曾曉宇，劉 琛，婁曉夢，呂雅婷

（湖南交通工程學(xué)院，湖南衡陽 421000）

在我國，除草效率最高、使用最廣泛的除草劑是草甘膦，草甘膦的使用保證了農(nóng)產(chǎn)品的高產(chǎn)豐收［1］。過量的草甘膦會對環(huán)境和人類健康產(chǎn)生一定的威脅［2-5］。環(huán)境中的草甘膦主要通過3 種方式降解，生物降解、光化學(xué)降解和水解［6］，其中生物降解是草甘膦降解的主要方式［7］。

水稻是我國主要的糧食作物，稗草是稻田中數(shù)量最多的雜草，嚴(yán)重影響了水稻的正常生長。農(nóng)民為了提高水稻的產(chǎn)量，使用了大量的除草劑，隨之而來的問題是雜草的抗藥性增強(qiáng)。植物內(nèi)生菌具有促進(jìn)宿主植物生長發(fā)育、提高作物抗非生物脅迫能力及防治病蟲害等作用。對稗草內(nèi)生菌進(jìn)行分離和提純，測定稗草內(nèi)生菌對草甘膦的降解率，了解內(nèi)生菌對稗草抗草甘膦的影響，以期為解決稗草防治這個(gè)難題提供些許參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

稗草種子：2020 年5 月于湖南省岳陽市郊區(qū)采集，稗草種子采集時(shí)應(yīng)采集成熟且比較飽滿的種子，晾干后儲存，用信封裝好，備用。

供試試劑：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、無機(jī)鹽培養(yǎng)基、75%酒精、2.5%草甘膦可分散油懸浮劑、色譜乙腈、94%草甘膦原藥、次氯酸鈉。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 稗草的種植

將采集備用的稗草種子用清水浸泡24 h，取出后置于30 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，待其發(fā)芽、盆栽。將稗草幼苗置于恒溫箱中培養(yǎng)，定時(shí)澆水，當(dāng)稗草生長到2 葉期時(shí)，挑選長勢一致的稗草。

1.2.2 內(nèi)生菌的分離、純化

取稗草的莖、葉擦干，將其放置于干燥的濾紙上風(fēng)干。用75%消毒酒精浸泡3 min，用無菌水沖洗3 次。然后用2.5%次氯酸鈉（NaClO）溶液漂洗2 min，用無菌水沖洗5 次。再用75%消毒酒精浸泡30 s，用無菌水沖洗3 次。將稗草的莖、葉進(jìn)行充分的研磨，取適量的稗草汁液稀釋成不同的濃度，取適量的稀釋液分別置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基和無機(jī)鹽培養(yǎng)基上，并置于適合的溫度下進(jìn)行培養(yǎng)。用移液槍吸取200 μL 無菌水清洗液，分別置于上述不同培養(yǎng)基上作對照處理；5 d 之后觀察菌落長勢，待長出菌落后轉(zhuǎn)至新的培養(yǎng)基上進(jìn)一步培養(yǎng)，分離得到純化的菌株，然后置于斜面培養(yǎng)基，在4 ℃環(huán)境下保存并做好標(biāo)簽。

1.2.3 內(nèi)生菌的鑒定

從保存好的稗草內(nèi)生菌中取出少量菌絲，接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，在26 ℃恒溫環(huán)境中培養(yǎng)5 d，挑取少量菌絲置于含有一滴乳酸苯酚棉蘭染色液的載玻片上，進(jìn)行棉蘭乳酚油制片，最后在AMG EVOS 顯微鏡下觀察、拍照。同時(shí)，用Omega 真菌DNA 提取試劑盒提取稗草內(nèi)生菌的總DNA。將模板設(shè)置為內(nèi)生菌的基因組DNA，利用內(nèi)生真菌rDNAITS 基因的通用引物ITS 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，同時(shí)對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序。

1.2.4 內(nèi)生菌對草甘膦的降解

將無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基制作成濃度分別為200 mg·L-1、400 mg·L-1、600 mg·L-1、800 mg·L-1、1 000 mg·L-1、1 200 mg·L-1、1 400 mg·L-1、1 600 mg·L-1、1 800 mg·L-1的草甘膦懸液，加入適量的稗草內(nèi)生菌，30 ℃恒溫?fù)u床中振動48 h，離心后取上清液，將紫外分光光度計(jì)的波長調(diào)節(jié)至243 nm，測其吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 稗草內(nèi)生菌形態(tài)鑒定及序列分析

稗草內(nèi)生菌在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)6 d后的形態(tài)特征如圖1 所示，菌絲為灰綠色，菌絲末端多處聯(lián)合。稗草內(nèi)生菌ITS 擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂凝膠電泳圖如圖2 所示，由圖2 可知，擴(kuò)增產(chǎn)物是單一條帶，大小約600 bp。把擴(kuò)增得到的條帶在Gene Bank 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST 比對，稗草內(nèi)生菌的ITS 序列與青霉屬中的Talaromyces funiculosus（KC254067.1）同源性為99%。

圖1 內(nèi)生菌在培養(yǎng)基的菌絲體特征

圖2 稗草內(nèi)生菌ITS 擴(kuò)增電泳圖

2.2 稗草內(nèi)生菌的生長

稗草內(nèi)生菌的生長曲線如圖3 所示，稗草內(nèi)生菌的生長速度呈現(xiàn)出先緩慢生長，再呈對數(shù)生長，最后逐漸減慢的趨勢。從曲線中可知，在0～2 h 稗草內(nèi)生菌生長緩慢，這是由于內(nèi)生菌在適應(yīng)液體培養(yǎng)基的環(huán)境；在2～14 h 稗草內(nèi)生菌生長迅速，呈現(xiàn)出對數(shù)生長期，這一時(shí)期的稗草內(nèi)生菌快速繁殖；在14 h 之后的時(shí)間里，稗草內(nèi)生菌逐漸進(jìn)入衰亡期，這是因?yàn)殡S著稗草內(nèi)生菌的生長繁殖，培養(yǎng)基內(nèi)的有害物質(zhì)逐漸增多，另外培養(yǎng)液中的營養(yǎng)物質(zhì)逐漸減少，不能持續(xù)為稗草內(nèi)生菌的生長提供營養(yǎng)。

圖3 稗草內(nèi)生菌生長曲線

2.3 稗草內(nèi)生菌耐草甘膦的活性

國內(nèi)外學(xué)者對草甘膦降解菌的分離、篩選較多，大多集中于環(huán)境中存在的菌株，但是有關(guān)內(nèi)生菌對草甘膦的降解作用還鮮有報(bào)道。稗草內(nèi)生菌耐草甘膦的活性如圖4 所示，當(dāng)草甘膦濃度在0～1 200 mg·L-1時(shí)，OD 值和草甘膦濃度呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，說明其活性逐漸增強(qiáng)；當(dāng)草甘膦濃度增大到1 200 mg·L-1時(shí)，OD 值最大，說明此時(shí)稗草內(nèi)生菌的活性最大；當(dāng)草甘膦濃度＞1 200 mg·L-1之后，OD 值逐漸減小，這說明稗草內(nèi)生菌活性逐漸下降。

圖4 稗草內(nèi)生菌耐草甘膦活性

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

稗草外形與水稻極為相似，與水稻爭奪稻田中的養(yǎng)分，且分布廣泛，為害嚴(yán)重，已成為農(nóng)民的“眼中釘”，稻田的“肉中刺”。自然界中存在數(shù)量極其龐大的內(nèi)生菌，可與植物形成寄生、共生和腐生的關(guān)系，并長期存活于植物體內(nèi)。內(nèi)生菌具有促進(jìn)宿主植物生長發(fā)育、提高作物抗非生物脅迫能力及防治病蟲害等作用。因此，研究稗草內(nèi)生菌的生長特征對于植物的生長發(fā)育具有非常重要的意義。

草甘膦是有機(jī)磷農(nóng)藥，隨著草甘膦的長期單一使用，雜草的抗藥性逐漸產(chǎn)生，并嚴(yán)重影響稻田生態(tài)環(huán)境，危害農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。FAN 等第一次分離出能夠?qū)Σ莞熟⑵鸬浇到庾饔玫南灅友挎邨U菌，并且蠟樣芽孢桿菌可以在草甘膦環(huán)境中生長，使其作為唯一的碳源。全鑫等分離出節(jié)桿菌屬Q(mào)B-7，它能夠以草甘膦為唯一碳源，對草甘膦的降解效率可達(dá)99.34%。環(huán)境中草甘膦的濃度對巨大芽孢桿菌降解草甘膦的特性有一定的作用。在一定范圍內(nèi)，隨著草甘膦濃度的增加，降解作用越好，降解效率也越大。當(dāng)草甘膦濃度達(dá)到500 mmol·L-1時(shí)，菌株可以得到很多的營養(yǎng)而迅速生長，導(dǎo)致降解率也不斷的增加，表現(xiàn)出最好的降解性能。有研究表明，當(dāng)草甘膦濃度增加到一定的濃度后，會因?yàn)椴莞熟⒈旧淼亩拘裕瑢到饩鸬揭欢ǖ亩竞ψ饔?，從而明顯抑制菌株的生長，導(dǎo)致降解率的下降。因此，當(dāng)草甘膦的濃度＞1 200 mg·L-1時(shí)，內(nèi)生菌對草甘膦的耐受性逐漸降低。賀望興等分離出能夠降解草甘膦的為球菌屬CGL-1 菌株，對草甘膦的最高耐受濃度為1 200 mg·L-1，此結(jié)果正與本研究的結(jié)果類似。

3.2 結(jié)論

1）稗草內(nèi)生菌屬于青霉屬中的Talaromycesfuniculosus。2）稗草內(nèi)生菌能在以草甘膦為唯一碳源的培養(yǎng)基中正常生長，其對草甘膦的最高耐受濃度為1 200 mg·L-1，能夠?qū)Σ莞熟⑵鸬胶芎玫慕到庾饔谩?/p>