.15%)。

圖4 門水平玉樹地區(qū)微生物的相對豐度

2.2.3 玉樹地區(qū)牦牛乳微生物屬分類水平的組成玉樹地區(qū)不同樣點牦牛乳微生物屬水平物種豐度結果表明(圖5)，微生物組成占比前10的分別是unidentified_Burkholderiaceae、金黃桿菌屬(chryseobacterium)、耶爾森菌屬(Yersinia)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、unidentified_Cyanobacteria、不動桿菌屬(Acinetobacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、乳酸鏈球菌屬(Lactococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、unidentified_Enterobacteriaceae。Yak1組中占比最高的為不動桿菌屬(7.20%);yak2組和yak3組占比最高的分別是金黃桿菌屬和乳桿菌屬。乳酸鏈球菌屬在yak1組和yak2組中的含量最少，unidentified_Burkholderiaceae在yak3組中占比最低。

圖5 屬水平下玉樹地區(qū)牦牛乳微生物的相對豐度

2.2.4 玉樹地區(qū)牦牛乳微生物種水平的組成玉樹地區(qū)牦牛乳樣品前10個種水平微生物組成比較表明，唐菖蒲伯克霍爾德菌(Burkholderia gladioli)和Chryseobacterium_vrystaatense在yak2組的比例最高，分別為12.40%和17.17%;魯氏不動桿菌(Acinetobacter lwoffii)占比較高，在yak1組中含量最高;Lactobacillus_iners在yak1，yak2組的含量較低，唐菖蒲伯克霍爾德菌在yak3組中所占比例最低。

表3 種水平下玉樹地區(qū)牦牛乳微生物的相對豐度

2.2.5 玉樹地區(qū)牦牛乳物種主坐標分析基于unweightedUniFrac距離的PCoA主坐標分析結果顯示，第一主成分對樣品差異的貢獻值為14.38%，第二主成分對樣品差異的貢獻值為10.36%。yak1、yak2及yak3組各組間距離較近，可能是由于3組樣本采樣地點距離、海拔較近，經緯度較為接近，且yak2和yak3組的微生物結構相似度較高。

圖6 基于unweightedUniFrac距離的PCoA主坐標分析

2.3 玉樹地區(qū)牦牛乳微生物組成組間差異分析

LDA值分布柱狀圖(圖7A)(LDA score＞4)體現了玉樹地區(qū)不同樣點牦牛乳間微生物具有統計學差異的物種，由圖可知yak3組中差異物種影響較大的是厚壁菌門、乳桿菌目(Lactobacillales)、芽孢桿菌綱(Bacilli);yak2組中差異物種影響較大的是黃桿菌目(Flavobacteriales)、金黃桿菌屬(Chryseobacterium)、unidentified_Flavobacteriales;yak3組中差異物種影響較大的是耶爾森菌屬、紅細菌目(Rhodobacterales)、紅細菌科(Rhodobacteraceae)。

玉樹不同地區(qū)牦牛乳進化分支圖(圖7B)由內而外輻射的圓圈代表了由門至屬(或種)的分類級別，圖中無顯著差異的統一著色為黃色，差異顯著的物種跟隨分組進行著色。由圖可知，yak1組中差異顯著的物種為unidentified_Cyanobacterin、紅細菌科(Rhodobacteraceae)、紅細菌目(Rhodobacterales)、鞘脂單胞菌科(Sphingomonadaceae)、鞘脂單胞菌目(Sphingomonadales)，yak2組中差異顯著的物種為unidentified_Flavobacteria、黃桿菌目(Flavobacteriales)，yak3組中差異物種為乳桿菌目(Lactobacillales)、鏈球菌科(Streptococcaceae)、乳桿菌科(lactobacillaceae)、芽孢桿菌綱(Bacilli)。

圖7 LEfSe組間差異分析 A：LDA值分布柱狀圖；B：進化分支圖

3 討論

牦牛乳中含有多種微生物，包括有益菌及各種致病菌。致病菌是食源性疾病的主要來源，對犢牛及消費者的健康造成威脅。本研究結果發(fā)現，門水平玉樹地區(qū)牦牛生鮮乳中主要的微生物為變形菌門和厚壁菌門;屬水平中主要的優(yōu)勢菌為不動桿菌屬、金黃桿菌屬和乳桿菌屬，這與現有的研究結果一致［6，7］。

牛乳中的微生物多樣性對于預測的乳品質量具有重要意義。牛乳中的微生物受來源動物、環(huán)境、溫度、海拔等多種因素的影響［8，9］。變形菌門和耶爾森氏菌是常見的糞便菌群，其中變形菌門(如大腸桿菌、克雷伯氏菌、腸桿菌、變形桿菌和沙雷氏菌)在健康機體的腸道中很少見，多見于早期腸道炎癥的機體內［10，11］。耶爾森氏菌是一種在糞便中存在的與腸炎有關的致病菌，耶爾森氏菌屬中的3個物種對人類具有致病性，即鼠疫耶爾森氏菌、假結核耶爾森氏菌和小腸結腸炎耶爾森氏菌［12］。金黃桿菌屬屬于黃桿菌科，包含革蘭氏陰性、黃色色素、桿狀和不形成孢子的細菌種類，它們可以是自由生活或寄生［13］。其以促進巴氏殺菌牛乳變質和再污染的能力而聞名，從而降低牛乳質量，也是引起奶牛乳腺炎的機會性病原體［14，15］。這些菌均為致病菌，一般來說，不應該存在于牛乳中?？赡苁窃跀D奶過程中與空氣、糞便接觸進入牛乳。牧區(qū)應盡可能規(guī)范牦牛飼養(yǎng)、擠奶過程，做好擠奶前牦牛乳房的檢查和消毒工作，盡量減少相關微生物群對產品質量的影響。不動桿菌屬為原乳中常見的嗜冷菌屬，在天氣寒冷和生產率降低的泌乳后期逐漸占據優(yōu)勢，但是其大量繁殖會影響乳成分，導致腐敗變質［16-18］。在本論文中不動桿菌在年平均氣溫-2.6℃，-3.3℃的稱多縣歇武鎮(zhèn)歇武村和曲麻萊長江村較低，而在年平均氣溫為3℃的玉樹州果青牧場最高。

4 結論

綜合來看，玉樹地區(qū)不同樣點的牦牛乳Alpha多樣性指數observed_species差異顯著(P＜0.05)，指數Chao1、Shannon和Simpson差異不顯著(P＞0.05)，微生物多樣性和豐度相似，微生物均以厚壁菌門和變形菌門為主。