李淑平 張 偉 王新語(yǔ) 李 晶 張煥春*

（1山東省煙臺(tái)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，煙臺(tái) 265500；2煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，煙臺(tái) 264005）

甜櫻桃是我國(guó)北方種植經(jīng)濟(jì)效益最高的樹種之一，我國(guó)從20世紀(jì)80年代開始引種栽培，目前全國(guó)栽培面積超過(guò)13.5萬(wàn)hm2。櫻桃根頸腐爛病是櫻桃生產(chǎn)中的一種致死病害，在櫻桃的新老產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，嚴(yán)重影響櫻桃的產(chǎn)量和品質(zhì)。本研究在櫻桃的主產(chǎn)區(qū)煙臺(tái)，以患根頸腐爛病櫻桃樹為試材，對(duì)其病原菌進(jìn)行分離、鑒定，以期為該病害的田間防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

在山東煙臺(tái)的蓬萊、福山區(qū)、牟平區(qū)等櫻桃主產(chǎn)地，共8個(gè)采樣點(diǎn)，選擇櫻桃根頸腐爛病樹，切取病健交界的皮層和木質(zhì)部組織，放入干凈的采集袋內(nèi)，帶回實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)。

1.2 病菌分離

在超凈臺(tái)上，先切取較大病斑組織 （1 cm左右小塊），置于70%乙醇中浸3～5 min，再將病斑組織移入0.1%HgCl2溶液中浸3～5 s，消毒后切取病斑組織中央部分，經(jīng)滅菌水漂洗3次后，轉(zhuǎn)移到PDA培養(yǎng)基上，放入生化培養(yǎng)箱，25℃培養(yǎng)。

1.3 r-DNA-ITS序列分析

利用改良CTAB法提取致病病菌DNA，采用ITS4 （5′-TCCT CCGCTTATTGATATGC-3′）和TTS5 （5′-GGAAGTAAAAGTCGTAAGAAG-3′）作為通用引物。按常規(guī)應(yīng)體系50 μL：10×PCR buffer 5 μL，Taq 酶 1 μL，dNTP 1 μL，上游引物1 μL， 下游引物 1 μL，DNA 模板 1 μL，ddH2O 40 μL。 擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變形性 5 min；94 ℃變性 30 s，54 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，共35個(gè)循環(huán)；最終72℃延伸10 min。

回收PCR產(chǎn)物，將目的片段連接到載體Pmd19-T Vector上，進(jìn)行轉(zhuǎn)化，挑選PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的菌落，接種到Amp+LB液體培養(yǎng)基中，180 r/min 37℃搖菌過(guò)夜，按質(zhì)粒提取試劑盒小量提取質(zhì)粒。用pMD19-T載體引物M13（-47）和 M13（-48）雙向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果拼接，于 http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/上 BLAST 比對(duì)。

1.4 致病性測(cè)定

供試植物為2年生美早櫻桃苗，試驗(yàn)部位為根頸處，接種時(shí)間為6月份。先用滅菌棉棒蘸取滅菌水把試驗(yàn)部位擦凈、晾干，再用75%酒精消毒、晾干。用縫衣針針刺需接種部位，1 cm2約刺10個(gè)孔。以5 mm打孔器在培養(yǎng) 3 d的供試菌株菌落邊緣打取菌餅作為接種體。接種菌餅后，用滅菌棉球蘸無(wú)菌水覆蓋接種部位，外纏保鮮膜保濕。對(duì)照處理不接種菌餅，其它步驟相同。用紅色油漆筆標(biāo)記接種部位。每個(gè)處理5株。保濕48 h后，拆除保鮮膜，接種部位用濕潤(rùn)的土覆蓋，并經(jīng)常檢查確保濕潤(rùn)。2個(gè)月后觀察發(fā)病情況。確定發(fā)病的植株，再采集病樣進(jìn)行分離、鑒定。與接種病菌分子鑒定結(jié)果相同的，確定為致病菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 病菌分離鑒定

將煙臺(tái)的8個(gè)櫻桃根頸腐爛病發(fā)病地點(diǎn)采集到的病樣經(jīng)分離純化，得到10個(gè)菌株，經(jīng)致病性測(cè)定及分子鑒定，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 8個(gè)櫻桃采樣點(diǎn)病菌分離鑒定情況

有8個(gè)菌株可引起發(fā)?。?株撕裂蠟孔菌，1株赤球叢赤殼，1株粗毛栓菌屬白腐菌，3株擬莖點(diǎn)霉屬病菌，2株尖孢鐮刀菌。另鑒定到木霉 菌 屬 （Trichoderma album） 和 糞 殼 菌 綱（Sordariomycetes）各 1株，不能引起發(fā)病。

2.2 病菌培養(yǎng)特征

5種病菌在PDA培養(yǎng)條件下，均未產(chǎn)生孢子。25℃暗培養(yǎng)4 d，各菌落形態(tài)如圖1。赤球叢赤殼菌落白色，菌絲絨毛狀細(xì)密，均勻，菌落直徑為3.8 cm。擬莖點(diǎn)霉屬菌落白色，致密，菌落正面高低不平，菌落直徑為7.8 cm。撕裂蠟孔菌菌落白色，菌絲稀疏，菌落直徑為7.4 cm。粗毛栓菌屬白腐菌，菌落白色，呈射軸狀，疏密相間，菌落直徑為6.5 cm。尖孢鐮刀菌菌落正面白色，反面粉紅色，菌絲絨毛狀，細(xì)密均勻，菌落直徑為3.9 cm。

圖1 引起櫻桃根頸腐爛病的病菌

2.3 致病性測(cè)定

在夏季高溫多雨季節(jié)，櫻桃接種病菌，1個(gè)月后可發(fā)現(xiàn)根頸部位有白色菌絲纏繞。刮開樹皮，可見(jiàn)病菌由針刺部位侵染，圍繞針刺點(diǎn)縱深發(fā)展。前期預(yù)備試驗(yàn)顯示，如沒(méi)有刺傷，接種病菌后1年仍未表現(xiàn)出病癥，說(shuō)明病菌主要從傷口侵入。

接種2個(gè)月后調(diào)查，對(duì)照只在針刺點(diǎn)形成褐色疤痕，周圍腐爛狀，但并不深入。接種病菌的樹體，外表被白色菌絲纏繞，刮開樹皮后，已分辨不出接種的針刺孔，病組織相連，和田間櫻桃根頸腐爛病樹癥狀相似。

圖2 5種真菌在櫻桃苗上的接種效果

3 討論與結(jié)論

櫻桃根頸腐爛病在櫻桃產(chǎn)區(qū)時(shí)有發(fā)生，輕者影響果實(shí)品質(zhì)，嚴(yán)重的造成整株樹死亡。根據(jù)多點(diǎn)采樣分析及分子鑒定，確定有5種真菌可造成櫻桃根頸腐爛，即尖孢鐮刀菌、擬莖點(diǎn)霉屬菌、粗毛栓菌屬白腐菌、赤球叢赤殼和撕裂蠟孔菌。

擬莖點(diǎn)霉屬和尖孢鐮刀菌這兩類病菌，在國(guó)內(nèi)多有報(bào)道。擬莖點(diǎn)霉屬是重要的植物病原，可引起潰瘍、爛莖、果腐、葉枯、枝枯、根腐、樹皮壞死等多種癥狀[1-2]。尖孢鐮刀菌是一種世界性分布的病原真菌，寄主范圍廣泛，可引起100多種植物維管束萎蔫病害[3-4]。由本實(shí)驗(yàn)分離鑒定結(jié)果可知，引起櫻桃根頸腐爛病的病菌中，8個(gè)發(fā)病點(diǎn)，有3個(gè)點(diǎn)分離到擬莖點(diǎn)霉屬菌，占37.5%；2個(gè)點(diǎn)分離到尖孢鐮刀菌，占25%。

呂勁峰等[5]在廣東雞蛋果上報(bào)道發(fā)現(xiàn)了赤球叢赤殼，稱該病原菌主要侵害根、莖交界處，橫切病莖可見(jiàn)木質(zhì)部變褐，可引起大量植株迅速凋萎死亡。

關(guān)于粗毛栓菌屬白腐菌的文章，大多為此菌在造紙中用來(lái)生物降解纖維的應(yīng)用研究，Milenkovic M等[6]報(bào)道，此菌在埃塞俄比亞可引起泡桐衰退病。Jelena等[7]利用此菌來(lái)降解木質(zhì)素。目前國(guó)內(nèi)沒(méi)有此菌引起病害的報(bào)道。

關(guān)于撕裂蠟孔菌，李淑平[8]前期發(fā)表的文章有所介紹。通過(guò)后續(xù)4種病菌的發(fā)現(xiàn)，說(shuō)明引起櫻桃根頸腐爛的病原不同，但發(fā)病癥狀相似。推測(cè)或許還有其它病菌可引起此病。而且，試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，只有針刺接種，才可以導(dǎo)致發(fā)病，說(shuō)明這幾種病菌是通過(guò)傷口侵染，因此在櫻桃的生產(chǎn)管理中，為防止根莖腐爛病的發(fā)生，要保護(hù)好根頸部位，盡量避免造成傷口。這也解釋了為什么冬天凍害嚴(yán)重年份，翌年此病大爆發(fā)，是因?yàn)閮龊υ斐闪藗?，利于病菌的侵染?/p>