靳化，趙勇，鐘建容,3，沈夢(mèng)塵，陳蕾*

1安徽醫(yī)科大學(xué)海軍臨床學(xué)院，合肥 230032；2解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心婦產(chǎn)科，北京 100048；3華南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣州 510006

根據(jù)WHO規(guī)定，夫婦未采取任何避孕措施同居生活1年以上，由于男方因素造成女方不孕者，稱為男性不育癥。研究表明，不孕不育的發(fā)病率約為15%，男女因素各占一半[1]。生殖系統(tǒng)感染、性功能障礙、免疫因素、染色體異常等均可導(dǎo)致男性不育癥的發(fā)生[2-5]。在遺傳學(xué)病因中，克氏綜合征(47，XXY)及Y染色體微缺失為主要原因，均可導(dǎo)致無精子癥、極嚴(yán)重少精子癥及嚴(yán)重少精子癥[6-7]。對(duì)就診的不育患者進(jìn)行遺傳學(xué)篩查，有助于明確其是否患有導(dǎo)致不育的遺傳學(xué)疾病，對(duì)后續(xù)診療策略的制定以及輔助生殖方法的選擇至關(guān)重要[8]。本研究回顧性分析796例男性的染色體核型、Y染色體微缺失結(jié)果及其中部分男性的性激素檢測(cè)結(jié)果，以探討臨床診療中男性不育人群的遺傳學(xué)病因及性激素水平變化特征。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 回顧性分析2018年9月-2020年12月于解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心生殖中心就診的550例男性不育癥患者的臨床檢驗(yàn)資料，其中無精子癥187例，少精子癥363例(極嚴(yán)重90例、嚴(yán)重101例、輕中度172例)。同時(shí)納入健康男性246名(即同期于我院行輔助生殖助孕，經(jīng)檢查無不育因素的男性)作為對(duì)照。所有男性禁欲2~7 d，通過自慰獲取精液標(biāo)本，根據(jù)WHO《人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(第五版)[9]進(jìn)行精液分析，并根據(jù)精子濃度進(jìn)行分級(jí)[10]。(1)無精子癥：連續(xù)3次精液及射精后的尿液經(jīng)離心后鏡檢未見精子；(2)極嚴(yán)重少精子癥：精子濃度＜1×109/L；(3)嚴(yán)重少精子癥：精子濃度為(1~5)×109/L；(4)輕中度少精子癥：精子濃度為(5~15)×109/L；(5)正常：精子濃度＞15×109/L。所有研究對(duì)象均進(jìn)行染色體核型及Y染色體微缺失檢測(cè)。同時(shí)對(duì)納入此研究中的部分人群(無精子癥156例，極嚴(yán)重少精子癥70例，嚴(yán)重少精子癥75例，正常對(duì)照75例)進(jìn)行性激素(促黃體生成素、卵泡刺激素、催乳素、睪酮)水平檢測(cè)。本研究獲解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(HZKY-PJ-2021-46)。

1.2 檢測(cè)指標(biāo)分析 染色體核型分析：采用GRQ帶技術(shù)檢測(cè)，根據(jù)《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制》描述染色體核型；分析染色體異常與精子濃度之間的關(guān)系。Y染色體微缺失情況檢測(cè)：使用人Y染色體無精子癥因子(azoospermia factor，AZF)區(qū)微缺失核酸檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針法，北京愛普益生物科技有限公司；Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀)檢測(cè)Y染色體AZFa、AZFb、AZFc 3個(gè)區(qū)域的缺失狀態(tài)，每個(gè)區(qū)域分別以兩個(gè)序列標(biāo)簽位點(diǎn)(sequence tag site，STS)為代表。AZFa區(qū)：sY84和sY86；AZFb區(qū)：sY127和sY134；AZFc區(qū)：sY254和sY255。以SRY和β-actin位點(diǎn)為內(nèi)參照，F(xiàn)AM、VIC、CY5為熒光基團(tuán)；分析Y染色體微缺失在不同精子濃度人群中的發(fā)生情況。性激素4項(xiàng)檢測(cè)：使用化學(xué)發(fā)光法(UniCel DxI 800儀器及試劑盒均由美國(guó)貝克曼公司提供)進(jìn)行檢測(cè)；分別比較不同精子濃度人群、有無Y染色體微缺失人群的性激素水平差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。定性資料以例(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。定量資料不服從正態(tài)分布，均以M(Q1，Q3)表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 染色體核型情況 550例不育癥患者及246例健康對(duì)照中共有62例染色體核型異?；蛘６鄳B(tài)性變化(62/796，7.8%)。其中無精子癥18例(18/187，9.6%)，極嚴(yán)重少精子癥11例(11/90，12.2%)，嚴(yán)重少精子癥5例(5/101，5.0%)，輕中度少精子癥9例(9/172，5.2%)，健康對(duì)照19例(19/246，7.7%)。不育癥患者染色體異常發(fā)生率為4.0%(22/550)，健康對(duì)照為2.4%(6/246)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有男性中常染色體異常15例(15/796，1.9%)，其中羅伯遜易位5例，平衡易位6例，倒位3例，多一條標(biāo)記染色體1例；常染色體正常多態(tài)性12例(12/796，1.5%)；性染色體異常13例(13/796，1.6%)，其中克氏綜合征8例(7例無精子癥及1例極嚴(yán)重少精子癥)，超雄綜合征、46，XX男性綜合征、嵌合體、Y染色體雙著絲粒、Y染色體部分缺失各1例；性染色體正常多態(tài)性19例(19/796，2.4%)；另外有3名男性為常染色體+性染色體正常多態(tài)性變化(3/796，0.4%)(表1)。

表1 男性不育癥患者及健康對(duì)照染色體核型分布(例)Tab.1 Chromosome karyotype of male infertile patients and normal people (n)

2.2 Y染色體微缺失情況 550例不育癥患者中，Y染色體微缺失者共38例(6.9%)，其中無精子癥17例，極嚴(yán)重少精子癥18例，嚴(yán)重少精子癥2例，輕中度少精子癥1例；246例健康對(duì)照中未出現(xiàn)Y染色體微缺失；4例不育癥患者為染色體正常多態(tài)性+Y染色體微缺失，分別為46，XY，9qh+(1例)、46，XY，22ps+(1例)、46，XY，Yqh-(2例)，其中前2例為無精子癥，后2例為極嚴(yán)重少精子癥；46，XY，9qh+為AZFb區(qū)缺失，其余為AZFc區(qū)缺失；1例不育癥患者為染色體異常+Y染色體微缺失，為46，XX、AZFabc區(qū)缺失(表2)。

表2 男性不育癥患者及健康對(duì)照Y染色體微缺失情況[例(%)]Tab.2 Y chromosome microdeletion in male infertile patients and normal people [n(%)]

2.3 性激素檢測(cè)結(jié)果

2.3.1 無精子癥、極嚴(yán)重少精子癥、嚴(yán)重少精子癥及健康對(duì)照的比較 四組的促黃體生成素(P=0.000)、卵泡刺激素(P=0.000)及睪酮(P=0.023)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但催乳素水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。

表3 男性不育癥患者及健康對(duì)照的性激素水平比較[M(Q1，Q3)]Tab.3 Comparison of sex hormone levels between male infertile patients and normal people [M(Q1, Q3)]

2.3.2 無精子癥、極嚴(yán)重少精子癥、嚴(yán)重少精子癥中有無Y染色體微缺失患者性激素水平比較 Y染色體微缺失組的卵泡刺激素水平明顯高于無Y染色體微缺失組(P=0.032)，但兩組的促黃體生成素、催乳素、睪酮水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表4)。

表4 男性不育癥有無Y染色體微缺失患者的性激素水平比較[M(Q1，Q3)]Tab.4 Sex hormone levels in male infertile patients with or without Y chromosome microdeletion [M(Q1, Q3)]

3 討 論

在眾多導(dǎo)致男性不育的因素中，染色體異常較為常見。既往研究顯示，無精子癥患者中染色體異常比例為14.30%~22.97%，在極嚴(yán)重及嚴(yán)重少精子癥患者中該比例為2.30%~3.87%[11-13]。本研究不育男性中染色體異常22例(22/550，4.0%)。其中無精子癥患者12例(12/187，6.4%)，極嚴(yán)重少精子癥患者6例(6/90，6.7%)，兩者染色體異常的發(fā)生率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.937)。與以往的研究相比，本研究人群染色體異常發(fā)生率偏低，可能為調(diào)查人群的選擇、種族、區(qū)域等原因?qū)е隆?/p>

導(dǎo)致男性不育癥的遺傳學(xué)因素包括克氏綜合征、Y染色體微缺失、先天性雙側(cè)輸精管缺失、低促性腺激素性性腺功能減退等[6]?？耸暇C合征(47，XXY)在導(dǎo)致男性不育的遺傳學(xué)病因中占據(jù)重要地位，其主要表現(xiàn)包括性欲低下、小睪丸癥和不育癥等[6]。既往針對(duì)中國(guó)不育患者克氏綜合征的研究發(fā)現(xiàn)，其在無精子癥中的發(fā)病率為6.56%~15.54%，重度少精子癥中為0.52%，少精子癥中為3.77%[11-12]。本研究中克氏綜合征共有8例(無精子癥7例，7/187，3.7%；極嚴(yán)重少精子癥1例，1/90，1.1%)，發(fā)生率低于以往的研究數(shù)據(jù)。絕大部分的克氏綜合征患者表現(xiàn)為無精子癥[14]，與本研究結(jié)果相符。本研究中8例克氏綜合征患者有7例(無精子癥6例、極嚴(yán)重少精子癥1例)選擇輔助生殖技術(shù)獲得后代，其中6例無精子癥患者因睪丸穿刺未見精子而選擇供精，極嚴(yán)重少精子癥患者通過卵泡漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)(ICSI)獲得后代。有研究結(jié)果顯示，部分因克氏綜合征導(dǎo)致無精子癥的患者可通過顯微取精方式獲得精子，繼而行ICSI獲得后代，但其胚胎染色體異常的發(fā)生率明顯增高[15-16]。因我中心診療手段有限，故本研究中的無精子癥患者僅行睪丸穿刺而未行顯微取精，但其有可能通過顯微取精方式獲得精子從而避免選擇供精獲得后代。

本研究中有一例男性核型為46，X，del(Y)(q11.23-qter)，兩次精液檢測(cè)顯示精子密度分別為53.4×109/L、81×109/L，同時(shí)其Y染色體微缺失檢測(cè)結(jié)果未見異常，考慮缺失的Y染色體長(zhǎng)臂片段可能易位于其他染色體上。

本研究的550例不育癥患者及246名健康男性中常染色體異常的發(fā)生率為1.9%，與性染色體異常的發(fā)生率(1.6%)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.703)。在不育男性及正常對(duì)照人群中均出現(xiàn)羅伯遜易位及平衡易位，猜測(cè)此兩種核型可能與男性精子的產(chǎn)生無關(guān)。常染色體異常中有一例罕見的核型為47，XY，+mar的患者，表現(xiàn)為嚴(yán)重少精子癥，目前尚不清楚該異常(多一條標(biāo)記染色體)是否會(huì)對(duì)生育力產(chǎn)生影響，對(duì)于此類核型尚需要收集更多臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步研究。

1976年，Tiepolo等[17]第一次證實(shí)Y染色體長(zhǎng)臂缺失與男性不育有關(guān)。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，Y染色體上存在AZFa、AZFb、AZFc 3個(gè)與精子產(chǎn)生有關(guān)的區(qū)域，每個(gè)區(qū)域在精子產(chǎn)生的不同時(shí)期均起著重要作用，不同的區(qū)域缺失呈現(xiàn)出不同的臨床表現(xiàn)和發(fā)生頻率[6,18-22]。Y染色體微缺失是導(dǎo)致男性不育的另一重要遺傳學(xué)因素[6]。既往在中國(guó)人群中的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，無精子癥和重度少精子癥(精子濃度＜5×109/L)患者的Y染色體微缺失發(fā)生率分別為11.75%和8.51%[12]。本研究中Y染色體微缺失在無精子癥、極嚴(yán)重少精子癥及嚴(yán)重少精子癥患者中的發(fā)生率分別為9.1%、20.0%及2.0%，再次證實(shí)Y染色體微缺失與男性不育癥密切相關(guān)。

在本研究550例不育男性中，AZFc區(qū)缺失最為常見(6.2%，34/550)，但AZFa、AZFb、AZFbc、AZFabc區(qū)缺失發(fā)生率無明顯差異，且這4種類型均表現(xiàn)為無精子癥，推測(cè)可能的原因?yàn)楸狙芯渴菃沃行难芯壳沂苎芯咳巳旱南拗?，使不同類型缺失的發(fā)生率未表現(xiàn)出明顯的差異。部分AZFc區(qū)缺失的患者可通過顯微取精的方式獲得精子，然后行ICSI以產(chǎn)生后代[23-24]。在本研究中已確診為Y染色體微缺失的患者中，有9例無精子癥患者因診療手段受限未行顯微取精，而是直接通過供精獲得后代(AZFa區(qū) 1例，AZFb區(qū) 1例，AZFc區(qū) 7例)；有14例極嚴(yán)重少精子癥患者(AZFc區(qū))選擇ICSI方式獲得后代，但另有1例嚴(yán)重少精子癥患者(AZFc區(qū))選擇供精。

有研究表明，AZFc區(qū)缺失的患者其精液質(zhì)量隨著年齡的增長(zhǎng)逐漸變差[25]，但本研究AZFc區(qū)缺失患者中表現(xiàn)為無精子癥的年齡為23~36歲，表現(xiàn)為極嚴(yán)重少精子癥或嚴(yán)重少精子癥的年齡為24~45歲，未表現(xiàn)出明顯的精液質(zhì)量隨年齡增長(zhǎng)而下降的趨勢(shì)，這可能是由于本研究中Y染色體微缺失患者較少，缺乏充足數(shù)據(jù)導(dǎo)致的。本研究發(fā)現(xiàn)有1例30歲的輕中度少精子癥(3次精液常規(guī)顯示精子濃度分別為10.2×109/L、12.4×109/L、14.4×109/L)患者表現(xiàn)為AZFc區(qū)缺失。根據(jù)既往對(duì)Y染色體微缺失患者精液質(zhì)量與年齡之間的相關(guān)性研究結(jié)果，同時(shí)結(jié)合本研究中Y染色體微缺失患者所行的輔助生殖方法，臨床上應(yīng)重視對(duì)輕中度少精子癥患者Y染色體微缺失的檢測(cè)，以便盡早發(fā)現(xiàn)陽性患者，從而選擇合適的治療方法。

目前的研究表明，克氏綜合征及Y染色體微缺失是導(dǎo)致男性出現(xiàn)嚴(yán)重少精子癥、極嚴(yán)重少精子癥甚至無精子癥的常見遺傳學(xué)病因[6]。本研究中的部分無精子癥、少精子癥患者染色體核型及Y染色體微缺失檢測(cè)均未見異常，但這并不能說明此類患者無其他遺傳學(xué)方面的病因。通過高通量測(cè)序及表觀遺傳學(xué)等方法，已有研究發(fā)現(xiàn)其他與男性不育相關(guān)的遺傳學(xué)因素如CFTR、ADGRG2、TEX11、SPINK2、TEX15、PKD1基因等[26]。故針對(duì)此類患者需要進(jìn)行進(jìn)一步的基因檢測(cè)以明確病因。

男性體內(nèi)存在下丘腦-垂體-性腺軸調(diào)節(jié)性激素的水平及精子的生成。卵泡刺激素為男性體內(nèi)一種重要的激素，可與曲細(xì)精管的支持細(xì)胞膜受體結(jié)合，促進(jìn)性激素結(jié)合球蛋白及抑制素B的生成，影響精子的產(chǎn)生，同時(shí)抑制素B也對(duì)FSH水平起反饋?zhàn)饔肹27]。既往針對(duì)Y染色體微缺失患者性激素水平的研究發(fā)現(xiàn)，Y染色體上AZF位點(diǎn)的缺失可對(duì)精子的產(chǎn)生造成影響，從而導(dǎo)致抑制素B水平降低，而抑制素B則通過負(fù)反饋?zhàn)饔脤?dǎo)致卵泡刺激素水平升高；對(duì)于無Y染色體微缺失的不育癥患者，也會(huì)出現(xiàn)因精子產(chǎn)生障礙而導(dǎo)致的抑制素B水平降低、卵泡刺激素水平升高現(xiàn)象；但與無Y染色體微缺失的患者相比，Y染色體微缺失患者的抑制素B水平更低[28-29]。本研究中Y染色體微缺失患者的卵泡刺激素水平明顯高于無Y染色體微缺失的患者，與既往研究結(jié)果一致。但因本院未對(duì)男性不育患者常規(guī)開展抑制素B的檢測(cè)，故本研究人群的抑制素B與卵泡刺激素水平之間的關(guān)系無法驗(yàn)證。

綜上所述，在行輔助生殖助孕的男性不育患者中進(jìn)行遺傳學(xué)篩查，有助于發(fā)現(xiàn)潛在的不育原因，從而明確診斷，且對(duì)后續(xù)治療方法的選擇具有重要意義。