劉 健

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院，北京 100005)

人類的很多疾病都與基因有著密切的關(guān)系，基因治療是在核酸水平上對細(xì)胞生理機(jī)能進(jìn)行干預(yù)的治療技術(shù)，可通過導(dǎo)入正常基因以替代缺失或異常突變的基因，或抑制非正常的內(nèi)源性基因的功能，對基因異常所導(dǎo)致的疾病進(jìn)行治療。此外，通過核酸水平的調(diào)控可以對目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行工程化改造，在原位產(chǎn)生有益的功能性蛋白[1]，從而實現(xiàn)基因-細(xì)胞聯(lián)合治療，這一策略在再生醫(yī)療、 免疫治療、 RNA疫苗等領(lǐng)域具有重要的價值。

用于基因治療的核酸類藥物通常會編碼特定的蛋白，或基于堿基互補(bǔ)原理對靶標(biāo)基因進(jìn)行調(diào)節(jié)。與傳統(tǒng)小分子化學(xué)藥物和抗體類藥物相比，基于序列的核酸藥物設(shè)計更為簡單方便，而且受成藥靶點(diǎn)的限制較少，對胞內(nèi)和胞膜上的蛋白均可發(fā)揮作用。此外，在哺乳動物的基因組中，只有大約不足3%的DNA會最終表達(dá)為蛋白，而大量的非編碼RNA(noncoding RNA)也在生命活動的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，因此，以核酸分子為靶標(biāo)的核酸藥物擁有更廣的作用范圍。但是，核酸類藥物的臨床應(yīng)用面臨很多的障礙，如體內(nèi)穩(wěn)定性差、難以高效進(jìn)入靶細(xì)胞等。要發(fā)揮核酸藥物的作用，通常需要利用合適的載體幫助核酸藥物進(jìn)入目標(biāo)細(xì)胞并到達(dá)特定的胞內(nèi)位置。因此，開發(fā)安全、高效的核酸遞送系統(tǒng)是基因治療成功的基石。

1 基因治療中的核酸藥物

核酸藥物分為DNA藥物和RNA藥物，主要包括質(zhì)粒DNA(plasmid DNA，pDNA)、反義寡核苷酸(antisense oligonucleotide，ASO)、小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)、小RNA(microRNA，miRNA)、短發(fā)卡RNA(short hairpin RNA，shRNA)、信使RNA(messenger RNA，mRNA)等[2]。近年來核酸藥物獲得批準(zhǔn)的速度明顯加快，其適應(yīng)癥也更加廣泛，已有不同類型的核酸藥物進(jìn)入臨床試驗階段，有望成為繼小分子化學(xué)藥物和抗體藥物后的第三大類型藥物。

1.1 基于RNA干擾的核酸藥物

RNA干擾技術(shù)在2001年被《Science》雜志評為當(dāng)時的十大科學(xué)進(jìn)展之一。自1998年研究人員首次發(fā)現(xiàn)雙鏈RNA(double strand RNA，dsRNA)的RNA干擾(RNA interference，RNAi)現(xiàn)象以來，基于RNA干擾治療方法的研究逐漸成為熱點(diǎn)。RNAi是真核生物抵御外源基因入侵的一種天然防御機(jī)制，可以抵御病毒感染和轉(zhuǎn)座子的插入。同時，RNAi也能夠調(diào)控基因表達(dá)。迄今已發(fā)現(xiàn)siRNA、miRNA和shRNA可通過介導(dǎo)靶標(biāo)mRNA的降解或抑制mRNA翻譯，實現(xiàn)序列特異性的靶基因敲除。RNA藥物的優(yōu)點(diǎn)是不需要向細(xì)胞核內(nèi)傳遞，插入宿主基因組的風(fēng)險低，主要缺點(diǎn)是穩(wěn)定性低和較高的免疫原性風(fēng)險。

在可介導(dǎo)RNAi的各種核酸分子中，siRNA是最常見的一類。siRNA是一種雙鏈RNA，長度一般在21～23個核苷酸左右，可以直接導(dǎo)入細(xì)胞，也可由長雙鏈RNA或shRNA在胞內(nèi)通過核酸酶Dicer切割生成。進(jìn)入胞內(nèi)的siRNA會與Argonaute蛋白及Dicer組成沉默復(fù)合物(RISC)，并解開成為單鏈。之后可以引導(dǎo)RISC識別并切割與其互補(bǔ)的靶mRNA序列，使其降解，從而導(dǎo)致特定靶基因的敲除[3]。2018年8月10日，美國食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)了第一個siRNA藥物patisiran(Onpattro)，它是一種作用于肝臟的siRNA，用于治療遺傳性轉(zhuǎn)甲狀腺蛋白淀粉樣變性(hATTR)引起的多發(fā)性神經(jīng)病[4]。2019年11月第二款RNAi藥物givlaari獲得批準(zhǔn)進(jìn)入臨床，用于治療急性肝性卟啉癥(AHP)[5]。2020年有兩款新的siRNA藥物獲得批準(zhǔn)，分別用于原發(fā)性高草酸尿癥[6]及成人高膽固醇血癥的治療[7]。此外，還有用于肝臟、腎臟和眼部適應(yīng)癥的多種siRNA候選藥物正處于臨床試驗的不同階段。siRNA藥物屬于人工制備的外源性siRNA，其主要問題是進(jìn)入機(jī)體后可能會引起免疫反應(yīng)，導(dǎo)致干擾素及炎性因子的產(chǎn)生，或由于“脫靶效應(yīng)”而導(dǎo)致正常功能基因的表達(dá)沉默。通過對鏈端或核苷進(jìn)行適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)修飾(如反義鏈5’端的甲氧基化修飾等)，可在一定程度上減少這些不良事件的發(fā)生。

除siRNA外，單鏈的miRNA也可以調(diào)節(jié)mRNA的翻譯，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、增殖等過程，目前已發(fā)現(xiàn)約2 000種內(nèi)源miRNA。miRNA的異常與腫瘤等多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)[8]。miRNA藥物可分為拮抗劑(antagonist)及模擬物(mimics)兩類。前者通過堿基互補(bǔ)配對與內(nèi)源miRNA結(jié)合，并通過RISC對miRNA進(jìn)行降解或阻礙其翻譯，從而抑制其功能；后者的序列與人體內(nèi)具有正常功能的miRNA類似，將其導(dǎo)入miRNA缺失的靶細(xì)胞，可使細(xì)胞恢復(fù)正常生理功能。盡管自miRNA發(fā)現(xiàn)至今已有約20年的時間，有部分miRNA藥物的研發(fā)已進(jìn)入臨床試驗階段，但尚未有藥物獲得批準(zhǔn)進(jìn)入臨床使用。

1.2 基于反義核酸技術(shù)的核酸藥物

反義核酸包括反義RNA和反義DNA，是指能與特定mRNA或DNA精確互補(bǔ)，從而特異阻斷其翻譯或轉(zhuǎn)錄的核苷酸片段。反義RNA與靶標(biāo)mRNA結(jié)合后，通過空間位阻效應(yīng)阻止核糖體與mRNA結(jié)合，或抑制轉(zhuǎn)錄后mRNA的加工修飾，并能夠激活內(nèi)源性RNase降解mRNA，從而抑制靶蛋白的翻譯；反義DNA通過與基因DNA雙鏈的調(diào)控區(qū)特異結(jié)合形成DNA三聚體(triplex)，或與DNA編碼區(qū)結(jié)合，從而抑制轉(zhuǎn)錄的順利進(jìn)行。目前應(yīng)用最多的反義核酸藥物是包含15～25個核苷酸的單鏈寡聚核苷酸(ASO)，自1978年被報道之后，已有多款藥物被批準(zhǔn)用于杜氏營養(yǎng)不良癥、家族性高膽固醇血癥、脊髓性肌萎縮癥等疾病的治療，是當(dāng)前獲得批準(zhǔn)藥物數(shù)量最多的一類核酸藥物[9]。

1.3 編碼蛋白的核酸藥物

質(zhì)粒是應(yīng)用最廣泛的一類基因?qū)牍ぞ?，多為環(huán)形雙鏈DNA，存在于胞質(zhì)中，能夠自行復(fù)制，是細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立于染色體外的遺傳物質(zhì)。相對于借助病毒的基因?qū)爰夹g(shù)，質(zhì)粒具有易于生產(chǎn)、免疫原性低、安全穩(wěn)定、使用方便等優(yōu)點(diǎn)，使其成為基因治療中極為重要的一類藥物。自1995年以來，獲得批準(zhǔn)的基因治療試驗方案中大約有25%使用了質(zhì)粒DNA[10]。質(zhì)粒不僅可以編碼蛋白，也可以編碼mRNA、miRNA或siRNA等其他功能性RNA藥物，甚至可以同時編碼多種不同類型的藥物，從而能為基因治療提供更多的選擇方案。但是，質(zhì)粒DNA通常分子尺寸較大，這為其向胞內(nèi)的遞送增加了一定的困難。

另一種在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)功能性蛋白的方法是利用mRNA。與質(zhì)粒相比，直接將編碼特定蛋白的mRNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞，可以跨過轉(zhuǎn)錄步驟直接進(jìn)行翻譯表達(dá)，對于只需要一過性蛋白表達(dá)的場合更加直接方便。在COVID-19疫情暴發(fā)之后，基于mRNA的核酸疫苗技術(shù)在疫情防控中發(fā)揮了重要的作用，充分顯示了mRNA疫苗在時效性及有效性上的優(yōu)勢。基于mRNA疫苗技術(shù)的mRNA-1273是全球最先進(jìn)入臨床試驗的新冠疫苗，Ⅲ期臨床的最終分析數(shù)據(jù)顯示，其對COVID-19的保護(hù)效力能達(dá)到94%；另一款mRNA疫苗BNT162b2在Ⅲ期臨床中同樣顯示了對COVID-19高達(dá)95%的保護(hù)效力[11-12]。此外，在腫瘤免疫治療領(lǐng)域，個性化癌癥疫苗mRNA-4157與檢查點(diǎn)抑制劑療法的結(jié)合在多種實體腫瘤中顯示了良好的抗癌潛力，在Ⅰ期臨床中對頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的的總緩解率(ORR)達(dá)到50%，而單獨(dú)使用檢查點(diǎn)抑制劑治療的ORR僅有14.6%[13]。

1.4 基于基因編輯技術(shù)的核酸藥物

通過基因編輯技術(shù)對細(xì)胞進(jìn)行改造可能是實現(xiàn)基因長期穩(wěn)定表達(dá)或完全敲除的最佳手段之一。用于基因編輯的工具主要包括鋅指核酸酶(zinc finger nuclease，ZFN)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(transcription-activator like effector nuclease, TALEN)和 CRISPR/Cas系統(tǒng)。其中CRISPR/Cas系統(tǒng)在效率、速度和成本方面均具有明顯優(yōu)勢，可以在人類基因組中引入精確的編輯，特別是CRISPR/Cas9作為核酸藥物的應(yīng)用研究最為廣泛，被用于CAR-T細(xì)胞治療、高膽固醇血癥、鐮狀細(xì)胞貧血、地中海貧血和杜氏肌營養(yǎng)不良等多種疾病的治療[14-15]。

與其他單一核酸藥物不同，CRISPR/Cas系統(tǒng)至少需要將引導(dǎo)RNA(gRNA)和Cas9核酸酶兩個組件(進(jìn)行基因插入時還需要模板RNA)按一定比例傳遞到細(xì)胞中才能發(fā)揮最佳的基因編輯效率，實現(xiàn)基于非病毒載體的安全高效遞送非常具有挑戰(zhàn)性[16]。CRISPR/Cas除了可以直接使用Cas蛋白，還可以選擇使用編碼Cas蛋白的mRNA，或者使用同時編碼Cas和gRNA的單個質(zhì)粒，在胞內(nèi)通過轉(zhuǎn)錄/翻譯轉(zhuǎn)化為具有活性的gRNA及Cas核酸酶[17]。有研究報道利用帶有二硫鍵的脂質(zhì)納米顆粒(BAMEA-O16B)在體內(nèi)遞送Cas9 mRNA和sgRNA可實現(xiàn)約80%的高編輯效率[18]。

2 核酸藥物載體

核酸藥物在體內(nèi)的應(yīng)用面臨多重挑戰(zhàn)。首先，由于體內(nèi)存在大量核酸酶，核酸分子很容易被降解，難以單獨(dú)進(jìn)行全身性給藥，極大影響了核酸藥物的成藥性。其次，核酸藥物必須進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核才能發(fā)揮作用，而核酸分子尺寸通常較大，親水性很好，且因分子鏈中存在大量磷酸根，在正常生理pH條件下帶負(fù)電荷，很難穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞。因此，核酸藥物遞送載體及相關(guān)遞送技術(shù)的發(fā)展是基因治療技術(shù)實現(xiàn)臨床應(yīng)用的重要基礎(chǔ)。

核酸載體一般可分為病毒性載體和非病毒性載體兩大類。常見的病毒性載體包括腺相關(guān)病毒、慢病毒、腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒等，由于利用了野生型病毒固有的能力，因而可以高效轉(zhuǎn)染細(xì)胞[19]。目前大多數(shù)的細(xì)胞和基因治療項目所采用的載體都是病毒載體。但病毒載體對核酸分子的尺寸有限制，而且需要復(fù)雜的制備過程，成本較高，更重要的是可能存在免疫原性、致癌性等安全隱患[20]。非病毒載體具有更高的安全性，但其缺點(diǎn)是轉(zhuǎn)染效率較低。近年來，隨著轉(zhuǎn)染效率、特異性和安全性的改進(jìn)，臨床試驗中非病毒載體的數(shù)量逐漸增加[21]。常見的非病毒載體包括陽離子脂質(zhì)、陽離子高分子和多肽等，這些陽離子型的載體在正常生理pH條件下帶正電荷，可以與帶負(fù)電荷的核酸分子形成復(fù)合體，通過對核酸分子進(jìn)行壓縮而減小其分子尺寸，并提供足夠的保護(hù)以對抗核酸酶。同時，復(fù)合體表面多余的正電荷可以使復(fù)合體更容易接近帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜，促進(jìn)核酸分子進(jìn)入細(xì)胞，并可通過質(zhì)子海綿效應(yīng)幫助被內(nèi)吞的核酸分子從溶酶體中逃逸而進(jìn)入胞質(zhì)(圖1)，這一理論近年來已得到了一些影像學(xué)證據(jù)的支持[22]。

圖1 陽離子型載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染Fig 1 Gene transfection mediated by cationic carriers

2.1 陽離子脂質(zhì)

陽離子脂質(zhì)易于合成且轉(zhuǎn)染過程相對簡單，是最常見的一類非病毒基因遞送載體。盡管用于基因遞送的陽離子脂質(zhì)分子具有不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)，但從結(jié)構(gòu)上看，基本都由極性頭基、疏水尾部和連接子構(gòu)成。最普遍的陽離子頭基是各種胺基，而疏水尾部則通常由脂肪鏈或膽固醇等組成，疏水結(jié)構(gòu)域與極性頭基之間由酯鍵、醚鍵等連接。每一個結(jié)構(gòu)域在核酸藥物的傳遞過程中都起著關(guān)鍵作用，且都可以通過適當(dāng)?shù)卣{(diào)整來優(yōu)化載體的性能，例如，通過改變連接子，可調(diào)控脂質(zhì)分子的穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)染效率和生物相容性[23]。陽離子脂質(zhì)可以通過靜電吸附及自組裝與核酸分子形成脂質(zhì)/核酸復(fù)合物，保護(hù)核酸分子和促進(jìn)內(nèi)吞，并幫助核酸分子從溶酶體逃逸，其轉(zhuǎn)染效率取決于脂質(zhì)類型、構(gòu)成及脂質(zhì)/核酸電荷比[24]。雖然單一成分的陽離子脂質(zhì)也可以作為核酸載體，但更普遍的方法是與二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)和膽固醇等輔助脂質(zhì)配合使用，以調(diào)節(jié)脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，幫助脂質(zhì)/核酸復(fù)合物的形成，并促進(jìn)脂質(zhì)體與細(xì)胞膜的相互作用[25]。

2.2 脂質(zhì)納米顆粒

脂質(zhì)納米顆粒(LNP)是另一種廣泛使用的非病毒基因遞送載體，易于加工并可穩(wěn)定儲存，與陽離子脂質(zhì)具有相近的轉(zhuǎn)染效率，并且易于通過功能化修飾而提高細(xì)胞靶向、內(nèi)化及介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的能力[11-12]。球狀囊泡結(jié)構(gòu)的LNP多由可電離的陽離子脂質(zhì)(ionizable lipids)、中性輔助脂質(zhì)、膽固醇、聚乙二醇修飾的脂質(zhì)(PEGylated lipid)構(gòu)成。如首個mRNA疫苗mRNA-1273所使用的載體由一種可電離陽離子脂質(zhì)(SM-102)與三種商業(yè)化脂質(zhì)(DSPC、膽固醇和PEG2000-DMG)組成[26]。成分中的中性輔助脂質(zhì)一般為飽和磷脂，能促進(jìn)層狀脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的形成及穩(wěn)定；膽固醇有較強(qiáng)的膜融合性，可促進(jìn)mRNA內(nèi)化和進(jìn)入胞質(zhì)；PEG化脂質(zhì)用于免疫逃逸和增加穩(wěn)定性；最關(guān)鍵的可離子化脂質(zhì)在生理pH值下保持中性，以降低其毒性和免疫原性；在低pH值下則帶正電荷，從而能通過靜電力與核酸相互作用，并在被細(xì)胞內(nèi)化后實現(xiàn)溶酶體逃逸。國際上首個獲得批準(zhǔn)的RNAi治療藥物也同樣使用了脂質(zhì)納米顆粒[27]。此外，脂質(zhì)納米顆粒可以用來遞送CRISPR/Cas9組分，在動物模型體內(nèi)實現(xiàn)了基因組編輯[28]。目前批準(zhǔn)的脂質(zhì)納米顆粒在儲存運(yùn)輸和使用等方面還存在不足之處，比如需要在低溫下才能長期保存。

2.3 陽離子聚合物

基于合成或天然陽離子聚合物(CP)的核酸遞送系統(tǒng)在基因治療技術(shù)開發(fā)中受到大量關(guān)注。常見的包括聚乙烯亞胺(PEI)、多聚賴氨酸(PLL)、殼聚糖等。CP具有較高的正電荷密度，可與帶負(fù)電荷的核酸分子相互作用，對核酸分子進(jìn)行壓縮，形成尺寸較小的聚電解質(zhì)復(fù)合物(PIC)[29]；同時，可以提供強(qiáng)大的pH緩沖能力，有利于復(fù)合物從內(nèi)體逃逸[22]。除了線性高分子外，樹枝狀聚酰胺胺(PAMAM)、聚丙烯亞胺(PPI)等具有納米尺度和徑向?qū)ΨQ性的三維樹狀結(jié)構(gòu)大分子也經(jīng)常被用于核酸藥物載體，其優(yōu)勢在于可以通過吸附介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用促進(jìn)內(nèi)化，通過表面胺基有效壓縮核酸并保護(hù)其不被酶降解，同時通過核心大量的三級胺基提供pH緩沖能力[30]。

PEI、PDMAEMA和PLL等常用CP都是不可降解的，且具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，從而嚴(yán)重限制了其應(yīng)用。通常認(rèn)為CP細(xì)胞毒性與其分子尺寸及正電荷密度相關(guān)[31]。具有高分子量和電荷密度的非降解性CP可能在細(xì)胞中積累，最終導(dǎo)致高細(xì)胞毒性；而低分子量及低電荷密度的CP雖然更易于被清除，毒性較低，但會降低其壓縮核酸分子的能力，影響轉(zhuǎn)染效率。如低分子量PEI(～600 Da)毒性較小，但其轉(zhuǎn)染效率遠(yuǎn)低于常被作為金標(biāo)準(zhǔn)的25 kDa支鏈PEI。因此，如何在毒性及轉(zhuǎn)染效率間取得平衡是CP設(shè)計所面臨的主要問題。Ding等通過在可生物降解的聚乳酸(PLA)分子上導(dǎo)入支鏈PEI合成了PEI-PLA共聚物，克服了PEI的毒性和不可降解的缺點(diǎn)，在有血清存在的情況下仍顯示了較高的轉(zhuǎn)染效率[32]。此外，Wu等將含有組氨酸和賴氨酸的連接子(linker)與低分子量PEI (600 Da)分子偶聯(lián)，合成了高分子量共聚物，使其獲得了較低的毒性及較高的轉(zhuǎn)染效率[33]。

另一種策略是使用可生物降解的聚合物，特別是明膠、白蛋白、殼聚糖(CS)、透明質(zhì)酸(HA)、葡聚糖和β-環(huán)糊精(β-CD)等天然來源的蛋白或多糖分子[34]。這些生物可降解高分子在生物相容性方面具有較好的優(yōu)勢，而且具有與特定組織或細(xì)胞的天然親和性，如腫瘤細(xì)胞高表達(dá)HA受體，肝臟細(xì)胞高表達(dá)脫唾液酸糖蛋白受體等，因此可以實現(xiàn)一定的靶向遞送效果。由于多數(shù)天然高分子缺乏足夠的正電荷，為了負(fù)載核酸分子，通常需要進(jìn)行陽離子化改性[35]。除了利用CP與核酸分子的自組裝作用，還可以利用預(yù)先制備的具有特定尺寸及空間結(jié)構(gòu)的高分子基納米材料(如顆粒、凝膠、膠束等)來負(fù)載核酸分子，并實現(xiàn)被動靶向、環(huán)境響應(yīng)、緩控釋等功能[36]。此外，使用聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)等非正電性的納米顆粒來裝載DNA質(zhì)粒等核酸藥物有可能避免陽離子帶來的細(xì)胞毒性[37]。

2.4 無機(jī)納米顆粒

無機(jī)納米顆粒種類繁多，金納米顆粒、二氧化硅納米顆粒、磁性納米顆粒、碳納米管、量子點(diǎn)等材料已得到了大量的研究[38]。無機(jī)納米顆粒易于進(jìn)行表面修飾改性，由此可對其降解性、生物相容性、免疫原性、核酸負(fù)載能力等進(jìn)行優(yōu)化。除了可以負(fù)載核酸分子，無機(jī)納米顆粒通常具有獨(dú)特的多功能性，使其介導(dǎo)的基因遞送成為一種有吸引力的策略。如量子點(diǎn)在進(jìn)行核酸遞送的同時，可以作為一種高效的熒光探針，實現(xiàn)核酸標(biāo)記和體內(nèi)動態(tài)分布的實時跟蹤[39]；氧化鐵磁性納米顆粒可在磁場作用下更高效地接近并進(jìn)入細(xì)胞，實現(xiàn)高效的磁轉(zhuǎn)染(magnetofection)[40]，還可以實現(xiàn)磁誘導(dǎo)的細(xì)胞/組織靶向及磁共振成像[41]；此外，金納米顆粒的光熱效應(yīng)使其可以觸發(fā)核酸藥物的釋放[42]，或?qū)崿F(xiàn)光熱/基因聯(lián)合治療[43]。

2.5 外泌體

外泌體是由細(xì)胞自然分泌的胞外囊泡，直徑一般為40～160 nm，具有脂質(zhì)雙分子膜結(jié)構(gòu)，內(nèi)部含有蛋白質(zhì)、脂類、DNA和RNA等細(xì)胞成分。外泌體是細(xì)胞間通訊的紐帶，可以包裹胞內(nèi)生成的信息素并將其傳送到其他細(xì)胞內(nèi)，從而控制細(xì)胞集落有序生長。因此，外泌體不僅具有生物相容性，而且不易被免疫清除，使其具有作為基因傳遞載體的天然優(yōu)勢[44]。與脂質(zhì)體相比，外泌體的組成更為復(fù)雜，而且脂膜富含蛋白質(zhì)，能夠?qū)崿F(xiàn)特異性靶向，并具有更高的穩(wěn)定性。然而，由于外泌體的生產(chǎn)及分離純化較為繁復(fù)困難，限制了其作為基因傳遞載體的廣泛應(yīng)用[45]。

2.6 核酸偶聯(lián)物

與脂質(zhì)及高分子復(fù)合物等載體系統(tǒng)相比，核酸藥物與膽固醇、多肽、抗體、核酸適配體或各類小分子直接連接形成的核酸偶聯(lián)物具有體積較小、免疫原性較低、不易被機(jī)體清除的特點(diǎn)，且可通過偶聯(lián)分子改變核酸藥物的體內(nèi)分布及代謝動力學(xué)等性質(zhì)，幫助核酸進(jìn)入到特定的組織和細(xì)胞內(nèi)[46]。核酸偶聯(lián)物中最成功的是N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)修飾介導(dǎo)的肝靶向遞送系統(tǒng)，其可與肝細(xì)胞上高表達(dá)的脫唾液酸糖蛋白(asialoglycoprotein)受體結(jié)合，介導(dǎo)高效率的內(nèi)吞作用。目前已有3款基于GalNAc技術(shù)的核酸藥物獲得批準(zhǔn)進(jìn)入臨床應(yīng)用[47]。但核酸偶聯(lián)物中的核酸分子通常缺少必要的保護(hù)，如何增強(qiáng)核酸分子在生理環(huán)境中的穩(wěn)定性是其面臨的關(guān)鍵問題。研究表明，通過在核苷酸的2’位置進(jìn)行化學(xué)修飾，以及用硫代磷酸鍵取代磷酸二酯鍵等方法，可大幅改善核酸偶聯(lián)物對核酸酶的穩(wěn)定性[48]。此外，分子間連接子的設(shè)計及修飾位置也是重要的因素。如采用環(huán)境敏感的linker，還可以使核酸偶聯(lián)物進(jìn)入細(xì)胞之后與偶聯(lián)物脫離；在siRNA中心部位導(dǎo)入偶聯(lián)分子會獲得更為有效的RNA干擾效果[49]。

3 影響核酸藥物遞送效率的關(guān)鍵問題和對策

基因治療的成功與否，很大程度上依賴于能否以安全的方式將核酸藥物有效輸送到體內(nèi)的目標(biāo)細(xì)胞中。根據(jù)靶器官和給藥途徑的不同，核酸藥物及其載體需要克服多重生物學(xué)屏障[50]，整個過程中仍存在大量的關(guān)鍵性技術(shù)難點(diǎn)。

3.1 增強(qiáng)核酸藥物的穩(wěn)定性，增加體內(nèi)循環(huán)時間

核酸藥物需要保證在未降解情況下到達(dá)目標(biāo)器官/組織/細(xì)胞。但由于各類核酸酶的存在，核酸分子在體內(nèi)環(huán)境中的半衰期非常短。通過對核糖、磷酸骨架、堿基以及核酸鏈末端等進(jìn)行化學(xué)修飾可增加核酸藥物的穩(wěn)定性[48]。此外，利用陽離子脂質(zhì)、陽離子高分子的壓縮和包裹也可以較好地實現(xiàn)對核酸分子的保護(hù)[29]。

核酸復(fù)合物在細(xì)胞外環(huán)境中不穩(wěn)定性和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)介導(dǎo)的免疫清除也是非病毒基因載體面臨的問題。引入DOPE和膽固醇等中性輔助脂類可以增強(qiáng)陽離子脂質(zhì)/DNA復(fù)合物的膠體穩(wěn)定性[25]。此外，聚乙二醇修飾可以減少納米顆粒的聚集，提高其穩(wěn)定性，并可顯著提高非病毒基因載體的免疫逃逸能力，使其不易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除[51]。除了陽離子高分子，親水性的中性聚合物如聚乙烯醇吡咯烷酮也可與核酸分子形成可逆的中性或陰離子復(fù)合體，抑制核酸酶的降解作用[52]。

3.2 改善核酸藥物進(jìn)入特定組織的能力

在全身性給藥的情況下，進(jìn)入血液的核酸藥物需要跨越血管內(nèi)皮屏障才能夠進(jìn)入目標(biāo)器官或組織。特別是對神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基因治療而言，要使核酸藥物通過血腦屏障(BBB)進(jìn)入大腦存在很大挑戰(zhàn)。通過在載體表面修飾特定的靶向分子，如轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的抗體、瘦素等可以幫助其跨越血腦屏障[53]。此外，利用氧化鐵納米顆粒聯(lián)合外部磁場可暫時破壞內(nèi)皮細(xì)胞間連接，激活細(xì)胞旁運(yùn)輸途徑，從而增加血管內(nèi)皮的通透性[54]。

實體腫瘤組織中的血管系統(tǒng)雖然通透性較強(qiáng)，但藥物必須穿過致密的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，并克服高間質(zhì)流體壓力才能到達(dá)深部的腫瘤細(xì)胞。通過高通透性和滯留效應(yīng)(EPR效應(yīng))富集到實體腫瘤的納米顆粒的最佳尺寸通常為100～200 nm，但要實現(xiàn)向腫瘤內(nèi)部擴(kuò)散，這一尺寸卻又過大了。尺寸可動態(tài)改變的納米載體是一種可行的技術(shù)，如利用近紅外光觸發(fā)大小可調(diào)的脂質(zhì)體，不僅延長了血液循環(huán)時間，而且脂質(zhì)體由大(～162 nm)變小(～8.6 nm)后，可促進(jìn)其向腫瘤深部滲透[55]。此外，有研究表明，帶有正電荷和特定配體修飾的納米藥物可基于細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)實現(xiàn)腫瘤內(nèi)的穿透，不需要克服ECM的阻礙[56]。

3.3 高效進(jìn)入細(xì)胞

由于核酸藥物必須進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部才能發(fā)揮作用，因此，穿過細(xì)胞膜是其面臨的重大挑戰(zhàn)。吸附性內(nèi)吞作用、受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用、巨胞飲作用和吞噬作用是非病毒基因載體被細(xì)胞攝取的主要途徑。裸核酸分子的負(fù)電性會妨礙其與細(xì)胞膜的結(jié)合，采用陽離子化載體可以中和核酸分子的負(fù)電荷，增強(qiáng)其與細(xì)胞膜的結(jié)合[29]。一般認(rèn)為，陽離子載體與細(xì)胞膜上的硫酸肝素蛋白多糖(HSPGs)的相互作用會促進(jìn)核酸復(fù)合物的內(nèi)吞。通過精確調(diào)控載體的理化學(xué)性質(zhì)，如表面電位、形狀、尺寸、軟硬度，可以影響細(xì)胞對載體的內(nèi)吞能力[28]；在載體表面修飾細(xì)胞特異性配體可顯著增強(qiáng)其在細(xì)胞表面的結(jié)合[47, 49]。此外，超聲、激光脈沖、電穿孔等物理性輔助技術(shù)也可以促進(jìn)遺傳物質(zhì)向細(xì)胞內(nèi)傳遞[57]，但目前為止只有少數(shù)應(yīng)用于臨床的報道[58]，低通量、侵入性及操作限制應(yīng)該是主要原因之一。將微針與電穿孔技術(shù)結(jié)合的微創(chuàng)電極等研究有助于推動物理性轉(zhuǎn)染技術(shù)的臨床應(yīng)用[58]。

3.4 溶酶體逃逸及胞內(nèi)解離和定位

核酸藥物載體主要以內(nèi)吞方式進(jìn)入細(xì)胞，并最終轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體中。如不能盡快從溶酶體逃逸進(jìn)入到胞質(zhì)中，將面臨酸性(pH值約4.5)和各種水解酶的嚴(yán)酷環(huán)境，從而被迅速降解失活。內(nèi)體/溶酶體逃逸始終是提高非病毒載體轉(zhuǎn)染效率的瓶頸之一。陽離子脂質(zhì)/DNA復(fù)合物可以通過與內(nèi)體膜融合而從內(nèi)體中逃逸，其機(jī)制可能是陽離子聚合物介導(dǎo)的內(nèi)體的物理破壞或質(zhì)子海綿效應(yīng)[22]；其他常見的策略包括借助光熱、磁熱等物理信號刺激[59]，或利用氯喹、蜂毒肽等輔助性藥物，增加溶酶體的不穩(wěn)定性或誘導(dǎo)溶酶體膜通透化[60]，但需要考慮如何避免溶酶體失穩(wěn)及破裂所帶來的細(xì)胞毒性。

進(jìn)入到胞質(zhì)中的核酸分子需要及時與載體分離，以發(fā)揮其生物效應(yīng)。在陽離子脂質(zhì)/核酸復(fù)合物中，帶正電荷的脂質(zhì)與內(nèi)體的膜融合有助于核酸分子的釋放，而陽離子聚合物通常被認(rèn)為更難發(fā)生核酸釋放。通過分子設(shè)計在載體中引入還原響應(yīng)性基團(tuán)是一種可行的策略，如使用雙硫鍵交聯(lián)的載體。由于雙硫鍵在細(xì)胞內(nèi)的高還原性環(huán)境下(谷胱甘肽的濃度比細(xì)胞外環(huán)境中高出約50～1 000倍)會發(fā)生斷裂，有助于核酸分子釋放到胞質(zhì)中[61]。Nie等借助雙硫鍵的還原響應(yīng)性制備了在胞內(nèi)發(fā)生電荷逆轉(zhuǎn)的Hep@PGEA載體，可自加速釋放編碼CRISPR/Cas9的質(zhì)粒DNA，用于原位肝細(xì)胞癌的治療[62]。與此類似，F(xiàn)ang等利用對ROS/GSH更為敏感的二硒鍵交聯(lián)的精胺長鏈(dPSP)與質(zhì)粒DNA自組裝成納米顆粒，并同時負(fù)載吲哚菁綠(ICG)， ICG能在近紅外光下產(chǎn)生單線氧，促進(jìn)dPSP中二硒鍵的降解，從而誘導(dǎo)外源基因的有效表達(dá)，同時降低細(xì)胞毒性[63]。

對于DNA藥物而言，進(jìn)入細(xì)胞核是最后一個重要的限制性步驟，通常只有一小部分DNA能成功進(jìn)入細(xì)胞核。因此，研究DNA核轉(zhuǎn)位機(jī)制以加強(qiáng)這一過程，對提高非病毒基因傳遞效率至關(guān)重要。在分裂活躍的細(xì)胞中，核膜在有絲分裂過程中解體時會允許DNA進(jìn)入，但在非分裂細(xì)胞中，大尺寸的DNA分子可能需要通過添加核定位序列(NLS)，或在DNA分子上共價修飾NLS多肽等分子，以增強(qiáng)其進(jìn)入細(xì)胞核的能力[64]。為了獲得良好的效果，通常需要多種策略組合。如Tan等開發(fā)了一種核-殼納米平臺用于將基因靶向傳遞到視網(wǎng)膜，其內(nèi)核由氨基酸功能化的樹狀大分子和核定位信號(NLS)組成，通過靜電相互作用將內(nèi)核包裹在pH敏感的脂質(zhì)雙分子層中，并以HA-DOPE為最外層涂層。在該納米平臺的幫助下，DNA可以擴(kuò)散到視網(wǎng)膜，被細(xì)胞內(nèi)化，從核內(nèi)體逃逸，最終通過NLS運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞核[65]。

3.5 蛋白吸附

陽離子型載體的正電荷是一柄雙刃劍，正負(fù)電荷的相互作用雖然有利于提高轉(zhuǎn)染效率，但也導(dǎo)致陽離子型載體容易與各類細(xì)胞非特異性結(jié)合；同時，帶正電荷的復(fù)合體還容易吸附大量蛋白，在表面形成蛋白冠，不僅會導(dǎo)致復(fù)合體的電荷及尺寸變化、導(dǎo)致復(fù)合體的不穩(wěn)定，還會阻礙遞送載體對靶細(xì)胞的識別[66]。通過深入理解血清對陽離子載體轉(zhuǎn)染的影響規(guī)律，可以有效指導(dǎo)載體系統(tǒng)的設(shè)計[67]；此外將陰離子化高分子通過靜電自組裝方式在陽離子型核酸遞送系統(tǒng)外形成負(fù)電性外殼，使用蛋白預(yù)包被、或直接利用白蛋白等生物蛋白分子作為核酸載體等策略，也可以減少血液中血清成分的影響[68]。

4 總結(jié)及展望

盡管非病毒載體介導(dǎo)的核酸轉(zhuǎn)染能力有了顯著的提高，但與病毒載體相比仍有較大差距，目前在臨床試驗中占主導(dǎo)地位的依舊是病毒載體。隨著新型核酸藥物的開發(fā)和非病毒遞送技術(shù)的不斷進(jìn)步，基因治療及基因-細(xì)胞聯(lián)合治療實現(xiàn)大規(guī)模臨床應(yīng)用的曙光已經(jīng)開始展現(xiàn)。由于核酸藥物的種類眾多，作用機(jī)制各異，分子尺寸千差萬別，期待采用一種“通用性”載體解決所有核酸藥物遞送問題是不現(xiàn)實的。在進(jìn)入臨床的核酸藥物中，寡聚核苷酸藥物對載體的需求并不強(qiáng)烈，但siRNA分子則高度依賴載體。此外，核酸藥物尺寸是設(shè)計遞送載體時必須考慮的另一個關(guān)鍵因素，miRNA、siRNA等小核酸藥物可以采用直接偶聯(lián)的簡單劑型，質(zhì)粒DNA、mRNA等尺寸較大的核酸藥物(通常長度大于200個核苷酸)則更需要載體的壓縮及包裹；小核酸分子在形成穩(wěn)定的復(fù)合體時需要載體有較高的正電荷密度，而大尺寸核酸藥物對載體電荷密度的要求較低。由于遞送過程的不同階段對載體的要求有很大差異，智能型、環(huán)境響應(yīng)性載體將具有更大的優(yōu)勢。未來的核酸治療藥物的設(shè)計有很大可能會走向個體化定制的道路，而核酸載體的研發(fā)必然會與之相匹配，標(biāo)準(zhǔn)化、系列化、可床旁調(diào)制的核酸遞送載體將是未來發(fā)展的重點(diǎn)。