徐顥銘，宋國(guó)棟，劉素美，梁生康，張桂玲

( 1. 中國(guó)海洋大學(xué) 深海圈層與地球系統(tǒng)前沿科學(xué)中心/海洋化學(xué)理論與工程技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266100；2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室 海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266237；3. 中國(guó)海洋大學(xué) 化學(xué)化工學(xué) 院, 山東 青島 266100)

1 引言

沉積物中的異化硝酸鹽還原過程是氮元素從海洋環(huán)境中移除和轉(zhuǎn)化的主要途徑之一，主要包括反硝化（Denitrification）、厭氧銨氧化（Anammox）和異化硝酸鹽還原為銨（Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium, DNRA）3種過程。不同于執(zhí)行氮?dú)庖瞥姆聪趸蛥捬蹁@氧化，DNRA過程直接將硝酸鹽還原為銨，而不是以氮?dú)獾男问揭瞥齕1-2]，氮元素將繼續(xù)以化合態(tài)的形式存在于海洋環(huán)境中，有可能進(jìn)一步加重富營(yíng)養(yǎng)化和缺氧等環(huán)境問題[3]。近年來對(duì)于海洋沉積物中DNRA過程的關(guān)注呈現(xiàn)顯著上升的趨勢(shì)[2,4-6]。因而有必要準(zhǔn)確評(píng)估DNRA速率，從而更準(zhǔn)確地評(píng)估海洋中氮的收支情況。

由于OX-MIMS法存在上述的系列問題，我們嘗試開發(fā)一種不以30N在上述的系列為最終分析物的測(cè)試方法。Zhang2等[10]的方法將氧化為，而氨基磺酸恰好可以快速地將還原為29N2[19-20]— 一種非常適合MIMS的分析物。因此，本研究探索了一種次溴酸鈉氧化-氨基磺酸還原的測(cè)定沉積物15N加富樣品中的方法（簡(jiǎn)記為Redox-MIMS法）并應(yīng)用于萊州灣沉積物樣品的DNRA潛在速率測(cè)定，為的分析方法提供了一種新的選擇。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

15N同位素標(biāo)記樣品中15N2和的測(cè)定采用自組裝MIMS，儀器具體結(jié)構(gòu)可參考本課題組前期發(fā)表的成果[16]；、、等營(yíng)養(yǎng)鹽的測(cè)定使用AA3營(yíng)養(yǎng)鹽自動(dòng)分析儀。

實(shí)驗(yàn)試劑包括經(jīng)過Elix高純水系統(tǒng)處理的高純水、(15NH4)2SO4、氨基磺酸、NaOH、KBrO3、KBr、KI、濃鹽酸（36%）、Br2，上述試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)所用陳化海水于2016年采自南海海域，經(jīng)過孔徑為0.4 μm醋酸纖維濾膜過濾后避光陳化待用（的本底小于0.2 μmol/L），主要用于本實(shí)驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)溶液配制。

NaBrO-I2氧化劑：NaBrO-I2氧化劑的配制方法參考文獻(xiàn)[6，18]。

NaBrO氧化劑：NaBrO氧化劑的配制方法參考文獻(xiàn)[10]。該試劑需要臨用前配制。

氨基磺酸還原劑：稱取0.776 7 g氨基磺酸，溶于100 mL 1∶1 HCl溶液中，得到氨基磺酸還原劑（濃度為80 mmol/L）。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 Redox-MIMS法的操作流程

Redox-MIMS法的操作流程如圖1b所示：首先在6 mL Exetainer瓶中加入1 mL樣品，加入4 mL高純水稀釋，再加入0.5 mL NaBrO氧化劑，氧化30 min，將氧化為。然后加入0.5 mL氨基磺酸還原劑，將還原為15N2。立即蓋緊瓶蓋后，用MIMS進(jìn)行測(cè)定。為防止原樣品中異化硝酸鹽還原過程產(chǎn)生的對(duì)測(cè)定的高估影響，測(cè)定加富樣品中的時(shí)需要將樣品中的扣除，的測(cè)定采用氨基磺酸還原法，將還原為15N2后用MIMS 測(cè)定[21]。

為與目前常用的OX-MIMS法進(jìn)行比較，所有的標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品同時(shí)也采用了OX-MIMS法進(jìn)行測(cè)定。OX-MIMS法的操作流程參考文獻(xiàn)[13]的方法，如圖1a所示：在6 mL Exetainer瓶中加入1 mL樣品，加入4.8 mL高純水進(jìn)行稀釋后，加入0.2 mL NaBrO-I2氧化劑，直接將15NH4+氧化為15N2。立即蓋緊瓶蓋后，用MIMS儀進(jìn)行測(cè)定。

圖1 OX-MIMS法(a)和Redox-MIMS法(b)的操作流程Fig. 1 Procedures of OX-MIMS method (a) and Redox-MIMS method (b)

2.2.2 氨基磺酸還原劑的最佳濃度測(cè)試

為確定氨基磺酸還原劑的最佳濃度，本實(shí)驗(yàn)中配制了濃度分別為20 mmol/L、40 mmol/L、50 mmol/L、60 mmol/L、70 mmol/L、80 mmol/L、90 mmol/L、100 mmol/L的氨基磺酸還原劑，分別用Redox-MIMS法對(duì)濃度為0 μmol/L、10 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。各標(biāo)準(zhǔn)溶液同時(shí)用OX-MIMS法測(cè)定并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線以進(jìn)行比較和計(jì)算反應(yīng)相對(duì)回收率。相對(duì)回收率的計(jì)算為

式中，SRedox表示采用Redox-MIMS法測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；SOX表示采用OX-MIMS法測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。

2.2.3 樣品的采集、培養(yǎng)以及DNRA潛在速率的計(jì)算

為進(jìn)行實(shí)際樣品的測(cè)試，于2020年8月在萊州灣附近海域的3個(gè)站位（H1-7、S5、H2-7）采取沉積物和底層水樣品進(jìn)行15N加富泥漿培養(yǎng)，采樣站位如圖2所示。沉積物樣品用箱式采泥器采集后，取0～5 cm表層沉積物裝入密封袋中，立刻放入冰箱冷藏保存，24 h內(nèi)帶回陸地實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；底層水樣品用Niskin采水器采集并過濾后同樣放入冰箱中冷藏保存。

圖2 沉積物采樣站位Fig. 2 Sediment sampling stations

樣品帶回實(shí)驗(yàn)室后進(jìn)行厭氧條件下的15N加富泥漿培養(yǎng)。取部分混勻后的沉積物分別加入3個(gè)培養(yǎng)袋中，加入氦氣除氧后的相同站位的底層水。排凈培養(yǎng)袋中的空氣后，在常溫下進(jìn)行24 h左右的預(yù)培養(yǎng)，除去體系中原有的O2、和。預(yù)培養(yǎng)后用注射器分別向3個(gè)培養(yǎng)袋中加入3種不同的15N標(biāo)記物：、、+，使體系中各個(gè)標(biāo)記物濃度最終為100 μmol/L左右。各培養(yǎng)袋在常溫下培養(yǎng)8 h，并分別在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h時(shí)取樣。取樣時(shí)首先將培養(yǎng)袋搖勻，用注射器取一定量泥漿樣品，一部分直接轉(zhuǎn)入提前加好0.1 mL HgCl2飽和溶液的6 mL Exetainer瓶中，采用MIMS測(cè)定15N2[16]；剩余部分轉(zhuǎn)入50 mL離心管中，經(jīng)過離心后取上清液，用0.2 μm孔徑的濾膜過濾后轉(zhuǎn)入另一離心管中冷凍保存，用于后續(xù)測(cè)定和營(yíng)養(yǎng)鹽，其中分別采用Redox-MIMS和OX-MIMS兩種方法進(jìn)行測(cè)定并進(jìn)行比較。

15N2的濃度計(jì)算采用文獻(xiàn)[16]的計(jì)算方法；15的濃度采用測(cè)定出的15N2濃度反算得到。15N2和的產(chǎn)生速率由各自濃度隨時(shí)間變化曲線的斜率表示。反硝化、厭氧銨氧化和DNRA速率的計(jì)算方法采用文獻(xiàn)[22]的計(jì)算公式。沉積物中的DNRA在所有硝酸鹽異化還原過程中所占的比例（xDNRA）公式為

式中，VD代表反硝化速率；VA代表厭氧銨氧化速率；VDNRA代表DNRA速率。本實(shí)驗(yàn)中方法線性范圍的確定以及兩種方法的比較等統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)均使用Sigmaplot軟件完成。

3 結(jié)果與討論

3.1 氨基磺酸還原劑的最佳濃度

如圖3所示，當(dāng)氨基磺酸的濃度達(dá)到80～100 mmol/L時(shí)，的相對(duì)回收率達(dá)到最高，為（93.5±0.8）%。Redox-MIMS法使用的次溴酸鈉氧化劑相較于OXMIMS法使用的次溴酸鈉-碘是一種比較溫和的試劑，氧化效率通常在90%～97%[10,12,23]，與本文中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中使用的氨基磺酸還原劑濃度均為80 mmol/L。

3.2 Redox-MIMS法的檢測(cè)限、精密度和線性范圍

實(shí)驗(yàn)同時(shí)對(duì)3組相同的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)限采用IUPAC規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行計(jì)算，公式為

式中，LOD表示檢測(cè)限；K為與置信濃度有關(guān)的常數(shù)（本實(shí)驗(yàn)中K為3，置信度為99.6%）；Sb為空白標(biāo)準(zhǔn)偏差；m為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。以標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）代表方法的精密度。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Redox-MIMS法的檢測(cè)限為0.5 μmol/L，精密度為0.8%，在一定程度上本研究建立的Redox-MIMS法略顯優(yōu)勢(shì)[13]。如圖4所示，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)溶液系列最高濃度超過150 μmol/L時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率發(fā)生顯著性降低（p<0.001），因此該法的線性范圍為0～150 μmol/L，這與次溴酸鈉氧化劑的氧化能力有關(guān)，按照本研究的操作流程，Exetainer瓶?jī)?nèi)150 μmol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液最終的濃度約為25 μmol/L，這與次溴酸鈉氧化劑的氧化能力的上限相吻合[10,23]，可以滿足 目前對(duì)于沉積物加富樣品中測(cè)定的要求。

圖4 Redox-MIMS法標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍Fig. 4 Linear range of standard curve using Redox-MIMS method

3.3 Redox-MIMS法與OX-MIMS法的比較

為將Redox-MIMS法與目前廣泛使用的OXMIMS法進(jìn)行比較，將同一組標(biāo)準(zhǔn)溶液采用上述兩種方法測(cè)定并繪制工作曲線進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Redox-MIMS法的工作曲線斜率相對(duì)較低，約為OXMIMS法的96%，這也與上文所述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符，即與次溴酸鈉氧化劑的氧化效率有關(guān)。

為計(jì)算兩種方法產(chǎn)生的30N2占15N2的比例，我們分別對(duì)使用兩種方法測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)溶液產(chǎn)生的29N2、30N2和15N2（15N2=29N2+2×30N2）對(duì)濃度作圖進(jìn)行比較（圖5）。采用OX-MIMS法測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)溶液產(chǎn)生的15N2幾乎全部為30N2，而采用Redox-MIMS法產(chǎn)生的幾乎全部為29N2。這說明Redox-MIMS法能夠有效避免產(chǎn)生30N2。另外，在實(shí)際測(cè)樣中29N2相對(duì)于30N2能夠更快的在檢測(cè)器中達(dá)到平衡，在進(jìn)樣量更少的情況下29N2的曲線也可以出現(xiàn)測(cè)定的峰值平臺(tái)以完成定量分析。因此，采用Redox-MIMS法的測(cè)樣時(shí)間在筆者所用的MIMS上被縮短至2 min/樣品（圖6），而一般采用MIMS進(jìn)行29N2和30N2同時(shí)測(cè)定需要3～5 min的時(shí)間，由此可知，Redox-MIMS法進(jìn)一步提高了測(cè)樣效率。

圖5 OX-MIMS法（a）和Redox-MIMS法（b）測(cè)定產(chǎn)生29N2和30N2的比例Fig. 5 Ratios of 29N2 and 30N2 produced using OX-MIMS method (a) and Redox-MIMS method (b)

圖6 OX-MIMS法（a）和Redox-MIMS法（b）測(cè)定的曲線Fig. 6 Detection curve using OX-MIMS method (a) and Redox-MIMS method (b)

3.4 萊州灣沉積物的DNRA速率測(cè)定

萊州灣3個(gè)站位的沉積物中15N加富培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。對(duì)于加富的實(shí)驗(yàn)組，15N2并沒有顯著增加（圖7b1至圖7b3，p>0.05），說明預(yù)培養(yǎng)已經(jīng)將大部分的O2和去除；對(duì)于加富+的實(shí)驗(yàn)組，樣品培養(yǎng)過程中29N2隨時(shí)間顯著增加（圖7c1至圖7c3，p<0.05），說明各站位的沉積物中均發(fā)生厭氧銨氧化過程；對(duì)于加富的實(shí)驗(yàn)組，樣品培養(yǎng)過程中30N2和均隨時(shí)間顯著增加（圖7a1至圖7a3和圖7d1至圖7d3，p<0.05），說明各站位沉積物中均存在反硝化和DNRA過程。進(jìn)一步采用文獻(xiàn)[22]的方法計(jì)算3種異化硝酸鹽還原速率（以N計(jì)）。結(jié)果表明（圖8），萊州灣3個(gè)站位的沉積物中的異化硝酸鹽還原過程均以反硝化為主，占比為88.5%～90.2%；其次為DNRA，占比為7.0%～9.5%；厭氧銨氧化占比最低，為0.4%～2.8%。

圖7 萊州灣H1-7、S5、H2-7站位沉積物不同15N加富培養(yǎng)體系中15N2和濃度隨時(shí)間變化Fig. 7 15N2 and concentration production with time changes in different 15N tracer enrichment incubation systems of sediments in stations H1-7, S5, H2-7 in the Laizhou Bay

圖8 各站位異化硝酸鹽還原速率占比情況Fig. 8 Proportion of each dissimilatory nitrate reduction process in different stations

采用Redox-MIMS法和OX-MIMS法兩種方法測(cè)得的DNRA速率（以N計(jì)）以及DNRA占異化硝酸鹽還原的比例（xDNRA）并無顯著性差異（圖9，p>0.05）。說明Redox-MIMS法在對(duì)OX-MIMS進(jìn)行優(yōu)化的基礎(chǔ)上，同樣適用于15N加富沉積物泥漿培養(yǎng)樣品中的的測(cè)定。

圖9 采用兩種方法測(cè)定的DNRA潛在速率以及xDNRA值Fig. 9 Determination results of DNRA potential rates and xDNRA using two different methods

4 結(jié)論

本研究探索建立了一種次溴酸鈉氧化-氨基磺酸還原測(cè)定沉積物15N加富樣品中的新方法（Redox-MIMS法）。方法檢測(cè)限為0.5 μmol/L，精密度為0.8%，線性范圍為0～150 μmol/L。相對(duì)于目前廣泛使用的OX-MIMS法，Redox-MIMS法反應(yīng)條件更加溫和，試劑相對(duì)易得，并且產(chǎn)生的15N2絕大部分為29N2，有效避免了30N2帶來的受O2影響、在檢測(cè)器中平衡較慢且測(cè)試波動(dòng)較大的一系列問題，同時(shí)進(jìn)一步顯著提升了測(cè)定效率（2 min/樣品），且具有樣品消耗少（1 mL）、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。本研究同時(shí)對(duì)萊州灣3個(gè)站位的沉積物樣品進(jìn)行了15N加富培養(yǎng)，證實(shí)萊州灣沉積物中同時(shí)存在反硝化、厭氧銨氧化以及DNRA 3種異化硝酸鹽還原過程，并且以反硝化過程為主導(dǎo)，DNRA次之，厭氧銨氧化最弱。通過兩種不同方法測(cè)定并計(jì)算DNRA速率的對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用Redox-MIMS法測(cè)定的DNRA潛在速率與采用OX-MIMS法測(cè)定的結(jié)果并無顯著性差異，說明Redox-MIMS法同樣適用于15N加富沉積物泥漿培養(yǎng)樣品中的的測(cè)定，有望未來在沉積物氮循環(huán)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

致謝：感謝海洋化學(xué)理論與工程技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室張國(guó)玲實(shí)驗(yàn)師在營(yíng)養(yǎng)鹽自動(dòng)分析儀的使用方面提供的指導(dǎo)。感謝許澤浩同學(xué)在樣品采集方面提供的幫助。感謝實(shí)驗(yàn)室羅暢同學(xué)在實(shí)驗(yàn)操作以及MIMS儀器使用方面的幫助和指導(dǎo)。