李昕穎，趙永芳，王圣儀，崔宗巖，康文懷，王 飛，秦 玲, ，張 昂,

（1.河北科技大學(xué)食品與生物學(xué)院，河北石家莊 050018；2.秦皇島海關(guān)技術(shù)中心，河北秦皇島 066000；3.河北省葡萄酒質(zhì)量安全檢測重點實驗室，河北秦皇島 066000）

葡萄酒以其獨特的風(fēng)味和豐富的營養(yǎng)深受消費者青睞，且隨著人們生活水平的不斷提高，消費者對葡萄酒品質(zhì)也提出了更高要求。目前我國葡萄酒生產(chǎn)企業(yè)通過對栽培方式、釀酒原料、生產(chǎn)工藝等措施進行改善，使得葡萄酒質(zhì)量不斷提升，但其中仍存在一些難以避免的問題，如木塞污染物導(dǎo)致的葡萄酒質(zhì)量缺陷。木塞污染物一般表現(xiàn)為腐爛紙板、霉菌氣味，具有高揮發(fā)性及低閾值的特性，輕微污染就會導(dǎo)致葡萄酒異味[1]。木塞污染物在葡萄酒存儲過程中會逐漸遷移到酒中，影響葡萄酒品質(zhì)和可接受度，給葡萄酒行業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失[2]。

木塞污染物主要為鹵代苯甲醚、鹵代苯酚類化合物，其產(chǎn)生機理或來源復(fù)雜，如2,4,6-三氯苯酚（2,4,6-trichlorophenol，TCP）、五氯苯酚（pentachlorophenol，PCP）等氯酚類化合物主要在木塞前處理時作為阻燃劑、殺菌劑或防腐劑加入，也可以由多種來源的苯酚和氯（如某些清潔產(chǎn)品和消毒劑）在特定條件下反應(yīng)生成；而氯酚類化合物在曲霉菌、青霉菌、木霉菌等微生物的作用下甲基化，最終生成氯代苯甲醚類化合物[3]。其中最常見的葡萄酒木塞污染是2,4,6-三氯苯甲醚（2,4,6-trichloroanisole，TCA），除此之外還包括2,4,6-三氯苯酚（2,4,6-trichlorophenol，TCP）、2,3,4,6-四氯苯酚（2,3,4,6-tetrachlorophenol，TeCP）、2,3,4,6-四氯苯甲醚（2,3,4,6-tetrachloroanisole，2,3,4,6-TeCA）、2,3,4,5-四氯苯甲醚（2,3,4,5-tetrachloroanisole，2,3,4,5-TeCA）、五氯苯甲醚（pentachloroanisole，PCA）、五氯苯酚（pentachlorophenol，PCP）、2,4,6-三溴苯甲醚（2,4,6-tribromoanisole，TBA）、2,4,6-三溴苯酚（2,4,6-Tribromophenol，TBP）等[4?7]。

由于消費者對葡萄酒木塞污染物的感官閾值極低[1,8]，輕微污染即可產(chǎn)生較大影響，因此木塞污染物的檢測方法應(yīng)具有高選擇性、高靈敏性等特點，這將有利于葡萄酒質(zhì)量控制。本文論述了近十幾年來葡萄酒中木塞污染物的前處理與儀器檢測方法，前處理方法依其原理主要分為液相微萃取、固相萃取和固相微萃取等，檢測方法主要有氣相色譜法和氣相色譜聯(lián)用質(zhì)譜法、離子遷移譜法、生物傳感器法、酶聯(lián)免疫分析法及電子鼻法等，同時討論了各方法的優(yōu)缺點，以期為葡萄酒中木塞污染物檢測技術(shù)的進一步發(fā)展提供參考。

1 葡萄酒中木塞污染物檢測的前處理方法

由于葡萄酒中的TCA、TBA等污染物含量極低，因此對檢測方法的靈敏度要求較高，通常采用濃縮萃取的方法對樣品中污染物進行前處理，以提高靈敏度。目前，國內(nèi)外研究報道中常見的木塞污染物前處理方法主要包括液相微萃取、固相萃取、固相微萃取等。

1.1 液相微萃取

液相微萃取技術(shù)（Liquid phase microextraction，LPME）是Jeannot于1996年提出的一種樣品前處理技術(shù)[9]，其通過減少溶劑用量實現(xiàn)萃取的微型化，達到消除干擾物質(zhì)提高分析物濃度的目的。LPME技術(shù)的特點是有機溶劑用量少、操作簡便、無需特殊儀器，且可通過改變?nèi)軇┓N類實現(xiàn)選擇性萃取，目前被廣泛應(yīng)用于食品中農(nóng)獸藥殘留、生物毒素、環(huán)境污染物等的檢測研究中。以下將介紹一些應(yīng)用于葡萄酒中木塞污染物檢測的液相微萃取方法，包括：頂空單液滴微萃取、離子液體單滴微萃取、分散相液液微萃取、超聲輔助乳化微萃取、渦旋輔助液液微萃取。

頂空單液滴微萃取（Headspace single drop microextraction，HS-SDME）是一種利用單滴溶劑作為萃取劑，通過控制溫度將揮發(fā)性化合物吸附至密閉樣品瓶上空的掛有單滴溶劑的針尖上的濃縮萃取方法（圖1）[10?11]。其特點是所需萃取溶劑少，一般只需1~5 μL[12]，如Martendal等[13]報道了一種HS-SDME結(jié)合氣相色譜電子捕獲法（GC-ECD）測定葡萄酒樣品中TCA和TBA的方法，僅需2 μL正辛醇作為萃取劑，萃取時間25 min，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為12.4%和16.7%。當(dāng)然，作為萃取劑的單滴液體中除具有吸附能力的有機溶劑外離子液體也可作為萃取劑，離子液體一般由結(jié)構(gòu)不對稱的陰陽離子構(gòu)成，在室溫下接近液態(tài)，具有熱穩(wěn)定性好、粘度大、且不易脫落等特點，使得其成為單液滴微萃取中常用的萃取劑[14?15]。Márquez-Sillero等[16]介紹了離子液體單滴微萃取（Ionic liquid-based single drop microextraction，IL-SDME）結(jié)合離子遷移譜（Ion mobility spectrometry，IMS）測定水與葡萄酒中TCA的方法，水樣直接用IL-SDME進行前處理，而葡萄酒則需通過固相萃取步驟來消除乙醇對離子遷移譜的干擾；作者以2 μL 1-己基-3-甲基咪唑雙（三氟甲基磺酰）亞胺（[Hmim][NTf2]）作為萃取劑，萃取時間30 min，結(jié)果為RSD<3%；離子液體[Hmim][NTf2]對分析物具有很高的親和力，既有較強的分析物提取能力又與IMS兼容，在檢測器中的響應(yīng)可以忽略不計，同時克服了SDME中有機溶劑不穩(wěn)定導(dǎo)致的方法重現(xiàn)性低的缺點[13]。

圖1 葡萄酒木塞污染物檢測流程圖Fig.1 Flow chart for detecting cork taint compounds in wine

在葡萄酒中木塞污染物的液相微萃取方法中，較為常見的一種前處理方法為分散相液液微萃?。―ispersive liquid-liquid microextraction，DLLME）。DLLME是通過分散劑將萃取劑分散成無數(shù)細(xì)小液滴，使得萃取劑與樣品接觸面積增大，相互作用增加，將目標(biāo)物質(zhì)從樣品中快速萃取出[17]。DLLME中常見的萃取溶劑為丙酮，分散劑為四氯化碳（Pizarro 2010，Campillo 2010）[18?19]，如Pizarro等[18]對同時測定葡萄酒樣品中鹵代苯甲醚和鹵代苯酚的DLLME前處理方法中不同萃取劑（二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、四氯乙烯、氯苯和二硫化碳）和分散劑（甲醇、丙酮和乙腈）進行了選擇，通過組合實驗分析優(yōu)化發(fā)現(xiàn)：丙酮（1.3 mL）作為分散劑，四氯化碳（150 μL）為萃取劑，乙酸酐（75 μL）作為衍生劑時萃取效率最佳，萃取可在幾秒內(nèi)完成。另外，Campillo等[19]研究了萃取時間對DLLME萃取效率的影響，結(jié)果表明30 s~5 min內(nèi)，靈敏度無差異，DLLME萃取效率與時間無關(guān)。由此可見，與HS-SDME相比，DLLME在短時間內(nèi)即可完成萃取，可減少萃取時間，該技術(shù)是一種簡單，快速且廉價的方法。

在液相微萃取技術(shù)中，除了可以添加分散劑提高萃取效率，還可以通過超聲輔助或渦旋混合達到增強萃取溶劑的分散性、提高萃取效率的目的[20?21]。Fontana等[22]首次報道了將液液微萃取技術(shù)與超聲輻射技術(shù)結(jié)合的方法，利用氣相色譜離子阱質(zhì)譜法（GC-ITMS/MS）測定葡萄酒中TCA，具體以三氯乙烯作萃取溶劑，萃取5 min，超聲處理后離心，提取有機相進行檢測，該方法的富集倍數(shù)≥400。Pizarro等[23]將超聲輔助乳化微萃?。║ltrasound-assisted emulsification-microextraction，USAEME）技術(shù)用于葡萄酒中TCA，2,3,4,6-TeCA，TBA，PCA，TCP，TeCP，TBP和PCP的濃縮萃取，以四氯乙烯為萃取溶劑并借助超聲波將其分散在葡萄酒中，萃取5 min，萃取結(jié)束后使用GC-ECD檢測，檢出限均在1.9~4.9 ng/L之間，同時，通過對不同類型實際樣品的分析，證明了該方法的適用性。此外，Pizarro等[24]還建立了渦旋輔助液液微萃?。╒ortex assisted liquidliquid microextraction，VALLME）與氣相色譜-微電子捕獲檢測法（GC-μECD）結(jié)合測定葡萄酒中TCA、2,3,4,6-TeCA、TBA、PCA及其酚類前體物質(zhì)的方法。與DLLME技術(shù)相比，USAEME和VALLME技術(shù)避免了分散劑的使用，減少有機試劑用量。

1.2 固相萃取

固相萃?。⊿olid phase extraction，SPE）是一種通過填充吸附劑的萃取柱對分析物進行吸附，再使用洗脫劑將分析物洗脫出來以達分離目的技術(shù)（圖1）[25?26]。與普通液液萃取相比，SPE所需溶劑較少，且固定相吸附性強，分離效果好，容易收集分析物。

Insa等[27]將SPE與大體積進樣相結(jié)合，測定了葡萄酒樣品中的TCA和TBA，應(yīng)用LiChrolut EN固相萃取柱（1 mL，填料50 mg）進行提取，12.5 mL甲醇/水混合液（含1% NaHCO3）沖洗吸附劑以消除基質(zhì)干擾，0.6 mL二氯甲烷洗脫分析物后經(jīng)GCMS檢測，該方法幾乎無基質(zhì)干擾，得到TCA和TBA檢出限分別為0.2和0.4 ng/L。據(jù)Urunuela等[28]研究，對于葡萄酒中的TCA、TeCA、PCA使用OASIS HLB固相萃取柱提取，甲醇和正己烷洗脫，并結(jié)合大體積進樣技術(shù)可提高靈敏度，且富集倍數(shù)達500倍；但實驗通過比較分析物標(biāo)準(zhǔn)溶液和加標(biāo)的葡萄酒樣品中提取物產(chǎn)生的響應(yīng)，結(jié)果表明基質(zhì)效應(yīng)顯著，固相萃取柱中共提取物影響乙?；驼和檩腿?。

1.3 固相微萃取

固相微萃?。⊿olid-phase microextraction，SPME）技術(shù)是在SPE基礎(chǔ)上發(fā)展起的一種萃取技術(shù)，其主要原理是將涂有不同固定相涂層的纖維作為萃取頭浸入樣品溶液，起到對分析物的萃取與富集作用[29]。SPME裝置與傳統(tǒng)SPE相比，可將樣品吸附、萃取、富集等過程集于一體，在完成前處理后可直接進樣，操作簡單，無需有機溶劑，有效避免環(huán)境污染[30]。如表1所示，該技術(shù)是葡萄酒木塞污染物檢測中常見的前處理技術(shù)。

SPME中除直接將萃取頭浸入樣品溶液外，還可將萃取頭置于樣品液面上空，通過改變溫度使揮發(fā)性成分進入頂空中，即頂空固相微萃取（Headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）（圖1）。在SPME中纖維頭的選擇是影響萃取效果的關(guān)鍵因素之一，J?nsson等[31]比較了聚二甲基硅氧烷（PDMS）、聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯（PDMS/DVB）和聚丙烯酸酯（PA）三種纖維，結(jié)果表明PDMS-DVB對TCA萃取率最高，但干擾較強，PA和PDMS萃取率相近，PDMS萃取TBA的效率最高，最終作者選擇PDMS纖維用于葡萄酒中TCA、TBA的萃取，經(jīng)GC-MS檢測，LOD值分別為0.3和0.2 ng/L；同時，作者采用頂空取樣可降低非揮發(fā)性基質(zhì)成分吸附造成的纖維污染。Budziak等[32]采用了NiTi-ZrO2金屬代替易碎的石英作為纖維頭，可使SPME裝置更加堅固，結(jié)合GC-ECD對葡萄酒中TCA、TBA、PCA進行檢測，所有物質(zhì)檢出限均不超過8.0 ng/L，該嘗試為SPME技術(shù)提供了一種新的替代纖維。此外，磁力攪拌和超聲波等輔助萃取方式也是影響萃取效率的因素。張素娟等[33]對這兩種輔助萃取方式進行了對比，發(fā)現(xiàn)超聲波輔助萃取率更高，可提高方法的靈敏度，結(jié)合GC-ECD檢測葡萄酒中TCA得到相應(yīng)LOD值為0.2 ng/L。近年來，在HS-SPME基礎(chǔ)上改進，得到一種基于真空輔助頂空固相微萃?。╒acuumassisted HS-SPME，Vac-HS-SPME）方法，Vac-HSSPME保留了常規(guī)HS-SPME的簡單性，僅增加在進樣前后對樣品瓶抽真空的步驟[34]，優(yōu)點是在室溫下短時間內(nèi)即可獲得較高的萃取效率[35]。Vakinti等[36]采用模擬酒樣對Vac-HSSPME和HS-SPME的性能進行了比較研究，在兩種前處理方法各自最優(yōu)條件下檢測TCA、TeCA、PCA、TBA，Vac-HS-SPME方法的檢出限（0.13~0.19 ng/L）低于HS-SPME（0.26~0.76 ng/L）；同時，Vac-HS-SPME無需HS-SPME中加熱樣品的過程，室溫萃取更有利于保持樣品原有成分，并最大限度減少吸附樣品中的干擾成分。

攪拌棒吸附萃取（Stir bar sorptive extraction，SBSE）的基本原理與SPME相同，是通過涂有一層如PDMS等材料的攪拌棒吸附分析物的技術(shù)[37?38]，由于SBSE中PDMS等萃取介質(zhì)含量比SPME多，因此萃取效率相對較高[39]。目前，SBSE有三種商品化涂層：PDMS、聚丙烯酸酯（PA）和乙二醇-硅膠（EG-silicone）[40]。Zalacain等[41]采用PDMS涂層的磁性攪拌棒吸附葡萄酒中的TCA、2,3,4,5-TeCA、PCA等物質(zhì)，室溫下以700 r/min攪拌60 min后轉(zhuǎn)入熱脫附管并進行GC-MS分析，得到TCA的LOD值為0.34 pg/L，遠(yuǎn)低于SPME-GC-MS方法（0.3 ng/L）。Cacho等[42]對比了EG-silicone和PA兩種萃取相的萃取效率，發(fā)現(xiàn)EG-silicone比PA靈敏近5倍，且無需衍生即可測定酒中氯酚類物質(zhì)。

注射器微萃取（Microextraction by packed sorbent，MEPS）是傳統(tǒng)SPE的小型化，注射器內(nèi)裝有少量吸附劑，樣品通過吸附劑時分析物被吸附，再用有機溶劑洗脫[43]，溶劑使用量遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)SPE，所需樣品量、萃取時間也低于SPME與SBSE，帶有吸附劑的注射器可多次使用，降低了整個分析的成本[44?45]。在MEPS中，洗脫劑的選擇是實驗中最常優(yōu)化的條件，García Pinto等[46]以C18為吸附劑，研究了乙醇、甲醇和乙酸乙酯等洗脫劑的效率，結(jié)果表明乙醇對TCA、TeCA、TBA和PCA的回收率分別為97%、92%、93%和91%，高于其它洗脫劑，因此選擇乙醇為洗脫劑洗脫鹵代苯甲醚；萃取時間15 min遠(yuǎn)低于SPME的40 min（Weingart 2010）[47]，SBSE的60 min（Ochiai 2011）[48]。

2 葡萄酒中木塞污染物檢測的儀器分析方法

木塞污染物具有種類多、含量極低的特點，在對葡萄酒中木塞污染物的檢測研究中，除了篩選建立適宜的樣品前處理（萃取、富集）方法外，選擇性強、靈敏度高的分析檢測手段亦非常重要。表1匯總了近十多年來國內(nèi)外針對木塞污染物的檢測方法，主要包括氣相色譜法和氣相色譜聯(lián)用質(zhì)譜法、離子遷移譜法、生物傳感器法、酶聯(lián)免疫分析法及電子鼻法等，在此予以重點介紹。

2.1 氣相色譜和氣相色譜聯(lián)用質(zhì)譜法

氣相色譜是以氣體為流動相，利用物質(zhì)在兩相中分配系數(shù)的不同進行分離[82]，是一種有效的化合物分離方法。由于葡萄酒基質(zhì)的復(fù)雜性以及檢測物的低含量，需要具有強分離能力與定性定量能力的分析技術(shù)來進行檢測，以下將介紹幾種常用的氣相色譜（GC）聯(lián)用不同檢測器的分析方法。

當(dāng)前，基于氣相色譜聯(lián)用多種檢測器法檢測木塞污染物的研究已有許多報道（表1）。其中，氣相色譜-嗅聞法（Gas chromatography-olfactometry，GC-O）是一種將氣相色譜與嗅覺儀結(jié)合使揮發(fā)性物質(zhì)分離再經(jīng)人鼻對氣味進行辨識的技術(shù)方法，GC-O可同時發(fā)揮人的感官和現(xiàn)代化儀器兩方面的優(yōu)勢[83?84]。Fuente等[58]評價了GC-O在葡萄酒異味測定中的篩選作用，研究結(jié)果表明基于GC-O的篩選技術(shù)是一種快速、靈敏的葡萄酒缺陷檢測工具，可作為不需要絕對定量的化合物檢測的有效替代方法。而且雖然GC-O可用于樣品中芳香活性成分的鑒定，但只能初步鑒定化合物，而無法對獲得活性成分結(jié)構(gòu)信息，GC-O-MS將GC-O和GC-MS結(jié)合實現(xiàn)了對芳香物質(zhì)的定性[83]。Ochiai等[48]提出SBSE與多維-氣相色譜-嗅聞質(zhì)譜（MDGC-O-MS）結(jié)合鑒定葡萄酒中芳香物質(zhì)，盡管TCA響應(yīng)強度很低，但在與其嗅覺信號相對應(yīng)的時間存在清晰的質(zhì)量色譜圖，并通過葡萄酒中TCA的加標(biāo)回收率證明了該方法性能。

GC-ECD中ECD是一種離子化檢測器，是通過電負(fù)性組分進入檢測器時捕獲因β-射線轟擊載氣而電離產(chǎn)生的電子，使基流下降產(chǎn)生信號，因此電負(fù)性越強，檢測器靈敏度也隨之越高。氯代苯甲醚及氯酚類木塞污染物均含有多個氯原子，電負(fù)性較強，選用ECD進行檢測選擇性好、靈敏度高[85]，因此GC-ECD以其高靈敏性在木塞污染物分析領(lǐng)域中的應(yīng)用也逐漸增多（表1）。Vlachos等[86]建立了基于HS-SPMEGC-ECD的葡萄酒中TCA檢測方法，通過內(nèi)標(biāo)法消除基質(zhì)效應(yīng)，方法檢出限為0.177 ng/L。?zhan等[62]運用相同方法獲得的TCA檢出限為0.2 ng/L，方法穩(wěn)定可靠。Riu等[87]在研究葡萄酒中TCA時對GCMS與GC-ECD兩種分析方法進行了比較，結(jié)果表明兩種技術(shù)均可定量微量TCA，區(qū)別在于GC-ECD的靈敏度較GC-MS更高（GC-ECD校準(zhǔn)曲線斜率高于GC-MS），而GC-MS在SIM模式下無需全色譜分離因此運行時間更短（GC-ECD約35 min，GC-MS約5 min），與GC-MS相比，ECD的缺點主要是只適用于鹵代化合物，不能檢測其他類污染物。

表1 2009~2020年葡萄酒木塞污染物檢測研究Table 1 Literature on the detection of cork taints in 2009~2020

續(xù)表 1

續(xù)表 1

Giannikopoulos等[60]采用SPME技術(shù)對葡萄酒進行濃縮萃取，GC-MS在SIM模式下檢測，內(nèi)標(biāo)法定量，測得葡萄酒中TBA檢出限為2 ng/L。趙英蓮等[65]采用HS-SPME-GC-MS聯(lián)用技術(shù)檢測葡萄酒中的TCA，GC-MS采用EI離子源，TCA檢出限和定量限分別為0.3和1 ng/L，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差?。≧SD=1.03%），方法精密可靠。劉卿等[59]運用SPME對葡萄酒樣品進行濃縮萃取，選擇比EI源更加靈敏的NCI（負(fù)化學(xué)電離）源在SIM模式下檢測葡萄酒中的TCA，以TCA-D5為內(nèi)標(biāo)定量，方法的LOD、LOQ值分別為0.06、0.2 ng/L。除此外，為了減少基質(zhì)效應(yīng)、提高檢測靈敏度可選擇串聯(lián)質(zhì)譜，其高選擇性在去除基質(zhì)干擾等方面更具有優(yōu)勢。Ruiz-Delgado等[88]通過SPME與GC-MS/MS結(jié)合方法檢測葡萄酒中的TCA，質(zhì)譜儀在選擇反應(yīng)監(jiān)測（SRM）模式下以保證檢測的高特異性和高靈敏度，TCA定性離子和定量離子分別為m/z 167、m/z 195，方法檢出限為0.1 ng/L。陳樹兵等[70]采用HS-SPME結(jié)合GC-MS/MS（EI源）方法同時測定葡萄酒中TCA、TCP、TeCP、PCA和PCP，5種化合物的檢出限均在0.1 ng/L以下。

除四級桿質(zhì)譜外，鄧曉軍等[89]研究了HS-SPMEGC-ITMS/MS檢測葡萄酒中痕量污染物的方法，以2,4,6-三氯甲苯（TCT）為內(nèi)標(biāo)進行定量，選取TCA母離子和子離子分別為m/z 210和m/z 195，方法定量限為2 ng/L。Jeleń等[61]報道了一種采用全二維氣相色譜飛行時間質(zhì)譜儀（GC×GC-TOF-MS）檢測葡萄酒中TCA的方法，由于全二維氣相色譜是由兩支獨立的色譜柱串聯(lián)而成的分離系統(tǒng)，可提高分辨率且峰容量更大，方法線性范圍在5~2000 ng/L，檢出限在0.09~2.92 ng/L；同時，Jeleń還對GC×GC-TOF-MS與GC-MS/MS和GC-MS（SIM）進行了比較，GC×GC-TOF-MS的檢出限低于GC-MS，但高于GC-MS/MS，此外，GC×GC-TOF-MS的優(yōu)勢是可以提供分析化合物完整的質(zhì)譜信息，有助于峰的鑒定。

2.2 離子遷移譜法

IMS是通過揮發(fā)性和半揮發(fā)性有機化合物等離子化離子的遷移率來區(qū)分不同化學(xué)物，通過漂移時間的差異實現(xiàn)離子分離進而檢測的分析技術(shù)，是一種相對便宜、簡單的替代分析技術(shù)[90]（圖1）。Márquez-Sillero等[16]提出將SDME與IMS聯(lián)用，萃取后直接進入IMS分析，TCA的LOD值為0.2 ng/L，且在毫秒內(nèi)即可獲得遷移率譜，而GC-MS需要數(shù)10 min[59,65]。而Karpas等[79]探討了IMS在無GC分離或其它預(yù)濃縮時在正、負(fù)兩種模式下直接測定葡萄酒中TCA的能力，結(jié)果與報道的檢出限[16]相比較高，考慮到葡萄酒中TCA含量較低還需要在測定前進行預(yù)濃縮、分離步驟。

除此之外，Márquez-Sillero等[74]對上述方法進行了改進，提出了頂空集束毛細(xì)管柱-離子遷移譜（Headspace-multicapillary column-ion mobility spectrometry，HS-MCC-IMS）的新技術(shù)，MCC-IMS是利用毛細(xì)管色譜進行樣品預(yù)分離，再進入離子遷移譜儀對物質(zhì)檢測的技術(shù)，樣品可直接加入頂空瓶中，無需任何額外處理即可對葡萄酒樣品中TCA含量進行直接分析，酒樣中TCA的LOD值分別為0.012 ng/L。HS-MCC-IMS技術(shù)由于所選擇的負(fù)電離模式和多毛細(xì)管柱而使其較常規(guī)GC-MS更具選擇性，靈敏度也得到提高，此外，HS-MCC-IMS的成本和維護費用也均低于GC-MS。

2.3 生物傳感器法

生物傳感器法（Biosensor）測定特定物質(zhì)的工作原理是在細(xì)胞中人工插入待測物特異性抗體，當(dāng)待測物與細(xì)胞膜上的同源抗體位點結(jié)合會引起細(xì)胞膜電位的顯著變化，因此，可以通過細(xì)胞對各種被測物的響應(yīng)進行識別與檢測（圖1）[81,91]。

Varelas等[81]提出了一種基于哺乳動物細(xì)胞的新型生物傳感器技術(shù)，即細(xì)胞通過滲透插入TCA特異性抗體（pAb76）進行膜工程化，并將工程細(xì)胞固定在海藻酸鈣凝膠中，傳感器測量膜電位的變化而產(chǎn)生的電響應(yīng)，方法的LOD值為0.1 ng/L，傳感器在TCA濃度為1.02~12.0 ng/L范圍內(nèi)呈線性響應(yīng)。由于該方法對其他鹵代苯甲醚物質(zhì)也存在一定響應(yīng)，可進一步提高其選擇性。

2.4 酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是將抗原或抗體與特定固相載體結(jié)合，使其在載體表面與酶結(jié)合，此酶標(biāo)抗原或抗體保留了免疫活性和酶活性，檢測時通過酶反應(yīng)底物的顯色進行定性或定量的一種免疫分析方法[92]。

Sanvicens等[93]首先對三種抗血清/包被抗原（As76/C14-CONA，As78/C9-OVA，As88/C-OVA）進行篩選，最終采用As78/C9-OVA作為抗血清/包被抗原，IgG-HRP作為酶標(biāo)抗體，在含7%乙醇的緩沖介質(zhì)中，測定結(jié)果具有良好的準(zhǔn)確性，IC50值為0.53 μg/L，檢出限為0.044 μg/L，干白和干紅樣中TCA的LOD值分別為200和1 μg/L。該方法對TCA有較高特異性，但TBA和基質(zhì)效應(yīng)會對檢測產(chǎn)生干擾，因此在樣品檢測中必須開發(fā)與免疫分析方法兼容的前處理方法來消除這種不良影響。Sanvicens等[94]對上述方法做了進一步優(yōu)化，建立了一種基于IS-SPE-ELISA的葡萄酒中TCA、TBA高通量篩選分析方法，該方法將免疫親和固相萃取與酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)結(jié)合，可選擇性的提取固定相中的分析物，消除基質(zhì)效應(yīng)，顯著提高了免疫化學(xué)分析方法的可檢測性。但與檢測分析中常見的氣相色譜質(zhì)譜法相比，酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)特異性較強，一般只能對一種污染物進行檢測，同時其他類似化合物會對檢測結(jié)果產(chǎn)生影響，因此該方法在高要求的實際檢測中應(yīng)用受限。

2.5 電子鼻法

電子鼻（Electronic-nose，EN）是一種通過模擬動物的嗅覺系統(tǒng)，識別和分類芳香混合物的技術(shù)；能夠重復(fù)測量，且無需將復(fù)雜混合物分離即可確定由獨特氣味特征模式表示的復(fù)雜混合物的特性[75,95]，響應(yīng)時間短，重復(fù)性好。

Arroyo等[75]將感官評價分析與電子鼻對葡萄酒中揮發(fā)性異味成分的感知和識別閾值進行了比較研究，結(jié)果表明，電子鼻在香氣成分的識別閾值方面優(yōu)于人鼻但感知水平不及人鼻，因此，電子鼻可以作為感官分析評價的補充，有助于在葡萄酒或軟木塞的加工和儲存過程中提早發(fā)現(xiàn)TCA等異味物質(zhì)。

盡管電子鼻技術(shù)在香氣成分的識別閾值上識別效果好，但由于給出的是混合氣體的整體信息，因此單一成分精確定量能力不強，且檢出能力與香氣成分識別閾值和濃度有關(guān)，因此還不能作為葡萄酒中木塞污染物檢測的準(zhǔn)確定量工具。

3 展望

鹵代苯甲醚及鹵代苯酚污染會導(dǎo)致葡萄酒產(chǎn)生發(fā)霉異味，是影響葡萄酒品質(zhì)的主要缺陷之一。葡萄酒中是否含有TCA等污染物是葡萄酒品質(zhì)評價的一項重要指標(biāo)，建立方便快捷、靈敏性高的檢測方法可為葡萄酒質(zhì)量監(jiān)測提供技術(shù)保障。目前，有關(guān)葡萄酒中木塞污染物的檢測研究已有許多報道，其中HSSPME與GC-MS結(jié)合實現(xiàn)了從前處理到儀器檢測的自動化，適合批量分析，已成為木塞污染物檢測最常應(yīng)用的手段。然而，現(xiàn)有分析檢測技術(shù)也存在不少弊端，如面臨設(shè)備昂貴、基質(zhì)干擾強等問題，因此，準(zhǔn)確、快速、便捷的檢測方式是亟待研究的課題之一，新的檢測技術(shù)也需向更快速、更高效、更環(huán)保的方向發(fā)展。

前處理方法中，液相微萃取雖可有效地用于目標(biāo)分析物的提取，但還需尋找萃取效率高、環(huán)境友好的新型溶劑，也可與超聲輔助等技術(shù)聯(lián)用以提高萃取效率；固相微萃取無需使用有機溶劑，但常用的熔融石英萃取纖維昂貴易損，因此對于新型萃取纖維的研發(fā)也非常重要，以及縮短萃取時間也是固相微萃取方法亟待解決的問題；當(dāng)然多種技術(shù)相結(jié)合以克服前處理時間長、基質(zhì)效應(yīng)、無法實現(xiàn)自動化等問題也是未來技術(shù)的發(fā)展方向。

色譜分析法是常見的儀器檢測分析方法，GCECD由于氯酚類污染物的高電負(fù)性對其有較高靈敏性，但不適用于含氯化合物以外的其它木塞污染物的發(fā)現(xiàn)與檢測，且定性能力不及GC-MS或GC-MS/MS，而GC-MS的抗干擾能力和定性能力更強，同時近年來三重四級桿質(zhì)譜的應(yīng)用逐步提高了定量與定性能力，但設(shè)備成本較高，對于消除基質(zhì)效應(yīng)、提高檢測速度等方面也還需改進；而離子遷移譜技術(shù)應(yīng)用較少，未能與各種前處理方式進行有效結(jié)合而發(fā)揮出檢測速度快、成本低等優(yōu)勢；生物傳感器法、酶聯(lián)免疫吸附法等檢測方法，具有方便、快速、靈敏性強的特點能夠滿足現(xiàn)場檢測的需要，但基質(zhì)效應(yīng)、特定抗體識別等因素對于該類技術(shù)的影響較大，無法實現(xiàn)對葡萄酒中多種污染物的準(zhǔn)確定量，因此快速檢測技術(shù)的研發(fā)仍需不斷深入。

總之，在不斷完善現(xiàn)有方法的同時，降低檢測成本，探索新型檢測技術(shù)，穩(wěn)定、抗干擾、可全面檢測多種污染物的快速檢驗方法的開發(fā)依舊是未來進一步研究的方向，檢測技術(shù)的提高必將推動葡萄酒行業(yè)的良性發(fā)展。