唐玄德，王榮，劉玉娟，段偉，梁振昌，范培格,3

（1. 寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川 750021；2. 中國科學(xué)院植物研究所，北京 100093；3. 中國葡萄酒產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，銀川 750021）

近年來我國葡萄酒產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展，取得了可喜的成就[1-3]。據(jù)國際葡萄和葡萄酒組織（OIV）統(tǒng)計(jì)，2018年我國葡萄種植面積為87.5萬 hm2，居世界第二；葡萄酒產(chǎn)量約為9.3億升，居世界第十，約有6.9億升需進(jìn)口[4]，因此，葡萄酒需求有很大的發(fā)展空間。我國釀酒葡萄主要分布在北方地區(qū)，以大陸性季風(fēng)氣候?yàn)橹?，冬季寒冷干旱，葡萄需要埋土防寒才能越冬。冬季埋土、春季出土不僅耗費(fèi)大量勞動力，增加生產(chǎn)成本，同時(shí)也會造成樹體的機(jī)械損傷，加劇種植地生態(tài)環(huán)境惡化[5]，因此選育、推廣抗寒旱的免埋土優(yōu)質(zhì)釀酒品種迫在眉睫。

有性雜交是果樹最常見的育種方法，而果樹雜交親本在遺傳上存在異質(zhì)結(jié)合型，雜交性狀廣泛分離[6]。為了加快育種進(jìn)程，提高育種效率，性狀的遺傳規(guī)律及親本的選擇至關(guān)重要[6]。研究認(rèn)為，抗寒性遺傳取決于親本的冰點(diǎn)值（low-temperature exotherm，LTE）。一般LTE值越低，后代的抗寒性越強(qiáng)[5]，且許多子代的LTE值高于親中值，表明抗寒性存在超親遺傳現(xiàn)象。子代抗寒性與春季凍害等級不一致，但存在相關(guān)性。而在正反交群體中抗寒性狀遺傳特點(diǎn)的報(bào)道有限，目前僅有‘北醇’與‘康可’正反交及后代遺傳規(guī)律的報(bào)道，指出二者正反交后，抗寒性不存在顯著差異，也不存在細(xì)胞質(zhì)遺傳特點(diǎn)[7]。

本試驗(yàn)利用抗寒性具有明顯差異的歐洲種‘赤霞珠’與山歐雜種‘北紅’（Vitis vinifera×V. amurensis）構(gòu)建的正反交群體后代為研究對象，對群體后代的凍害等級、萌芽率和LTE值等進(jìn)行分析，旨在揭示群體后代的抗寒旱性狀的遺傳特點(diǎn)及正反交群體的差異，為今后葡萄抗寒旱雜交育種工作中合理選配親本提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試材為中國科學(xué)院植物研究所葡萄種質(zhì)資源圃（北京）中2個(gè)群體共225個(gè)單株，‘赤霞珠×北紅’雜交群體‘15-25’為正交，‘北紅×赤霞珠’雜交群體‘14-2’為反交。正交為67個(gè)單株，反交為158個(gè)單株，‘赤霞珠’（埋土）與‘北紅’（未埋土）為對照，2021年1月10日前后取雜交株系和對照品種樹體上生長健壯枝條5條（每條5～8節(jié)），用保鮮膜包裹，放置于4 ℃的恒溫冷庫臨時(shí)存放，用于含水量、冰點(diǎn)值及萌芽率調(diào)查。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平；數(shù)顯糖度計(jì)（Digital Refractometer）；風(fēng)干烘箱；差熱分析（different thremal analysis, DTA）系統(tǒng)包括電壓控制冰箱和數(shù)據(jù)采集2個(gè)系統(tǒng)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 枝條總含水量的測定

參照鄒琦的烘干法[8]。取一年生5～8節(jié)生長健壯枝條，剪成10 cm的枝段，每3段一個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3個(gè)枝段，共9根，精確稱重，記為W1；將其置于烘箱中，在105 ℃烘15 min殺青處理，然后置于80 ℃烘箱，烘至恒重，稱重記為W2。

枝條總含水量（%）＝[(W1－W2）/W1]×100

1.3.2 枝條自由水測定

參照潘熾瑞的方法[9]。取出10 mL型號的離心管，并放置于天平準(zhǔn)確稱重，記為W1；配制濃度65%蔗糖，分別加入離心管中，每管加5 mL，記為W2；將枝條避開芽眼用刀切成0.1 cm厚的薄片，準(zhǔn)確稱取0.5 g，3個(gè)重復(fù)，置于含有蔗糖溶液的試管中，再稱重記為W3。扣緊離心管蓋，置于暗處放置16～24 h，期間每隔3 h，均勻晃動，用Digital Refractometer折射儀測定各試管蔗糖溶液濃度。

枝條自由水含量（%）＝[(W2－W1)×(C1－C2)/C2]/(W3－W2)×100

式中：W2－W1為糖液原質(zhì)量（g）；W3-W2為枝條鮮質(zhì)量（0.5 g）；C1為糖原液濃度（65%）；C2為浸泡后糖液濃度（%）

枝條束縛水含量（%）＝枝條總含水量－枝條自由水含量

束自比＝束縛水含量/自由水含量

1.3.3 葡萄冬芽冰點(diǎn)值的測定

采用柴風(fēng)梅等的方法[10]。取5～8節(jié)飽滿芽，垂直芽體中軸線切下，帶有0.5～1.0 mm厚的木質(zhì)部組織，切面整齊。培養(yǎng)皿中加入1 mL蒸餾水，保證芽體濕潤，電熱板孔中放入吸水紙，加入150 μL蒸餾水，放入切好的芽體，每個(gè)孔中加入6～9個(gè)芽。蓋上黑色海綿，保證芽體與電熱模板緊密接觸。固定好的電熱板置于程序控制冰箱降溫，降至-4 ℃保持1 h；-4～-40 ℃，降溫速度為4 ℃·h-1，共需10 h，每隔15 s采集1次溫度數(shù)據(jù)。植物組織低溫時(shí)會集聚放出熱量，因此導(dǎo)致溫度升高，電壓圖會出現(xiàn)高峰，高峰出現(xiàn)時(shí)的溫度為休眠芽的致死溫度，即為冰點(diǎn)值（LTE）。

1.3.4 枝條萌芽率

萌芽率采用喬改霞的方法[11]。結(jié)合LTE試驗(yàn)，將取剩枝段，下截口斜剪，上截口平齊，用嫁接白色條帶綁扎，逐一編號，4個(gè)重復(fù)，放置在黑色穴盤中扦插，穴盤內(nèi)加滿自來水，一周換兩次水，下截口出現(xiàn)白色粘液后，清洗穴盤，重新加入自來水，直至枝條萌芽，萌芽期間加入自來水，保證盤中的穴孔滿水。45 d后統(tǒng)計(jì)萌芽率。

萌芽率（%）＝萌芽數(shù)/芽眼總數(shù)×100

1.3.5 田間凍害等級調(diào)查

春季田間植株萌芽后調(diào)查凍害等級，凍害級別及描述如下：

1級：無凍害。耐寒性極強(qiáng)，植株全部芽眼正常萌發(fā)，樹體生長發(fā)育正常。傷流期間新剪口有傷流現(xiàn)象，芽眼和結(jié)果母枝未受凍，芽眼萌發(fā)整齊一致。

2級：輕微凍害。60%以上的芽眼正常萌發(fā)，傷流期間新剪口有傷流液，但傷流滴水較慢。受凍的一年生枝橫截面有少量變褐，木質(zhì)部輕微受凍，芽眼萌發(fā)推遲，且不一致。

3級：較嚴(yán)重凍害。傷流期間新剪口有傷流，但傷流滴水明顯較少，整個(gè)植株部分芽眼和結(jié)果母枝受凍致死，受凍枝條形成層部分變褐，僅有部分芽眼萌發(fā)，且比正常萌發(fā)推遲，生長衰弱。

4級：嚴(yán)重凍害。傷流期間新剪口只有少量傷流，結(jié)果母枝和枝芽全部凍死，枝蔓形成層變黑。地上部芽眼無一萌發(fā)，只從根基部萌蘗。

5級：植株受凍害致死。傷流期中新剪口無傷流，主干基部隱芽無一萌發(fā)，整株枝蔓干枯死亡。

1.4 數(shù)據(jù)處理分析

用Microsoft excel 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，用Excel、Origin 2018 64Bit軟件作圖。參照張文娥[12]的方法，采用隸屬函數(shù)計(jì)算隸屬值，取平均隸屬值進(jìn)行抗寒性分級。共5級：0.70～1.00為高抗；0.60～0.69為抗；0.40～0.59為中抗；0.30～0.39為抵抗；0～0.29為不抗。

隸屬函數(shù)公式：U（Xi）＝(Xi－Xmin)/(Xmax－Xmin)。如果某一項(xiàng)指標(biāo)與判定結(jié)果為負(fù)相關(guān)，則為反隸屬函數(shù)進(jìn)行定量轉(zhuǎn)換。

計(jì)算公式為：U（Xi）＝1－(Xi－Xmin)/(Xmax－Xmin)，式中，U（Xi）為隸屬函數(shù)值，Xi為無性系某項(xiàng)指標(biāo)測定值，Xmin和Xmax為所有參數(shù)無性系中某一指標(biāo)的最大值和最小值[12]。

變異系數(shù)（%）＝標(biāo)準(zhǔn)差/F×100；

超低親率（%）＝平均隸屬度低于較低親本的株數(shù)/正反交群體總株數(shù)×100；

超高親率（%）＝平均隸屬度高于較高親本的株數(shù)/正反交群體總株數(shù)×100；

遺傳傳遞力（%）＝F/MP×100；

式中F為雜交后代平均值；MP為親中值；H2為廣義遺傳力；VG為遺傳方差；MS為雜交后代組間方差，Mse為雜交后代組內(nèi)方差。

2 結(jié)果與分析

2.1 正反交群體后代枝條含水量及萌芽率

由圖1可以看出，親本及正反交群體后代枝條總含水量保持穩(wěn)定，大致呈一條水平線，分布在39%～51%。而正反交群體后代束縛水、自由水含量在群體中有差異，隨著單株自由水含量的上升，其束縛水含量呈下降趨勢。正反交后代束縛水含量均值差異明顯，分別為20.5%、19.3%，且束縛水含量介于親本之間，偏向抗寒性強(qiáng)的親本‘北紅’。

圖1 親本及后代水含量分布情況Figure 1 Water content distribution of parent and offspring

親本‘赤霞珠’和‘北紅’的總含水量、自由水含量沒有顯著差異，總含水量分別為44%、42%，自由水含量分別為25%、23%。但‘赤霞珠’的束縛水含量為14.6%，‘北紅’的束縛水含量為20.5%，差異明顯?！嘞贾椤汀奔t’束自比也存在顯著差異。

正交群體‘15-25’后代的束縛水含量高于‘北紅’的單株有27株，占比約40%。反交群體‘14-2’后代的束縛水含量高于‘北紅’的單株有34株，占比約22%。正交群體‘15-25’后代的束自比高于‘北紅’的單株有21株，占比約31%。反交群體‘14-2’后代的束自比高于‘北紅’的單株有34株，占比約22%。

后代株系的萌芽率不管是正交群體還是反交群體的均為100%。

2.2 正反交后代抗寒性遺傳分析

親本‘赤霞珠’LTE值為-16.20 ℃，屬于低抗；‘北紅’LTE值為-21.70 ℃，屬高抗，兩者的LTE值存在顯著差異，分屬不同的抗寒性等級。由表1可以看出，兩個(gè)品種構(gòu)建的正反交群體后代LTE值均呈不同程度的連續(xù)分布，分別為-24.40～-10.89、-24.68～-12.64 ℃。兩個(gè)群體LTE值分布范圍均大于強(qiáng)親本，具有超親遺傳特點(diǎn)。正反交群體后代LTE均值分別為-21.01、-21.52 ℃，存在顯著差異，整體趨向抗寒性較強(qiáng)的親本‘北紅’。變異系數(shù)分別為12.95%和9.52%，正交群體‘15-25’的變異系數(shù)大于反交群體‘14-2’，在同一環(huán)境條件下，正交群體的變異性高于反交群體。廣義遺傳力與遺傳傳遞力沒有顯著差異，廣義遺傳力為0時(shí)，表明表型變異由環(huán)境影響造成；廣義遺傳力為1時(shí)，表型變異由基因控制，而正交群體后代在相同的環(huán)境條件下廣義遺傳力更多受基因影響。

表1 正反交群體LTE值統(tǒng)計(jì)Table 1 Statistics of orthogonal group LTE value

由表2可以看出，最大比例的群體后代均是介于親本之間的類型，正交和反交群體LTE值高于強(qiáng)親本值的比例分別為43.47%和41.25%，弱于弱親本值的比例分別為8.69%和3.12%，抗寒性弱的親本做母本后代中會出現(xiàn)更高比例抗性更弱的株系。

表2 正反交后代抗寒性偏向統(tǒng)計(jì)Table 2 Statistics of the anti-cold bias in offspring with positive and negative cross%

由圖2可以看出，正交群體呈偏右峰單向正態(tài)分布，反交群體呈經(jīng)典型正態(tài)分布。正反交群體后代LTE均呈離散分布。正交群體LTE集中分布區(qū)間為-23.8～-17.7 ℃，反交群體LTE集中分布在-23～-20 ℃，正交群體相對反交群體LTE更分散。

圖2 正反交群體后代LTE值頻率直方圖Figure 2 Frequency histogram of orthogonal group offspring

2.3 群體田間凍害等級分析

由表3正反交群體后代凍害等級顯著性分布看，兩個(gè)群體后代最高比例等級均為1級，即無凍害植株，分別占比為50.70%和68.44%，反交群體高出近18個(gè)百分點(diǎn)。兩個(gè)群體間后代3級和5級所占比例差異不大，而4級所占比例差異較大，正交群體比例高13.64個(gè)百分點(diǎn)。1、2級植株表現(xiàn)輕微凍害，60%以上的芽眼正常萌發(fā)，生產(chǎn)中對產(chǎn)量影響不大；反交群體1級（無凍害）和2級株系的比例高于正交20個(gè)百分點(diǎn)，說明反交群體‘14-2’后代具有更大比例的實(shí)際抗寒性能明顯優(yōu)于正交群體的株系。

表3 正反交群體凍害等級的分布Table 3 Distribution of sprouting grade in positive and negative groups%

2.4 含水量、LTE值、凍害等級相關(guān)性

根據(jù)群體后代株系含量差異的束自比與LTE值的相關(guān)性分析可看出（圖3），兩個(gè)群體的LTE值與束自比均具有相關(guān)性，一般束自比值高，LTE值低，抗寒性強(qiáng)。正交群體‘15-25’單株LTE值與束自比相關(guān)性為0.62，反交群體的相關(guān)性為0.74，但均未達(dá)到顯著相關(guān)。

圖3 束自比、LTE值相關(guān)性曲線Figure 3 Bound-free ratio and LTE value correlation curve

由圖4可以看出，正交群體‘15-25’凍害等級對應(yīng)的LTE中位數(shù)依次為-21.43、-21.82、-17.62、-21.62、-21.59 ℃，反交群體‘14-2’凍害等級對應(yīng)的LTE值中位數(shù)依次為-21.35、-21.95、-21.85、-21.29、-20.58 ℃。由這兩組數(shù)據(jù)可以看出，凍害等級與LTE值沒有直接相關(guān)性，凍害等級與冬季枝條含水量也無直接相關(guān)性。

圖4 不同凍害等級植株的冬芽LTE值分布Figure 4 Distribution of LTE of plants with different freezing grades

3 討論與結(jié)論

利用高抗性的野生資源與優(yōu)質(zhì)的栽培品種雜交是選育具有優(yōu)質(zhì)高抗品種的重要方法[1,14,21-23]。本試驗(yàn)親本‘北紅’是山葡萄F1代，可抵御-21.83 ℃低溫[13]，在北方露地栽培可安全越冬。‘赤霞珠’是優(yōu)良的歐亞種品種，但不抗寒，利用兩個(gè)品種雜交期望選育出既有‘北紅’的高抗寒性能，又具有‘赤霞珠’優(yōu)良品質(zhì)性狀的新優(yōu)品種。從群體后代的LTE值看，具有超親遺傳特點(diǎn)，而且兩個(gè)群體株系在春季萌芽后田間表現(xiàn)出較高比例的無凍害植株比例，利用抗寒的山葡萄血統(tǒng)后代（F1）做親本完全可以選育出抗寒性能強(qiáng)的株系，這與Wang等的結(jié)果一致[7]。

另外，有性雜交育種中父母本的配置至關(guān)重要。本試驗(yàn)利用抗寒性具有明顯差異的‘赤霞珠’與‘北紅’構(gòu)建正反交群體，兩個(gè)群體后代LTE均值不存在顯著差異，但群體后代LTE值整體趨向抗寒性較強(qiáng)的親本‘北紅’，這與郭海林等[24]在結(jié)縷草屬植物抗寒性試驗(yàn)中得出的遺傳現(xiàn)象一致，也與王榮、柴風(fēng)梅等[5,7,13]的研究結(jié)果一致。但試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，后代LTE值弱于弱親本值的占比正交群體大于反交群體，因此抗寒性弱的親本做母本（正交群體15-25）后代中會出現(xiàn)更高比例抗性更弱的株系。從群體后代凍害等級分布結(jié)果也得出，正交群體株系4級（地上部無一萌芽）所占比例相較反交群體高13.64個(gè)百分點(diǎn)，反交群體后代中1級（無凍害）和2級株系的比例高于正交群體20個(gè)百分點(diǎn)，說明選用抗寒性能強(qiáng)的親本做母本，獲得抗寒旱后代的株系概率更大。

試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過低溫馴化后的1月份取樣測得的枝條束自比與冬芽LTE值具有一定相關(guān)性，但未達(dá)到顯著相關(guān)，而冬芽LTE值與春季田間凍害等級沒有直接相關(guān)性。Wang等[7]利用7個(gè)雜交群體進(jìn)行的試驗(yàn)也得出同樣的結(jié)果。北京冬末春初，氣溫升高，但氣候干旱，且常伴有大風(fēng)天氣，推測可能是氣溫回升后枝條中水分的變化影響最終的萌芽，具體不同類型基因型在越冬期間水分變化的差異及調(diào)控機(jī)制有待深入研究。

4 展望

有性雜交育種是抗寒旱優(yōu)質(zhì)育種的重要途徑之一，明確不同正反交育種抗寒旱遺傳特點(diǎn)，一方面可以解決我國北方葡萄埋土防寒根本問題，減少生產(chǎn)成本，提高市場競爭力。選用抗寒旱性能強(qiáng)的品種與品質(zhì)優(yōu)良的品種雜交選育適宜我國立地條件的新優(yōu)品種，不僅從生產(chǎn)源頭上解決北方葡萄冬季防寒埋土所帶來的成本增高、生態(tài)惡化等問題，也可以豐富釀酒葡萄種質(zhì)資源，實(shí)現(xiàn)品種與產(chǎn)品品質(zhì)的多樣化。另一方面，深入進(jìn)行雜交群體后代及不同抗性種質(zhì)資源抗寒旱調(diào)控機(jī)制研究，挖掘抗寒性狀相關(guān)基因并加以驗(yàn)證，可為新品種的分子輔助篩選及定向育種提供新的技術(shù)手段和理論依據(jù)。