盧鍵媚，林曉蓉，陳忠正，李 斌，張媛媛

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642）

熱加工可有效地破壞食品中的酶和微生物，降低水分活度，有利于食品保藏。但是，熱加工也會(huì)促進(jìn)內(nèi)源性污染物的產(chǎn)生，如3-脫氧葡萄糖醛酮（3-deoxyglucosone, 3-DG）和5-羥甲基糠醛（5-Hydroxymethylfurfural, 5-HMF）等[1?3]。研究發(fā)現(xiàn)，3-DG具有細(xì)胞毒性并會(huì)造成細(xì)胞損傷[4]，誘發(fā)糖尿病[5]；5-HMF會(huì)對(duì)人體的黏膜、皮膚和眼睛產(chǎn)生刺激作用[6?7]，并損傷肝、腎等器官[8?9]，對(duì)人體具有潛在危害。因此，研究食品中3-DG和5-HMF的生成規(guī)律迫在眉睫。

食品中的3-DG和5-HMF由己糖（果糖或葡萄糖）發(fā)生脫水反應(yīng)形成。3-DG的形成途徑有兩條：a.在美拉德反應(yīng)中，果糖或葡萄糖與氨基化合物反應(yīng)形成Schiff堿，Schiff堿環(huán)化形成不穩(wěn)定的Heyns和Amadori重排產(chǎn)物，pH≤7時(shí)通過烯醇化作用形成1,2-烯胺醇，該物質(zhì)隨后脫水形成3-DG[10?11]；b.在焦糖化反應(yīng)中，己糖在酸性條件下也可通過烯醇化作用生成3-DG[10]。3-DG可進(jìn)一步脫水形成3,4-二脫氧葡萄糖醛酮（3,4-dideoxyglucosone, 3,4-DG），3,4-DG脫去一分子水并環(huán)化形成5-HMF[8,10]，所以3-DG是5-HMF的前體物質(zhì)之一。另外，在高溫和干燥條件下，果糖和蔗糖可以形成高活性的呋喃果糖陽離子，該物質(zhì)可直接轉(zhuǎn)化為5-HMF[12]。

3-DG和5-HMF廣泛存在于咖啡、曲奇、蜂蜜、果干等食品中[1,10]，但有關(guān)食品體系中3-DG和5-HMF形成規(guī)律的研究鮮有報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)以果糖、葡萄糖、蔗糖和檸檬酸為材料，構(gòu)建糖-檸檬酸反應(yīng)體系，研究糖種類、pH、溫度、金屬離子種類和含不同價(jià)態(tài)硫的化合物對(duì)3-DG及5-HMF形成的影響，并采用零級(jí)動(dòng)力學(xué)、一級(jí)動(dòng)力學(xué)和二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型擬合3-DG和5-HMF的形成過程，旨在為糖酸含量豐富的食品中3-DG和5-HMF的形成與控制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

5-羥甲基糠醛（5-HMF，純度≥98%，色譜純）上海源葉生物科技有限公司；3-脫氧葡萄糖醛酮（3-DG，純度≥95%，色譜純） 加拿大TRC公司；甲醇（色譜純） 美國Spectrum公司；檸檬酸、檸檬酸鈉、葡萄糖、果糖、蔗糖、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂、氯化鋁、硫代硫酸鈉、亞硫酸鈉、焦亞硫酸鈉、硫酸鈉、二乙三胺五乙酸（DETAPAC）、鄰苯二胺 分析純，北京普博欣生物科技責(zé)任有限公司。

Agilent 1200高效液相色譜儀 美國安捷倫公司；ZORBAX Eclipse XDB-C18液相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm） 美國安捷倫公司；Millipore型號(hào)超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司；HH-1數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州金壇良友儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 反應(yīng)條件對(duì)糖-檸檬酸反應(yīng)體系中3-DG及5-HMF形成的影響

1.2.1.1 糖種類的影響 用pH3的0.1 mol/L檸檬酸緩沖液分別溶解果糖、蔗糖和葡萄糖，使其濃度為50 mmol/L，取2 mL于比色管中，在100 ℃下水浴反應(yīng)1~9 h后，冰水浴中冷卻至室溫（約25 ℃），定容后測定3-DG及5-HMF含量。

1.2.1.2 pH的影響 分別用pH為3、4、5、6的0.1 mol/L檸檬酸緩沖液溶解果糖，使其濃度為50 mmol/L，取2 mL于比色管中，在100 ℃下水浴反應(yīng)1~9 h后，冰水浴中冷卻至室溫（約25 ℃），定容后測定3-DG及5-HMF含量。

1.2.1.3 溫度的影響 用pH3的0.1 mol/L檸檬酸緩沖液溶解果糖，使其濃度為50 mmol/L，取2 mL于比色管中，分別置于70、80、90、100 ℃下水浴反應(yīng)1~9 h后，冰水浴中冷卻至室溫（約25 ℃），定容后測定3-DG及5-HMF含量。

1.2.1.4 金屬離子的影響 用pH3的0.1 mol/L檸檬酸緩沖液溶解果糖，并分別加入不同濃度的KCl、CaCl2、MgCl2或AlCl3，使果糖濃度為50 mmol/L，K+、Ca2+、Mg2+或Al3+的濃度為0、20、40、60、80、100 mmol/L。取2 mL混合液，置于100 ℃下水浴反應(yīng)5 h后，冰水浴中冷卻至室溫（約25 ℃），定容后測定3-DG及5-HMF含量。

1.2.1.5 含不同價(jià)態(tài)硫的化合物的影響 用pH3的0.1 mol/L檸檬酸緩沖液溶解果糖，并分別加入不同濃度的Na2S2O3、Na2SO3、Na2S2O5或Na2SO4（硫價(jià)態(tài)分別為+2、+4、+4、+6），使果糖濃度為50 mmol/L，各化合物的濃度分別為0、20、40、60、80、100 mmol/L。取2 mL混合液，置于100 ℃下水浴反應(yīng)5 h后，冰水浴中冷卻至室溫（約25 ℃），定容后測定3-DG及5-HMF含量。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 濃度為1000 mg/L的3-DG或5-HMF儲(chǔ)備液的配制：分別稱取3-DG、5-HMF標(biāo)準(zhǔn)品10 mg（精確至0.0001 g）于10 mL容量瓶，一級(jí)水溶解并定容，4 ℃冰箱保存。

3-DG標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：配制濃度分別為0.5、1.0、5.0、10.0、17.5和25.0 mg/L的3-DG標(biāo)準(zhǔn)工作液；取1 mL上述標(biāo)準(zhǔn)工作液，加入pH7、含18.5 mol/L DETAPAC、濃度為4 mg/mL的鄰苯二胺溶液，在60 ℃下水浴反應(yīng)1 h；反應(yīng)結(jié)束后，樣品經(jīng)0.22 μm聚醚砜濾膜過濾，高效液相色譜儀（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）待測。以濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制3-DG標(biāo)準(zhǔn)曲線。

5-HMF標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：配制濃度分別為0.1、1.0、5.0、10.0、20.0 mg/L的5-HMF標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，經(jīng)0.22 μm聚醚砜濾膜過濾，HPLC待測。以濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制5-HMF標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 3-DG的測定方法 3-DG的檢測參考Hellwig等[13]的方法并稍作修改。3-DG的衍生方法如下：取反應(yīng)液1 mL，加入pH7、含18.5 mol/L的DETAPAC、濃度為4 mg/mL的鄰苯二胺溶液，60 ℃水浴1 h，用0.22 μm的聚醚砜濾膜過濾后，HPLC待測。3-DG的分析條件如下：色譜柱為ZORBAX Eclipse XDBC18（4.6 mm×250 mm, 5 μm），柱溫35 ℃；流動(dòng)相為甲醇（A）和0.15%醋酸水溶液（B），流速為0.70 mL/min；洗脫條件為0~15 min，20%~50% A；15~18 min，50% A；18~20 min，50~20% A；20~28 min，20% A；檢測波長為314 nm，進(jìn)樣量為20 μL。采用外標(biāo)法定量，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=22.402x+1.4372，相關(guān)系數(shù)為0.9994。

1.2.4 5-HMF的測定方法 反應(yīng)液用0.22 μm的聚醚砜濾膜過濾后，利用HPLC分析。5-HMF的分析條件如下：色譜柱為ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫35 ℃；流動(dòng)相為甲醇（A）和水（B），流速為0.60 mL/min；洗脫條件為0~16 min，10% A；16~17 min，10%~45% A；17~23 min，45% A；23~24 min，45%~10% A；24~33 min，10%A；檢測波長為284 nm，進(jìn)樣量為20 μL。采用外標(biāo)法定量，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=208.27x+7.4183，相關(guān)系數(shù)為0.9999。

1.2.5 模型建立 采用零級(jí)動(dòng)力學(xué)、一級(jí)動(dòng)力學(xué)和二級(jí)動(dòng)力學(xué)3種模型分析反應(yīng)體系中3-DG和5-HMF的變化規(guī)律，其公式分別如下：

式中：t為反應(yīng)時(shí)間，h；C0為3-DG和5-HMF的起始濃度，mg/L；Ct為3-DG和5-HMF在t時(shí)間的濃度，mg/L；k0、k1和k2分別為零級(jí)動(dòng)力學(xué)、一級(jí)動(dòng)力學(xué)和二級(jí)動(dòng)力學(xué)的反應(yīng)速率常數(shù)，mg·L?1·h?1、h?1和L·mg?1·h?1。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示；采用SAS 9.2軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，顯著性檢驗(yàn)水平為P=0.05；采用Origin8.0軟件繪制圖形；采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析。

2 結(jié)果分析

2.1 糖的種類對(duì)糖-檸檬酸反應(yīng)體系中3-DG及5-HMF形成的影響

在pH3、糖液濃度為50 mmol/L、溫度100 ℃條件下，研究糖的種類（果糖、蔗糖和葡萄糖）對(duì)3-DG和5-HMF形成的影響，結(jié)果如圖1所示。從圖1A可知，隨加熱時(shí)間延長，3種糖-檸檬酸反應(yīng)體系中3-DG的生成量均逐漸增加，且果糖和蔗糖反應(yīng)體系3-DG生成量遠(yuǎn)高于葡萄糖反應(yīng)體系；反應(yīng)結(jié)束時(shí)（9 h），果糖和蔗糖反應(yīng)體系中3-DG生成量分別為葡萄糖反應(yīng)體系的32.8和31.2倍。在果糖和蔗糖反應(yīng)體系中，3-DG的形成過程可分為兩個(gè)階段。a.快速形成階段（0~5 h）：兩反應(yīng)體系中3-DG生成量分別高達(dá)106.9和111.8 mg/L；b.緩慢形成階段（5~9 h）：兩反應(yīng)體系3-DG的量繼續(xù)逐漸增加，但增長趨勢變慢，僅分別增加了20.8和9.6 mg/L；反應(yīng)9 h時(shí)，兩反應(yīng)體系3-DG生成量分別達(dá)到127.7和121.4 mg/L的最大值。在酸性條件下加熱，蔗糖易發(fā)生水解形成葡萄糖和果糖。葡萄糖的結(jié)構(gòu)在溶液中較果糖穩(wěn)定，這導(dǎo)致單獨(dú)的葡萄糖體系形成3-DG的量較蔗糖和果糖體系少[14]。

圖1 糖種類對(duì)3-DG（A）和5-HMF（B）形成的影響Fig.1 Effects of sugar types on the formation of 3-DG（A） and 5-HMF（B）

5-HMF的形成如圖1B所示，隨加熱時(shí)間延長，果糖、蔗糖和葡萄糖反應(yīng)體系中5-HMF含量均逐漸增加，反應(yīng)9 h時(shí)，果糖和蔗糖反應(yīng)體系中5-HMF生成量分別達(dá)到159.9和149.6 mg/L的最大值，為葡萄糖反應(yīng)體系的30.8和28.8倍，該結(jié)果與張玉玉等[14]的研究一致。這是因?yàn)樵谒嵝约訜釛l件下，蔗糖易發(fā)生水解形成葡萄糖和果糖，而水解產(chǎn)生的果糖是蔗糖反應(yīng)體系中形成5-HMF的主要反應(yīng)物，且果糖轉(zhuǎn)化成5-HMF的速率比葡萄糖快；另一方面，葡萄糖在水中以環(huán)狀的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定存在，不易發(fā)生烯醇化反應(yīng)，難以轉(zhuǎn)化為5-HMF[15]。因此，本實(shí)驗(yàn)中果糖和蔗糖反應(yīng)體系5-HMF形成趨勢相似，且形成量遠(yuǎn)多于葡萄糖。

采用零級(jí)動(dòng)力學(xué)、一級(jí)動(dòng)力學(xué)和二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型對(duì)3種反應(yīng)體系中3-DG和5-HMF生成過程進(jìn)行擬合，結(jié)果如表1和表2所示。從表1可以看出，R2二級(jí)動(dòng)力學(xué)>R2零級(jí)動(dòng)力學(xué)>R2一級(jí)動(dòng)力學(xué)，且二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型的R2均大于0.95，說明本研究條件下，3-DG的形成更符合二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型，即其生成量與加熱時(shí)間成對(duì)數(shù)關(guān)系。從表2可以看出，采用零級(jí)動(dòng)力學(xué)模型分析5-HMF的形成時(shí)，各決定系數(shù)R2均大于0.95，說明其生成量與加熱時(shí)間成線性關(guān)系。以上動(dòng)力學(xué)結(jié)果表明，二級(jí)動(dòng)力學(xué)和零級(jí)動(dòng)力學(xué)可以分別預(yù)測3種反應(yīng)體系中3-DG和5-HMF的形成。此外，蔗糖和果糖反應(yīng)體系中3-DG和5-HMF的反應(yīng)速率常數(shù)k均明顯大于葡萄糖反應(yīng)體系，說明這兩種反應(yīng)體系中3-DG和5-HMF的形成速率比葡萄糖反應(yīng)體系的更快。蔗糖和果糖反應(yīng)體系中，3-DG的反應(yīng)速率常數(shù)非常接近，5-HMF的速率常數(shù)也呈現(xiàn)相似規(guī)律，說明兩個(gè)體系3-DG和5-HMF的形成速率均較為接近，與圖1中兩反應(yīng)體系3-DG（A）和5-HMF（B）生成曲線一致的結(jié)果吻合。

表1 不同糖-檸檬酸反應(yīng)體系中3-DG的形成動(dòng)力學(xué)分析Table 1 Kinetics analysis of 3-DG formation in different sugar-citric acid reaction systems

表2 不同糖-酸檸檬酸反應(yīng)體系中5-HMF的形成動(dòng)力學(xué)分析Table 2 Kinetics analysis of 5-HMF formation in different sugar-citric acid systems

2.2 pH對(duì)果糖-檸檬酸反應(yīng)體系中3-DG及5-HMF形成的影響

在果糖濃度為50 mmol/L，溫度100 ℃條件下，研究pH（3~6）對(duì)3-DG和5-HMF形成的影響，結(jié)果如圖2所示。方差分析表明，pH對(duì)3-DG的形成具有顯著影響（P<0.05），且反應(yīng)體系pH越小，3-DG生成量越大；反應(yīng)結(jié)束時(shí)（9 h），pH3的反應(yīng)體系中3-DG生成量高達(dá)127.7 mg/L，分別是pH為4、5、6的1.2、1.6和4.1倍。其原因可能是：反應(yīng)體系pH的降低促進(jìn)了果糖發(fā)生烯醇化反應(yīng)生成3-DG[10]。另外，pH4~6的反應(yīng)體系中，反應(yīng)后期（8~9 h）3-DG含量略有下降，這與3-DG化學(xué)性質(zhì)活潑可能進(jìn)一步降解形成丙酮醛、5-HMF等產(chǎn)物有關(guān)[2]。

pH對(duì)5-HMF形成的影響如圖2B所示，pH的降低能顯著促進(jìn)5-HMF形成（P<0.05），反應(yīng)9 h時(shí)，在pH3的反應(yīng)體系中，5-HMF生成量分別是pH為4、5、6反應(yīng)體系的1.3、5.7和69.4倍；這可能與低pH下3-DG（5-HMF的前體物）生成量增大有關(guān)。Pham等的研究發(fā)現(xiàn)，降低橙汁pH能促進(jìn)5-HMF的形成[16]，陳醋中5-HMF含量與有機(jī)酸含量之間也存在正相關(guān)關(guān)系[17]，這與本實(shí)驗(yàn)的規(guī)律一致。因此，在實(shí)際生產(chǎn)過程中可適當(dāng)提高反應(yīng)體系pH以抑制3-DG和5-HMF的形成。

圖2 pH對(duì)3-DG（A）和5-HMF（B）形成的影響Fig.2 Effects of pH on the formation of 3-DG（A）and 5-HMF（B）

為探究不同pH下3-DG和5-HMF的生成規(guī)律，分別采用零級(jí)動(dòng)力學(xué)、一級(jí)動(dòng)力學(xué)和二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型對(duì)3-DG和5-HMF的生成過程進(jìn)行擬合（pH為4、5、6的反應(yīng)體系中，3-DG生成量在后期呈現(xiàn)下降趨勢，故分別選取三者中1~8、1~6和1~3 h的時(shí)間段進(jìn)行3-DG形成動(dòng)力學(xué)分析），結(jié)果如表3所示。從表3可以看出，R2二級(jí)動(dòng)力學(xué)>R2零級(jí)動(dòng)力學(xué)>R2一級(jí)動(dòng)力學(xué)，且二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型的R2均大于0.92，說明3-DG的形成符合二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型，即其生成量與加熱時(shí)間成對(duì)數(shù)關(guān)系。5-HMF的動(dòng)力學(xué)分析結(jié)果如表4所示，通過比較這3個(gè)動(dòng)力學(xué)模型的R2，發(fā)現(xiàn)5-HMF的形成符合零級(jí)動(dòng)力學(xué)模型（R2>0.90），其形成量與時(shí)間成線性關(guān)系。以上動(dòng)力學(xué)結(jié)果表明，二級(jí)動(dòng)力學(xué)和零級(jí)動(dòng)力學(xué)可以分別較好地預(yù)測pH3~6的反應(yīng)體系中3-DG和5-HMF的形成。通過比較3-DG和5-HMF最適動(dòng)力學(xué)模型的k值發(fā)現(xiàn)，k值均隨pH的降低而增大，說明pH越小，3-DG和5-HMF生成速率越高。

表3 不同pH下3-DG的形成動(dòng)力學(xué)分析Table 3 Kinetics analysis of 3-DG formation under different pH values

表4 不同pH下5-HMF的形成動(dòng)力學(xué)分析Table 4 Kinetics analysis of 5-HMF formation under different pH values

2.3 溫度對(duì)果糖-檸檬酸反應(yīng)體系中3-DG及5-HMF形成的影響

本實(shí)驗(yàn)研究了pH3、果糖濃度為50 mmol/L條件下，溫度（70、80、90、100 ℃）對(duì)果糖-檸檬酸反應(yīng)體系中3-DG和5-HMF形成的影響，結(jié)果如圖3所示。方差分析結(jié)果表明，溫度顯著影響反應(yīng)體系3-DG及5-HMF的形成（P<0.05），且溫度越高，3-DG及5-HMF生成量越大。溫度70~90 ℃時(shí)，溫度每升高10 ℃，相同反應(yīng)時(shí)間下3-DG生成量約增加了1.9~3.3倍，但溫度從90 ℃提升至100 ℃時(shí)，其生成量增加了10.4~19.5倍。溫度對(duì)5-HMF形成的影響表現(xiàn)出類似的規(guī)律（圖3B），反應(yīng)9 h時(shí)，100 ℃條件下5-HMF的生成量分別為90、80、70 ℃的5.4、23.5和181.9倍。溫度提高對(duì)3-DG和5-HMF形成的促進(jìn)作用體現(xiàn)在兩方面：一是溫度的提升可促進(jìn)果糖的開環(huán)，而開環(huán)的果糖具有較高的反應(yīng)活性[18]；二是較高的溫度可促進(jìn)烯醇化作用和脫水反應(yīng)，有利于果糖經(jīng)烯醇化作用形成3-DG，后者進(jìn)一步脫水形成5-HMF[8,19]。此外，果糖的熔點(diǎn)為95 ℃，當(dāng)溫度提高至100 ℃時(shí)，果糖已處于熔融狀態(tài)，該狀態(tài)下的果糖極易發(fā)生焦糖化反應(yīng)，導(dǎo)致3-DG和5-HMF大量形成[20]。

圖3 溫度對(duì)3-DG（A）和5-HMF（B）形成的影響Fig.3 Effects of temperature on the formation of 3-DG（A） and 5-HMF（B）

分別采用零級(jí)動(dòng)力學(xué)、一級(jí)動(dòng)力學(xué)和二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型對(duì)不同溫度下3-DG和5-HMF的形成過程進(jìn)行擬合，結(jié)果如表5和表6所示。從表5可知，溫度100 ℃條件下，R2二級(jí)動(dòng)力學(xué)>R2零級(jí)動(dòng)力學(xué)>R2一級(jí)動(dòng)力學(xué)，與零級(jí)動(dòng)力學(xué)和一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型相比，采用二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型擬合3-DG的形成過程時(shí)，所得方程的R2更高，說明該模型可以很好地描述100 ℃時(shí)3-DG的形成；溫度為70、80和90 ℃時(shí)，零級(jí)動(dòng)力學(xué)模型的R2最高，說明上述溫度條件下，3-DG的形成符合零級(jí)動(dòng)力學(xué)模型。5-HMF的動(dòng)力學(xué)結(jié)果如表6所示（在70 ℃條件下，反應(yīng)1~5 h內(nèi)無5-HMF形成，故該溫度下僅采用6~9 h的數(shù)據(jù)對(duì)5-HMF形成動(dòng)力學(xué)進(jìn)行分析），溫度在70~100 ℃時(shí)，零級(jí)動(dòng)力學(xué)模型的R2更高，說明5-HMF的形成與時(shí)間成線性關(guān)系。上述動(dòng)力學(xué)結(jié)果表明，在70~90和100 ℃條件下，3-DG的形成分別符合零級(jí)和二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型；零級(jí)動(dòng)力學(xué)模型可用于預(yù)測70~100 ℃下5-HMF的形成。

表5 不同溫度下3-DG的形成動(dòng)力學(xué)分析Table 5 Kinetics analysis of 3-DG formation at different temperatures

2.4 金屬離子種類對(duì)果糖-檸檬酸反應(yīng)體系中3-DG及5-HMF形成的影響

本研究在pH3、果糖濃度為50 mmol/L、溫度100 ℃、加熱5 h的條件下，分析金屬離子種類（K+、Ca2+、Mg2+及Al3+，0~100 mmol/L）對(duì)果糖-檸檬酸反應(yīng)體系3-DG及5-HMF形成的影響，結(jié)果如圖4所示。從圖4A可知，K+、Ca2+、Mg2+和Al3+離子的添加能顯著促進(jìn)3-DG的形成（P<0.05），當(dāng)其濃度分別為40、100、80、80 mmol/L時(shí)，對(duì)3-DG形成的促進(jìn)作用最大，與對(duì)照相比，分別增加了12.2%、74.9%、26.6%和48.8%。然而，在一定濃度下，K+（20、60、80 mmol/L）、Mg2+（20 mmol/L）和Al3+（20 mmol/L）的添加對(duì)3-DG的形成與對(duì)照相比無顯著影響（P>0.05）。上述結(jié)果表明，金屬離子對(duì)果糖-檸檬酸反應(yīng)體系中3-DG形成的影響與其種類和濃度均有關(guān)。

離子種類對(duì)5-HMF形成的影響如圖4B所示。Ca2+、Mg2+和Al3+的添加可顯著促進(jìn)5-HMF的形成（P<0.05），并且三者的促進(jìn)作用隨其濃度的升高而增強(qiáng)，當(dāng)其濃度為100 mmol/L時(shí)，5-HMF的生成量最大，分別高達(dá)165.2、129.9和539.2 mg/L，與對(duì)照相比，分別增加了125.5%、77.5%和623.3%。該結(jié)果與Mesías等[21]的研究結(jié)果一致。其原因可能為，Ca2+、Mg2+可催化己糖水解，形成具有高反應(yīng)活性的呋喃果糖陽離子，該物質(zhì)進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為5-HMF[22]。Al3+能同時(shí)促進(jìn)3-DG（圖4A）和5-HMF的形成，但是其對(duì)5-HMF的促進(jìn)作用遠(yuǎn)大于3-DG，可能是因?yàn)锳l3+催化果糖形成呋喃果糖陽離子的作用強(qiáng)于形成3-DG，前者則比3-DG更能有效轉(zhuǎn)化成5-HMF[23]。此外，從圖4B可知，K+對(duì)5-HMF的形成無顯著影響（P>0.05）。Wen等[24]發(fā)現(xiàn)K+可促進(jìn)葡萄糖-天冬酰胺反應(yīng)體系中5-HMF的形成，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同，可能與反應(yīng)體系和反應(yīng)條件有關(guān)。

圖4 金屬離子對(duì)3-DG（A）和5-HMF（B）形成的影響Fig.4 Effects of metal ions on the formation of 3-DG（A） and 5-HMF（B）

2.5 含不同價(jià)態(tài)硫的化合物對(duì)果糖-檸檬酸反應(yīng)體系3-DG及5-HMF形成的影響

本研究在pH3、果糖濃度為50 mmol/L、溫度100 ℃、加熱5 h的條件下，分析了含不同價(jià)態(tài)硫的化合物（Na2S2O3、Na2SO3、Na2S2O5、Na2SO4，+2、+4、+4、+6，0~100 mmol/L）對(duì)果糖-檸檬酸反應(yīng)體系中3-DG和5-HMF形成的影響，結(jié)果如圖5所示。從圖5A可以看出：當(dāng)Na2S2O3濃度為40 mmol/L時(shí)，其對(duì)3-DG的形成有明顯抑制作用，抑制率為7.1%，但其他濃度下對(duì)3-DG的形成無顯著影響（P>0.05），這表明Na2S2O3對(duì)3-DG的作用效果與其濃度有關(guān)；隨Na2SO3濃度增大，其對(duì)3-DG形成的抑制效果增強(qiáng)，當(dāng)其濃度為100 mmol/L時(shí)，3-DG生成量與對(duì)照相比減少了30.4%，亞硫酸根可與糖類物質(zhì)的醛基形成加合物[20]，在本研究中，推測亞硫酸根可能通過與果糖發(fā)生縮合反應(yīng)，從而抑制3-DG的形成；Na2S2O5對(duì)3-DG的形成無顯著作用效果（P>0.05）；Na2SO4則可顯著促進(jìn)3-DG的形成（P<0.05），且隨Na2SO4濃度從20 mmol/L提高至80 mmol/L，3-DG生成量增加了18.7%。上述結(jié)果表明，含不同價(jià)態(tài)硫的化合物對(duì)3-DG形成的影響不同，含低價(jià)態(tài)硫的化合物（+2、+4價(jià)）對(duì)3-DG的形成無顯著影響（P>0.05）或可抑制其形成，而含高價(jià)態(tài)（+6價(jià)）硫的化合物對(duì)其形成具有促進(jìn)作用。

圖5 含不同價(jià)態(tài)硫的化合物對(duì)3-DG（A）和5-HMF（B）形成的影響Fig.5 Effects of compounds with different valences of sulfur on the formation of 3-DG（A） and 5-HMF（B）

含不同價(jià)態(tài)硫的化合物對(duì)5-HMF形成的作用效果與3-DG不同（圖5B）。首先，隨Na2SO4濃度增大，其對(duì)5-HMF形成的促進(jìn)作用增強(qiáng)，當(dāng)其濃度為100 mmol/L時(shí)，與對(duì)照相比，5-HMF生成量增加了70.6%，該結(jié)果與Sun等[25]的研究一致，其原因?yàn)镹a2SO4可催化果糖轉(zhuǎn)化成5-HMF的反應(yīng)，促進(jìn)5-HMF的形成。其次，Na2S2O3、Na2S2O5和Na2SO3則顯著抑制5-HMF的形成（P<0.05）；Na2S2O3濃度從40 mmol/L增加至100 mmol/L時(shí)，5-HMF生成量降低，5-HMF抑制率從11.2%提升至26.3%；Na2S2O5和Na2SO3對(duì)5-HMF的抑制有相似的規(guī)律，當(dāng)濃度為40 mmol/L時(shí)，二者對(duì)5-HMF抑制率分別為99.1%和96.2%，但隨濃度（60~100 mmol/L）進(jìn)一步增大，與40 mmol/L相比，二者對(duì)5-HMF的抑制效果已無顯著提升（P>0.05），這與Li等[26]的結(jié)果一致。Na2SO3的添加可同時(shí)抑制3-DG（圖5A）和5-HMF的形成，這表明Na2SO3引起5-HMF含量的減少與其抑制了5-HMF的前體物3-DG形成有關(guān)。此外，亞硫酸根可與5-HMF的羰基發(fā)生反應(yīng)，從而減少已生成5-HMF的量[27]。綜上所述，含低價(jià)態(tài)硫的化合物（+2、+4價(jià)）能抑制5-HMF的形成，而含高價(jià)態(tài)（+6價(jià)）硫的化合物對(duì)其形成具有促進(jìn)作用。

3 結(jié)論

本研究分析了糖種類、pH、溫度、離子種類和含不同價(jià)態(tài)硫的化合物對(duì)糖-檸檬酸體系中3-DG和5-HMF形成的影響及二者的形成動(dòng)力學(xué)。得出如下結(jié)論：

a.果糖和蔗糖較葡萄糖更容易轉(zhuǎn)化成3-DG及5-HMF，果糖/蔗糖-檸檬酸反應(yīng)體系中3-DG生成量分別高達(dá)127.7和121.4 mg/L，5-HMF的生成量分別高達(dá)159.9和149.6 mg/L。3-DG及5-HMF生成量隨pH（3~6）的提高而降低。溫度升高（70~100 ℃）可促進(jìn)3-DG和5-HMF的生成。在70~90 ℃下，3-DG的形成符合零級(jí)動(dòng)力學(xué)模型；100 ℃下，其形成符合二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型。在100 ℃條件下，5-HMF的形成符合零級(jí)動(dòng)力學(xué)。

b.金屬離子種類和含不同價(jià)態(tài)硫的化合物對(duì)果糖-檸檬酸反應(yīng)體系3-DG及5-HMF的形成有顯著影響（P<0.05）。Ca2+、Mg2+、Al3+均能促進(jìn)體系中3-DG和5-HMF的形成，且金屬離子濃度越高，二者生成量越大；K+僅能促進(jìn)體系中3-DG的形成。硫價(jià)態(tài)為+2的Na2S2O3可抑制3-DG與5-HMF的形成，且對(duì)3-DG的抑制作用與其濃度有關(guān)；硫的價(jià)態(tài)為+4的化合物中，Na2SO3可同時(shí)抑制3-DG和5-HMF的形成，Na2S2O5對(duì)3-DG形成無顯著影響（P?0.05），但可抑制5-HMF的形成；硫價(jià)態(tài)為+6的Na2SO4對(duì)3-DG和5-HMF的形成起促進(jìn)作用。本研究可為食品中3-DG和5-HMF的形成與控制提供理論參考。