于寶丹，陳 聰，柯吳堅(jiān)，呂 萍*

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 檢驗(yàn)科， 廣東 廣州 510120； 2.南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院 皮膚科， 廣東 廣州 510095)

梅毒是一種由梅毒螺旋體(Treponemapallidum，T.pallidum,Tp)感染引起的慢性傳染性疾病，可合并全身多系統(tǒng)的損害。許多研究證實(shí)，Tp通過(guò)黏附于宿主上皮細(xì)胞，穿透組織屏障，侵入內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接，從而進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，導(dǎo)致全身廣泛播散[1]。因此，梅毒螺旋體穿透組織屏障是導(dǎo)致多組織器官感染的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。既往已經(jīng)發(fā)現(xiàn)神經(jīng)梅毒患者腦脊液中的尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinse-plasminogen activator, uPA)顯著高于未累及神經(jīng)系統(tǒng)的梅毒患者[2]，這一結(jié)果提示uPA可能在Tp穿透血腦屏障播散至中樞神經(jīng)系統(tǒng)過(guò)程中發(fā)揮作用。梅毒螺旋體的外膜蛋白是 Tp 的主要免疫反應(yīng)組分，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫應(yīng)答[3]，其中梅毒螺旋體47 ku膜蛋白(Tp47) 含量高、免疫原性強(qiáng)，在梅毒的致病機(jī)制研究和臨床診斷中具有重要意義[4]。本研究構(gòu)建了人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein/vascular endothelial cells,HUVECs)單層模型，通過(guò)觀察重組Tp特異性膜蛋白Tp47(recombinant Tp protein Tp47，rTpp47)對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞合成uPA的調(diào)控及其對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響，進(jìn)一步探討rTpp47在梅毒發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞：人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)和人單核-巨噬細(xì)胞系THP-1為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑：重組蛋白 Tpp47(rTpp47)由廣州洛孚生物科技有限責(zé)任公司合成，已去除內(nèi)毒素，純度>90%；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、FITC 標(biāo)記的葡聚糖(Gibco公司)；佛波酯(PMA)(索萊寶公司)；阿米洛利(amiloride)(Merck公司)；Transwell小室(Coning公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：HUVECs、THP-1 細(xì)胞均培養(yǎng)于含10%胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基(含 0.05%的青鏈霉素雙抗)，置于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。

1.2.2 THP-1巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)：取生長(zhǎng)良好的對(duì)數(shù)期THP-1細(xì)胞， 1 000 r/min離心5 min，棄上清，新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，顯微鏡下計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL鋪于6孔板內(nèi)，同時(shí)加入終濃度為100 ng/mL的佛波酯(PMA)繼續(xù)培養(yǎng)48 h，誘導(dǎo)為貼壁的THP-1巨噬細(xì)胞。

1.2.3 不同濃度rTpp47與THP-1細(xì)胞共培養(yǎng)：取PMA刺激48 h后的THP-1細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞數(shù)為3×105個(gè)/孔，然后加入不同濃度的rTpp47(分別為0.1、0.5和1 μg/mL)，培養(yǎng)24 h后集培養(yǎng)上清，1 000 r/min離心5 min后取上清液，用離心沉淀的細(xì)胞提取細(xì)胞蛋白，分別用ELISA和Western blot檢測(cè)uPA表達(dá)。另取一組THP-1細(xì)胞接種于6孔板，同時(shí)加入rTpp47(0.5 μg/mL)和uPA合成抑制劑阿米洛利(分別為0、50、100、200 μmol/L)，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清檢測(cè)uPA含量。

1.2.4 Transwell 細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)：取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的HUVECs鋪于Transwell小室6孔板的下室，細(xì)胞濃度為3×105個(gè)/mL/孔，24 h后更換培養(yǎng)基，并在Transwell上室加入PMA誘導(dǎo)后的THP-1細(xì)胞，每孔加入THP-1細(xì)胞3×105個(gè)，每孔培養(yǎng)基總體積為2.5 mL。共培養(yǎng)的細(xì)胞分成3組，分別為uPA合成抑制劑阿米洛利組(50 μmol/L)、rTpp47(0.5 μg/mL)組以及rTpp47(0.5 μg/mL)+阿米洛利(50 μmol/L)組。共培養(yǎng)24 h后，收集下室的HUVECs，提取細(xì)胞蛋白。

1.2.5 用 FITC 標(biāo)記的葡聚糖漏出法測(cè)定 HUVECs相對(duì)通透性：將HUVECs按照2×105個(gè)/孔接種于已鋪鼠尾膠原的Transwell (24孔板，孔徑為3 μm)上室，200 μL細(xì)胞懸液，Transwell下室添加700 μL完全培養(yǎng)基。每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況并且全量換液，細(xì)胞生長(zhǎng)至2 d后已達(dá)到完全匯合，棄去培養(yǎng)基，在每個(gè)Transwell上下室分別加入rTpp47(0.5 μg/mL)刺激24 h后的THP-1細(xì)胞條件培養(yǎng)基，以不加rTpp47(0.5 μg/mL)刺激的THP-1細(xì)胞條件培養(yǎng)基作為對(duì)照組，分別作用6、12及24 h后，無(wú)菌PBS沖洗3次，在Transwell上室加入終濃度為1 mg/mL的 FITC-葡聚糖200 μL，下室更換為無(wú)菌PBS 700 μL，從下室取樣品100 μL，即為t=0 的樣品，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育30 min，在每個(gè)下室取樣品100 μL，即t=30min的樣品。避光保存，待樣品收集完全后置于96孔板中，用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)為490 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為520 nm，檢測(cè)滲透到下室的FITC-葡聚糖的熒光強(qiáng)度，通過(guò)計(jì)算t=30 min的熒光強(qiáng)度與t=0時(shí)的熒光強(qiáng)度之比判斷內(nèi)皮細(xì)胞的通透性。

1.2.6 ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清中的uPA含量：實(shí)驗(yàn)前0.5 h，將試劑盒恢復(fù)至室溫，每孔加入100 μL稀釋液，然后分別加入50 μL的標(biāo)準(zhǔn)品、空白對(duì)照和待檢樣品，室溫下?lián)u床(500 r/min)孵育2 h。然后移棄液體，洗板4次，在吸水紙上拍干，每孔加入200 μL的uPA 偶聯(lián)物，用封板膜封板后放置搖床室溫孵育2 h，洗板后加入200 μL底物，室溫、避光孵育30 min，每孔加入50 μL終止液，5 min內(nèi)于酶標(biāo)儀450 nm處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后檢測(cè)各個(gè)孔吸光度(A)值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度及校準(zhǔn)后的A值制作出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，再根據(jù)所測(cè)樣品的校準(zhǔn)后A值，用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出樣品的蛋白濃度。

1.2.7 Western blot實(shí)驗(yàn)：收集培養(yǎng)的細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min。裂解上清行SDS-PAGE。將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上后，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗(1∶1 000)兔抗鼠uPA、p-PKC、PKC、GAPDH、claudin-5抗體，4 ℃緩慢振蕩過(guò)夜。洗膜3次，加入辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(1∶5 000)，37 ℃緩慢振蕩1 h。ECL化學(xué)發(fā)光法試劑作用于PVDF膜5 min，曝光膠片。用 Image-J軟件進(jìn)行灰度值分析，以目的蛋白與GAPDH的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 rTpp47對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞表達(dá)和分泌uPA的影響

隨著rTpp47濃度的升高，THP-1細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的uPA也逐漸增多(圖1A,B)，細(xì)胞培養(yǎng)上清中的uPA含量也逐漸升高(圖1C)。0.5 μg/mL的rTpp47刺激THP-1細(xì)胞分泌的uPA顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。1 μg/mL的rTpp47組uPA的含量高于0.5 μg/mL的rTpp47組，但兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用0.5 μg/mL的rTpp47。

2.2 rTpp47與THP-1巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的上清液對(duì)單層血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)通透性的影響

6 h的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組血管內(nèi)皮細(xì)胞相對(duì)通透性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，12和24 h對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的血管內(nèi)皮細(xì)胞相對(duì)通透性差異明顯(P<0.05 和P<0.000 1)(圖2)。

2.3 阿米洛利對(duì)THP-1細(xì)胞分泌uPA的抑制作用

50 μmol/L的阿米洛利顯著抑制了rTpp47刺激THP-1細(xì)胞分泌uPA的功能(P<0.000 1)，并且阿米洛利的抑制作用呈濃度依賴性(圖3)?？紤]到高濃度阿米洛利的細(xì)胞毒作用，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用低濃度的50 μmol/L的阿米洛利。

2.4 THP-1分泌的uPA對(duì)HUVECs緊密連接蛋白claudin-5表達(dá)的影響

0.5 μg/mL的rTpp47顯著抑制了HUVECs的claudin-5蛋白表達(dá)，而50 μmol/L的阿米洛利也改善了rTpp47對(duì)HUVECs的claudin-5蛋白表達(dá)的抑制作用(P<0.05)(圖4)。

A.representative pictures of Western blot; B.uPA expressed in THP-1 cells gradually increased when the concentration of rTpp47 increased,*P<0.05 compared with 0 μg/mL; C.uPA secreted by THP-1 cells gradually increased when the concentration of rTpp47 increased by ELISA; *P<0.05/0.001 compared with 0 μg/mL

*P<0.05, **P<0.000 1 compared with control group圖2 rTpp47與THP-1巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的上清液促進(jìn)單層血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)通透性升高Fig 2 Supernatant of the co-culture of rTpp47 and THP-1 macrophages promoted the increase of the permeability of monolayer vascular end-

*P<0.05 compared with 100 μmol/L amiloride group; #P<0.000 1 compared with 0 μmol/L amiloride group圖3 uPA活性抑制劑抑制THP-1細(xì)胞分泌uPAFig 3 uPA activity inhibitor suppressed the secretion of uPA by THP-1 n=3)

2.5 PKC信號(hào)通路參與rTpp47誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞表達(dá)uPA

rTpp47誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞表達(dá)uPA的同時(shí)，THP-1細(xì)胞內(nèi)磷酸化PKC顯著增多(P<0.05)，uPA活性抑制劑阿米洛利顯著抑制了rTpp47誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞表達(dá)uPA和PKC的磷酸化(P<0.05)(圖5)。

3 討論

梅毒的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，其與細(xì)胞免疫學(xué)密切相關(guān)。Tp膜蛋白可激活炎性反應(yīng)細(xì)胞，釋放炎性介質(zhì)、細(xì)胞因子，造成組織損傷或誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡。血管內(nèi)皮屏障是由內(nèi)皮細(xì)胞單層和基膜組成的通透屏障，控制血管內(nèi)外物質(zhì)交換。炎性介質(zhì)、病原微生物及其代謝成分均可損傷內(nèi)皮屏障功能，引起組織、器官水腫和功能障礙[5-6]。有研究顯示Tp侵入人體后出現(xiàn)局部的單核巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)[7]。

本研究利用rTpp47刺激THP-1巨噬細(xì)胞，觀察巨噬細(xì)胞表達(dá)和分泌uPA的影響，以及uPA對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響。本研究結(jié)果顯示 rTpp47顯著刺激THP-1細(xì)胞合成和分泌uPA，并且呈劑量依賴關(guān)系；rTpp47與THP-1巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的上清液促進(jìn)單層血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性顯著升高，并且THP-1細(xì)胞與HUVECs共培養(yǎng)情況下，HUVECs緊密連接蛋白claudin-5表達(dá)顯著下調(diào)，而uPA活性抑制劑阿米洛利改善了rTpp47對(duì)HUVECs的claudin-5蛋白表達(dá)的抑制。據(jù)此推測(cè)rTpp47可能刺激THP-1細(xì)胞分泌uPA，而uPA 損傷了血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障中的緊密連接蛋白claudin-5，導(dǎo)致單層血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性升高。單層血管內(nèi)皮的屏障功能是通過(guò)細(xì)胞間以及細(xì)胞與胞外基質(zhì)的連接物質(zhì)共同調(diào)節(jié)的[8]。內(nèi)皮間的緊密連接和連接蛋白的特性決定細(xì)胞連接的通透性，其中緊密連接組織結(jié)構(gòu)完整性起到重要作用[9]。Claudin-5 是緊密連接蛋白 claudins 家族的蛋白質(zhì)成員，參與內(nèi)皮緊密連接的必需膜蛋白, 是內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的指標(biāo)[10-11]，其表達(dá)過(guò)少或者重新分布，與內(nèi)皮細(xì)胞的高通透性有關(guān)。

A.representative pictures of Western blot; B.relative expression of claudn-5 in HUVECs; *P<0.05 compared with amiloride; #P<0.05 compared with rTpp47+amiloride

A.representative pictures of Western blot; B.relative expression of uPA in THP-1 cells; C.relative expression of p-PKC in THP-1 cells; *P<0.05 compared with amiloride; #P<0.05 compared with rTpp47+amiloride

有研究發(fā)現(xiàn)，PKC信號(hào)通路在膿毒血癥誘導(dǎo)的uPA激活中發(fā)揮了重要作用[12]，PKC信號(hào)通路激活介導(dǎo)了人結(jié)腸癌細(xì)胞表達(dá)uPA[13]。本結(jié)果顯示，rTpp47誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞表達(dá)uPA的同時(shí)，THP-1細(xì)胞內(nèi)磷酸化PKC顯著增多，uPA活性抑制劑阿米洛利抑制了rTpp47誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞表達(dá)uPA和PKC的磷酸化，證實(shí)PKC信號(hào)通路參與THP-1細(xì)胞合成uPA相關(guān)。

本研究顯示，梅毒螺旋體膜蛋白 Tp47 通過(guò)PKC信號(hào)途徑，在體外激活THP-1巨噬細(xì)胞，促進(jìn)其合成和分泌uPA，增強(qiáng)損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性，這在梅毒發(fā)病的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制中可能起重要作用。 進(jìn)一步研究膜蛋白 Tp47 在炎性細(xì)胞激活和內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用，將對(duì)深入研究梅毒的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制具有重要的意義。