史恬恬 謝 超① 張家瑋 李遠(yuǎn)慧 朱亞猛 吳玉婷 周卓穎 虞 舟

基于低壓變頻電場技術(shù)對帶魚()保鮮過程中微生物群落影響分析*

史恬恬1謝 超1①張家瑋1李遠(yuǎn)慧1朱亞猛1吳玉婷1周卓穎1虞 舟2

(1. 浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院 浙江舟山 316022; 2. 舟山匯豐冷藏物流發(fā)展有限公司 浙江舟山 316002)

帶魚()在低溫條件運輸和貯藏過程中, 易受微生物和內(nèi)源性蛋白酶的影響而產(chǎn)生胺類和醛類物質(zhì)導(dǎo)致腐敗。為了研究低壓變頻電場對微凍帶魚在貯藏過程中的微生物群落特征, 采用Miseq基因組測序技術(shù), 對貯藏至40 d的舟山帶魚的微生物群落進(jìn)行堿基信息測序。將產(chǎn)生的堿基序列通過OTU聚類、多樣性分析、相關(guān)性分析等手段分析了影響帶魚保鮮效果的微生物群落組成和發(fā)育信息。在此基礎(chǔ)上, 研究了不同強(qiáng)度電場(0, 2, 2.5, 3 kV/m)處理對帶魚微生物群落組成的影響。根據(jù)菌屬相對豐度結(jié)果, 推測希瓦氏菌屬()、假單胞菌屬()、紫色桿菌屬()是帶魚微生物腐敗主要致腐菌。結(jié)果表明, 40 d后, 經(jīng)3 kV/m處理的樣品其OTU6嗜冷菌屬和OTU13假單胞菌屬c的相對豐度均小于1%, 而且OTU7、OTU14、OTU8、OTU9等菌屬未被OTU聚類。結(jié)果表明, 經(jīng)3 kV/m電場強(qiáng)度的低壓靜電場處理的抑菌保鮮效果最好, 表現(xiàn)為在貯藏過程中雜菌種類最少, 樣本微生物群落物種豐度和多樣性均最低, 腐敗程度最低。

帶魚(); 低壓變頻電場; 微生物; 高通量測序

帶魚()又名牙帶魚, 其風(fēng)味鮮美、營養(yǎng)物質(zhì)種類豐富, 蛋白質(zhì)高, 易被人體吸收, 深受大眾喜愛(楊勝平, 2010)。帶魚肉質(zhì)銀白細(xì)嫩, 富含人體所必需的多種營養(yǎng)元素, 而且還可以預(yù)防血壓較高、動脈狹窄、癌癥等疾病的發(fā)生(賀瑩, 2019)。通常來說帶魚采用低溫條件進(jìn)行運輸和貯藏, 并且在這期間易受微生物和內(nèi)源性蛋白酶的影響, 易產(chǎn)生一些胺類和醛類物質(zhì), 導(dǎo)致魚肉發(fā)生腐敗, 使帶魚體表顏色發(fā)生變化, 引起品質(zhì)劣變, 而導(dǎo)致魚肉腐敗的一部分原因就是由于微生物的作用(沈妮, 2019)。

在微生物腐敗菌的分離培養(yǎng)鑒定等方法中如實時定量熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等在檢測過程中會受到多重因素的干擾, 容易造成錯誤判定, 而高通量測序技術(shù)能夠更完美、準(zhǔn)確反映樣品中微生物菌群分布, 可以同時完成對測定微生物基因分子的序列測定, 更精準(zhǔn)、全面地鑒定樣品中微生物的單一或全面基因組(Di Bella, 2013)。除此之外, Miseq技術(shù)在測序過程中無需大量PCR擴(kuò)增, 實現(xiàn)準(zhǔn)確、快速、全面的測序及多樣性分析(徐鵬昊, 2016; 張國林等, 2021)。而一些優(yōu)勢腐敗菌如希瓦氏菌屬、嗜冷菌屬等是傳統(tǒng)分離鑒定方法難以對群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行全面分析的。

低壓靜電場保鮮是一種物理保鮮方法, 通過控制水分子偶極振動減少水的相變時間, 冰晶粗糙度均勻并重新排列形成的小冰晶, 使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)得以完整保留, 食物的口感和咀嚼性得到提升, 其次就是降低細(xì)胞呼吸速率(Xie, 2021), 外部電場還可以改變水分子與活性酶的結(jié)合態(tài), 導(dǎo)致酶的活性降低甚至沒有活性, 在電場反應(yīng)下, 空氣被電離產(chǎn)生臭氧和負(fù)離子, 臭氧能直接氧化并破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)膜, 然后進(jìn)入細(xì)胞并作用于其DNA (丹陽等, 2004; Xanthakis, 2013)。

因此, 本研究基于高通量測序技術(shù), 研究低壓靜電場對貯藏至40 d帶魚保鮮過程中微生物組成差異情況, 旨在為保鮮中菌群組成及低壓靜電保鮮技術(shù)提供基礎(chǔ)信息(毛俊龍等, 2020)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

新鮮舟山帶魚()采購自舟山沈家門漁港, 體長約0.8～1.0 m, 厚約2～3 cm, 帶魚通體銀白錚亮, 魚眼小且透明, 魚皮濕滑, 無破損品質(zhì)完好, 經(jīng)過處理后進(jìn)行包裝袋包裝, 設(shè)定溫度為-4 °C, 分別進(jìn)行電場保存。

1.2 試驗試劑

本試驗所用試劑包括AS132 DNA提取試劑盒、Qubit3.0 DNA試劑盒、Hieff NGS? DNA分選磁株等, 具體見表1所示。

1.3 儀器與設(shè)備

本試驗所用儀器與設(shè)備包括恒溫振蕩器、電場板、PCR檢測儀等, 具體見表2所示。

1.4 方法

1.4.1 樣品處理 取同一批次的新鮮帶魚為試驗原料, 運送至實驗室后進(jìn)行清洗、分裝。

對照組(CK): 將帶魚放入無電場的環(huán)境下, 微凍–4 °C進(jìn)行保鮮試驗, 標(biāo)記樣品為DY1。

表1 實驗試劑

表2 儀器與設(shè)備

實驗組(LVEF): 將帶魚樣品放入低壓靜電場, 微凍–4 °C下進(jìn)行持續(xù)三種電場強(qiáng)度(2, 2.5, 3 kV/m)處理, 標(biāo)記樣品為(DY2, DY3, DY4), 電場頻率為50 Hz。

1.4.2 帶魚微生物的提取 將貯藏至40 d的四組帶魚樣品進(jìn)行研磨攪碎后取10 g帶魚樣品, 加入9倍體積的生理鹽水, 之后進(jìn)行離心分離(12 500 r/min, 10 min), 取菌體沉淀物進(jìn)行微生物菌群研究, 每組樣品進(jìn)行三次平行實驗(Hu, 2015; Li, 2020)。

1.4.3 總DNA的提取 參考廖娟等(2020)的方法。使用無菌槍頭刮取表面菌落, 轉(zhuǎn)移適量樣品至2 mL樣品管中進(jìn)行提取。Qubit定量檢測DNA樣本濃度。DY1、DY2、DY3、DY4點樣濃度分別為48.6、51.2、53.6、66.2 ng/μL, 上樣量400 ng, DNA提取電泳如圖1所示。

1.4.4 PCR擴(kuò)增 將PCR管置于PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)大范圍遞增, 第一輪PCR作用條件: 94 °C預(yù)變性3 min; (94 °C變性30 s → 45 °C退火20 s → 65 °C延伸30 s) 5個循環(huán); (94 °C預(yù)變性20 s → 55 °C退火20 s →72 °C延伸30 s) 20個循環(huán); 72 °C再延伸5 min, 10 °C保存。第二輪引入橋式PCR兼容引物, 27F、1492R為通用引物, 將PCR管置于PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)大, PCR反應(yīng)條件: 95 °C預(yù)變性3 min; (94 °C變性20 s→ 55 °C退火20 s → 72 °C延伸30 s) 5個循環(huán); 72 °C再延伸5 min, 10 °C保存。PCR擴(kuò)增電泳如圖2所示(張皖君, 2018)。

圖1 DNA提取電泳圖

注: 數(shù)據(jù)單位為bp; 從左至右分別為DY1、DY2、DY3、DY4

圖2 PCR擴(kuò)增電泳圖

注: 從左至右分別為DY1、DY2、DY3、DY4

1.4.5 MiSeq測序 為了得到均勻的長簇效果和高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù), 使用Qubit 4.0熒光定量系統(tǒng)進(jìn)行文庫濃度的定量測定。文庫經(jīng)完整性查驗后送往上海生工生物公司進(jìn)行Illumina MiSeq測序(郭倩倩等, 2019)。

1.4.6 菌群生物信息學(xué)分析 采用cutadapt、PEAR、PRINSEQ、RDP classifier、GraPhlAn等軟件分析微生物群落生物信息。

2 結(jié)果與討論

2.1 OTU聚類

MiSeq測序過程中會產(chǎn)生數(shù)以萬計的16S序列, 逐一進(jìn)行物種標(biāo)注耗時太長, 且第二代測序在經(jīng)PCR擴(kuò)增后會發(fā)生堿基錯配的概率會大大提升, 故引入OTU聚類, 且后續(xù)微生物信息學(xué)分析都是OTU聚類結(jié)果展開的。OTU (Operational Taxonomic Units)是在遺傳生物學(xué)和統(tǒng)計系統(tǒng)學(xué)研究中, 為方便分析而人為對微生物菌群分類添加的標(biāo)志。通常所有樣本去除冗余序列合并, 去除沒有重復(fù)的單序列, 相似度95%以下認(rèn)為不同屬, 相似度97%以下可以認(rèn)為測序微生物不同種, 一般采用Usearch作OTU聚類(Edgar, 2013)。

由表3可知, 帶魚樣本的有效序列信息, DY1、DY2、DY3、DY4的堿基信息分別是CGTATC、AGCAGT、GAGGAA、CGAGTC, 有效序列條數(shù)分別為88 714、84 447、83 544、74 711, 堿基數(shù)分別為38 137 408、36 304 277、35 919 079、32 124 163, 序列平均長度大致相同。差異說明電場強(qiáng)度與檢出有效序列條數(shù)、堿基數(shù)呈負(fù)相關(guān)。

表4列出了各電場所有優(yōu)化序列參數(shù)對應(yīng)的OTU代表的序列閾值數(shù), 選出與對應(yīng)代表序列相似性在97%以上的序列OTU名稱, 可以看出各個組間樣品OTU類別和序列數(shù)不盡相同, 需要結(jié)合表5的OTU物種注釋分析。OTU物種注釋表明, 帶魚貯藏過程中體內(nèi)微生物群落全部由細(xì)菌群組成, 并沒有產(chǎn)生真菌群落。在門水平上, 變形菌門(Proteobacteria)為優(yōu)勢菌門, 僅有OTU3聚類為厚壁菌門(Firmicutes)。在綱水平上, 丙型變形菌綱(Gammaproteobacteria)為優(yōu)勢菌綱, 丙型變形菌綱分布廣泛, 各組樣品均有OTU聚類。在目水平上, 假單胞菌目(Pseudomonadales)聚類水平較高。在科水平表現(xiàn)出了較高的豐度, 聚類結(jié)果為希瓦氏菌科(Shewanellaceae)、假單胞菌科(Pseudomonadaceae)、微球菌科(Micrococcaceae)、莫拉氏菌科(Moraxellaceae)、李斯特菌科(Listeriaceae)、柄桿菌科(Caulobacteraceae)、草酸桿菌科(Oxalobacteraceae)、鞘脂桿菌科(Sphingobacteriaceae)。屬水平是Miseq測序OTU分類信息學(xué)Usearch分析的最小單位(Caporaso, 2012), 能較客觀地描述該菌的生理特征和作用, 可以用于腐敗原因分析, 本次Miseq測序的OTU聚類屬主要有希瓦氏菌屬()、節(jié)桿菌屬()、柄桿菌屬()、工地桿菌屬()、假單胞菌屬()、索絲菌屬()、嗜冷菌屬()、紫色桿菌屬()、不動桿菌屬() (曹榮等, 2016)。

表3 樣本有效序列統(tǒng)計

表4 OTU序列數(shù)統(tǒng)計表

表5 OTU分類學(xué)信息表

2.2 多樣性分析

Miseq測序后的OTU聚類能夠表征微生物群落的具體信息, 但僅靠OTU聚類的分析仍不夠全面, 還需要結(jié)合Mothur和R軟件對OTU菌屬做多樣性分析(Lu, 2014)。

表6列出了DY1、DY2、DY3、DY4的Alpha多樣性指數(shù)。在97%的OTU聚類水平上, 微生物豐度指數(shù)Chao和Ace越大, 樣本豐度指數(shù)越高(楊春敏等, 2019); 微生物菌群的多樣性指數(shù)Shannon越大, 樣本多樣性越高, Simple指數(shù)趨勢則與Shannon相反(Gong, 2019)。可以看出四組樣品Chao和Ace豐度指數(shù)大小排序為DY1>DY2>DY3>DY4, Shannon多樣性指數(shù)大小排序與Chao和Ace相同, Simple則相反。樣本文庫覆蓋率均為1, 各樣本測序可信度高。

表6 Alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計表

圖3列出了OTU聚類微生物的屬級相對豐度, 不同顏色區(qū)塊代表各菌屬所占樣本的百分比。DY1、DY2、DY3、DY4中相對豐度最高的是假單胞菌屬a, 分別占了OTU總量的61%、76%、87%、97%。對照組DY1顏色區(qū)塊最多, 有多個獨有OTU聚類菌屬, 其中希瓦氏菌屬(31%)、假單胞菌屬的惡臭假單胞菌(4%)、紫色桿菌屬(1%)是水產(chǎn)品主要致腐菌(曹榮等, 2019)。電場處理組DY2、DY3、DY4也有多個獨有菌屬, 經(jīng)分析均無強(qiáng)致腐性和致病性, 說明電場能夠有效抑制帶魚貯藏過程中腐敗菌的生長, 這與段偉文(2019)的結(jié)論相同。DY4微生物群落豐度最小, 表現(xiàn)為嗜冷菌屬(0.1%)、假單胞菌屬c (0%)的相對豐度較少。DY4在40 d時OTU6嗜冷菌屬和OTU13假單胞菌屬c的相對豐度均小于1%, 還有OTU7、OTU14、OTU8、OTU9等菌屬未被OTU聚類。說明3 kV/m電場強(qiáng)度的低壓靜電場抑菌保鮮效果最好, DY2、DY3次之, DY1效果最差。印證了前文中貯藏理化特性、蛋白質(zhì)特性和水分遷移情況的數(shù)據(jù)。

圖3 菌屬相對豐度柱狀圖

Alpha稀釋性曲線圖變化情況如圖4所示, 橫軸代表多樣性分析抽取的數(shù)據(jù)量, 縱軸代表Alpha指數(shù), 根據(jù)曲線是否能達(dá)到平緩來判斷Miseq測序數(shù)據(jù)量的充分性。從曲線趨平程度來看, Alpha稀釋性曲線中DY1>DY2>DY3>DY4, DY4最先趨平, DY3、DY2次之, DY1直至最后仍未趨平。說明DY1貯藏過程中雜菌種類多, 樣本微生物群落物種豐度和多樣性均高于電場組, 腐敗程度也最大。電場處理組DY2、DY3、DY4也有多個獨有菌屬, 但均無致腐性和致病性。

圖4 Alpha指數(shù)稀釋性曲線圖

樣本共線性關(guān)系如圖5所示。以門水平為標(biāo)準(zhǔn), 右弧表征微生物群落物種組成情況, 左弧表征微生物群落的分布比例情況, 一個顏色代表一個物種, 長度代表豐度比例, 第三圈的彩色區(qū)帶一角連接樣本, 另一角連接物種, 區(qū)帶寬度代表具體物種豐度。樣本門中96.82%為變形菌門(Proteobacteria), 僅有2.81%厚壁菌門(Firmicutes), 其他菌門占比均小于1%。

圖5 共線性關(guān)系圖

2.3 相關(guān)性分析

組間相關(guān)性是檢驗實驗可靠性和樣本合理性的重要標(biāo)準(zhǔn),2越接近1, 表示關(guān)聯(lián)性越好。由圖6可知, DY4與DY3、DY2、DY1相關(guān)系數(shù)分別為0.72、0.67、0.49, 相關(guān)程度逐漸縮小。DY3與DY2、DY1相關(guān)系數(shù)分別為0.45、–0.07, 相關(guān)性不強(qiáng)。DY2與DY1相關(guān)性僅為0.32。DY4、DY3、DY2與對照組DY1主成分差異顯著(<0.05), DY4與DY3樣本最相似(>0.05)。表明了在四組電場中DY4與DY3的關(guān)聯(lián)密切程度最好, 而與DY1呈極度不相關(guān)。

圖7為PCA主成分分析結(jié)果, PCA可以通過數(shù)據(jù)降維運用ANOVA方差分析不同樣本組間差異和距離, 其軸和軸并無實際意義, 百分比表示差異解釋度值, 點越接近, 其菌群組成就越相似。數(shù)據(jù)表明除樣本本身外, 電場處理的DY4、DY3、DY2與未經(jīng)電場處理DY1樣本間點的距離遠(yuǎn), 表明主成分差異顯著(<0.05), DY4與DY3樣本最相似(>0.05), 表明了經(jīng)電場設(shè)備處理后對帶魚微生物菌群組成結(jié)構(gòu)有相當(dāng)顯著的影響。

3 結(jié)論

采用Miseq基因組測序技術(shù), 對貯藏至40 d的帶魚微生物群落堿基信息測序, 產(chǎn)生的堿基序列通過OTU聚類、多樣性分析、相關(guān)性分析等手段分析影響帶魚保鮮效果的微生物群落組成和發(fā)育信息, 研究電場強(qiáng)度(0, 2, 2.5, 3 kV/m)對帶魚微生物群落組成的影響。OTU聚類屬主要有希瓦氏菌屬()、工地桿菌屬()、節(jié)桿菌屬()等菌屬, Chao和Ace豐度指數(shù)大小排序為DY1>DY2> DY3>DY4。對照組DY1的OTU多樣性高, 有多個獨有OTU聚類菌屬, 電場處理組DY2、DY3、DY4也有多個獨有菌屬, 但均無致腐性和致病性。說明3 kV/m電場強(qiáng)度的低壓靜電場抑菌保鮮效果最好, DY2、DY3次之, DY1效果最差; Alpha稀釋性曲線中DY4最先趨平, DY3、DY2次之, DY1直至最后仍未趨平。DY4與DY3、DY2、DY1相關(guān)系數(shù)分別為0.72、0.67、0.49, 相關(guān)程度逐漸縮小。綜上說明, 電場能夠有效抑制帶魚貯藏過程中腐敗菌的繁衍生長, 3 kV/m電場強(qiáng)度的抑菌保鮮效果最好, 2、2.5 kV/m次之, 未施加電場效果最不理想。研究結(jié)果為低壓靜電保鮮技術(shù)提供了基礎(chǔ)信息。

圖6 相關(guān)性熱圖

圖7 PCA主成分分析

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EFFECT OF LOW-VOLTAGE ALTERNATING FREQUENCY ELECTRIC FIELD ON MICROBIAL COMMUNITY OF HAIRTAILDURING PRESERVATION

SHI Tian-Tian1, XIE Chao1, ZHANG Jia-Wei1, LI Yuan-Hui1, ZHU Ya-Meng1, WU Yu-Ting1, ZHOU Zhuo-Ying1, YU Zhou2

(1. Zhejiang Ocean University College of Food and Medicine, Zhoushan 316022, China; 2. Zhoushan HSBC Cold Storage Logistics Development, Co. Ltd., Zhoushan 316002, China)

To study the effect of low-voltage variable-frequency electric field on the microbial community characteristics of microfrozen hairtail () during storage, Miseq genome sequencing technology was used to sequence the base information of the microbial community of Zhoushan hairtail stored for 40 days. The microbial community composition and development information affecting the preservation effect of hairtail were analyzed by OTU clustering, diversity analysis, and correlation analysis. On this basis, the effects of electric field in different intensities (0, 2, 2.5, 3 kV/m) on the microbial community composition of hairtail were studied. According to the results of relative abundance of bacteria, we speculated that,, andwere the main spoilage bacteria of hairtail microbial spoilage. The results show that after 40-day storage, the relative abundances of OTU6 psychrophilic bacteria and OTU13C were less than 1%, and OTU7, OTU14, OTU8, OTU9 and other bacterial genera were not clustered by OTU. Specifically, the antibacterial and fresh-keeping effect of low-voltage electrostatic field in 3 kV/m intensity was the best, under which the species of miscellaneous bacteria were the least, the species abundance and diversity of microbial community were the lowest, and the degree of corruption was the lowest.

hairtail; low-voltage electrostatic field; microorganism; high-throughput sequencing

TS254

10.11693/hyhz20210800189

*“十三五”國家重點研發(fā)計劃重點專項, 2019YFD0901604號; 舟山市科技計劃項目, 2020C12016號; 舟山市普陀區(qū)科技計劃項目, 2020JH102號。史恬恬, 碩士研究生, E-mail: 2020033759@qq.com

謝 超, 博士, 副教授, E-mail: xc750205@163.com

2021-08-27,

2021-09-25