谷 爽，文超良，李俊英，吳桂琴，李光奇，韓文朋，閆奕源，孫從佼，楊 寧*

（1.中國農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，北京 100193；2.北京市華都峪口禽業(yè)有限責任公司，北京 101206）

雞肉品質(zhì)主要表現(xiàn)為外在表觀品質(zhì)和內(nèi)在食用品質(zhì)，內(nèi)在食用品質(zhì)由肌纖維物理和生化特性決定。肌纖維組織學特性包括肌纖維總數(shù)、肌纖維直徑、肌纖維面積和肌纖維密度等指標[1]。目前普遍認為骨骼肌肌纖維總數(shù)在胚胎期已固定，出雛后數(shù)量無變化[1]，而出雛后肌肉生長較大程度上由胚胎期形成的肌纖維總數(shù)決定[2]。因此，胚胎期肌纖維發(fā)育狀態(tài)對肌肉產(chǎn)量與質(zhì)量至關重要，研究胚胎期肌纖維發(fā)育對于改善雞肌肉品質(zhì)意義重大。Miraglia和Yalcin等研究發(fā)現(xiàn)，與慢速生長型雞相比，快速生長型雞擁有更多肌纖維數(shù)量、更大肌纖維面積和更小肌纖維密度[3-4]。對生長性狀高強度持續(xù)選育可能導致快速生長型雞在胚胎期形成更多肌纖維，出雛后通過肌纖維增生和肥大得到相對更大的肌纖維總面積，加速肌肉生長。

我國擁有極豐富雞種質(zhì)資源，主要分為：蛋雞、肉雞和兼用地方品種雞等。蛋雞品種產(chǎn)蛋性能優(yōu)良，但早期生長速度緩慢，常見高產(chǎn)蛋雞包括白來航雞和洛島紅雞。肉雞品種生長速度快，尤其是快大型白羽肉雞，其活重在6周齡可達到2.5 kg。地方品種雞大多為肉蛋兼用型，肉質(zhì)鮮美，長速介于蛋雞和肉雞之間，如北京油雞、茶花雞等。本研究從胚齡、組織、品種和性別4個因素出發(fā)，探究蛋雞、地方雞種和肉雞在胚胎后期肌纖維組織學發(fā)育差異，以期深入理解不同生長速度雞種在胚胎后期肌纖維發(fā)育特性，為提高雞肉產(chǎn)量與質(zhì)量探索新途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

試驗所用白來航雞和北京油雞合格種蛋來源于中國農(nóng)業(yè)大學動物科技學院家禽遺傳資源與育種試驗基地；白洛克雞和科尼什雞種蛋由北京市華都峪口禽業(yè)有限責任公司提供。白來航雞生長速度緩慢，為常見高產(chǎn)蛋雞；北京油雞遺傳性能穩(wěn)定，是我國珍貴地方雞種；科尼什雞和白洛克雞分別為快大型白羽肉雞父系和母系，生長速度快，6周齡體重均可達2.5 kg以上。

種蛋入孵前，用新潔爾滅消毒液清潔和消毒種蛋。種蛋孵化期間，溫度保持（37.8±0.1）℃，相對濕度60%，翻蛋時長60 s，翻蛋間隔90 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集

白來航雞、北京油雞、白洛克雞和科尼什雞種蛋孵化至ED15、ED17及出雛時，分別選擇雞胚重量相近公母雞胚各2只，采集左側(cè)完整胸大肌和腿肌，保存在裝有4%多聚甲醛的10 mL離心管中，用于后續(xù)石蠟切片制作。同時，采集雞胚皮膚組織暫存于-20℃冰箱用于后續(xù)性別鑒定。

1.2.2 雞胚性別鑒定

取出暫存于-20℃冰箱的雞胚皮膚組織，按照TransDirect Animal Tissue PCR Kit（AD201-01,北京全式金生物技術有限公司）操作步驟利用CHD1基因作PCR擴增鑒定性別，擴增反應體系：AD1Buffer、AD2 Buffer、AD3 Buffer混合液2μL，上游引物（10μmol·L-1）0.2μL，下游引物（10μmol·L-1）0.2μL，2×TransDirect PCR SuperMix 5μL，Nuclearfree water 2.6μL，總體積10μL。待反應結束后取9μL擴增產(chǎn)物點樣于1%瓊脂糖凝膠，140 V條件下跑膠10 min，最后使用凝膠成像系統(tǒng)（SmartGel 140，北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司）檢測結果。如圖1所示，1個條帶個體為公胚，2個條帶個體為母胚[5]。

圖1 電泳檢測Fig.1 Electrophoresis results

1.2.3 石蠟切片制作和染色

將采集的肌肉組織樣品置于4%多聚甲醛中固定48 h以上，垂直肌纖維方向修整肌肉獲得橫截面，依次經(jīng)20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%各級乙醇溶液脫水，隨后包埋石蠟、切片、撈片、烤片，最后采用蘇木素-伊紅染色（HE染色）。

1.3 肌纖維組織學特性測定

利用全自動數(shù)字病理切片掃描儀掃描切片，掃描完成后隨機選取至少8個部位放大至40×后輸出圖像。利用Image-J和Image-Pro Plus（6.0）軟件統(tǒng)計肌纖維直徑、肌纖維面積、肌纖維面積占比和肌纖維密度共4個指標。

測定各輸出圖像中單個肌纖維直徑和肌纖維面積，將單個樣本8個部位圖像的平均值代表個體肌纖維直徑和肌纖維面積；視野內(nèi)肌纖維總面積與輸出圖像總面積比值平均值為肌纖維面積占比；視野內(nèi)肌纖維根數(shù)與該輸出圖像總面積比值平均值為肌纖維密度。

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

將上述測定結果導入SPSS 25.0軟件，采用一般線性模型（General linear model,GLM）對肌纖維直徑、肌纖維面積、肌纖維面積占比、肌纖維密度在品種、性別、組織、胚齡間作最小二乘分析；利用單因素方差分析（ANOVA）不同維度作差異分析，結果以平均值±標準誤（mean±SEM）表示。

2 結果與分析

2.1 品種、胚齡、性別、組織部位對肌纖維組織特性的效應分析

對肌纖維直徑、肌纖維面積、肌纖維面積占比和肌纖維密度在品種、性別、組織、胚齡間作最小二乘分析，4個因素主效應及交互效應如表1所示。

表1 各因素主效應及交互效應分析Table 1 Analysisof main effects and interaction effects of four factors

由性別為主效應及性別與其他因素交互效應分析可知，肌纖維直徑、面積、面積占比、密度均不受性別影響。品種、組織和胚齡3個因素對肌纖維直徑、肌纖維面積、肌纖維密度主效應影響極顯著（P＜0.01），兩兩之間交互效應對肌纖維面積和肌纖維面積占比影響顯著（P＜0.05），3個因素交互效應對肌纖維組織學特性4個指標影響顯著（P＜0.05）。

2.2 胚胎后期肌纖維組織學形態(tài)比較分析

4個品種雞在胚胎后期肌纖維發(fā)育規(guī)律一致，以科尼什雞胸肌和腿肌在胚胎后期肌纖維組織學形態(tài)為例（見圖2），ED15時胸肌和腿肌肌纖維輪廓尚不清晰，ED17時肌纖維輪廓較為清晰，肌纖維初步形成。ED17至出雛這一時期，單根肌纖維開始增大，D1時肌纖維清晰可見。

ED17為肌纖維發(fā)育分界點，雞胚在此之前完成單核成肌細胞融合，形成多核肌纖維，此后開始肌纖維增大。由圖2B～C和E～F的肌纖維形態(tài)學圖可見，胸肌和腿肌在胚胎后期肌纖維發(fā)育速度略不同，相同放大倍數(shù)下，雞胚從ED17發(fā)育至D1，胸肌肌纖維面積變化較小。

圖2 科尼什雞ED15、ED17和D1胸肌和腿肌肌纖維橫切面圖（40×）Fig.2 Cross-sectional view of the pectoralis and leg musclefibersof Cornish in ED15,ED17 and D1（40×）

2.3 胸肌和腿肌在胚胎后期肌纖維發(fā)育差異

圖3（A～D）分別為白來航雞、北京油雞、白洛克雞和科尼什雞在胚胎后期胸肌和腿肌肌纖維組織學特性差異分析結果。從發(fā)育階段看，白來航雞、北京油雞和白洛克雞胸肌自ED17發(fā)育至D1，其肌纖維直徑和肌纖維面積未出現(xiàn)顯著變化（P＞0.05），而科尼什雞（見圖3D）胸肌肌纖維組織特性在ED17和D1兩個時間點表現(xiàn)顯著差異?？颇崾搽u胸肌肌纖維直徑和面積在D1顯著大于ED17（P＜0.05），肌纖維面積占比和肌纖維密度在ED17極顯著大于D1（P＜0.01）。4個品種雞腿肌肌纖維組織學特性在ED17和D1時表現(xiàn)一致，肌纖維直徑、面積和密度在兩個時間點均差異極顯著（P＜0.01），而肌纖維面積占比差異不顯著（P＞0.05）。

從組織部位看，雞胚發(fā)育至ED17時，白來航雞（見圖3A）與北京油雞（見圖3B）胸肌和腿肌的肌纖維直徑、肌纖維面積、肌纖維密度均未出現(xiàn)顯著差異（P＜0.05），而兩個肉雞品種雞（見圖3C～D）胸肌和腿肌已出現(xiàn)差異，表現(xiàn)為腿肌肌纖維極顯著大于胸?。≒＜0.01），胸肌肌纖維密度極顯著高于腿?。≒＜0.01）。此后腿肌肌纖維比胸肌發(fā)育快，D1時4個品種雞胸肌和腿肌肌纖維組織學特性均表現(xiàn)出顯著差異（P＜0.05），胸肌肌纖維密度仍極顯著高于腿?。≒＜0.01）。

圖3 4個雞品種胚胎后期胸肌和腿肌肌纖維組織特性Fig.3 Histological characteristics of the musclefibers of the pectoralis and leg muscles during the late embryonic period among four breeds of chickens

2.4 不同品種在胚胎后期肌纖維發(fā)育差異

胸肌肌纖維由ED17發(fā)育至D1，其形態(tài)學差異較小，因此本研究將ED17時胸肌肌纖維組織形態(tài)學在4個品種間差異作對比分析。由表2可知，白來航雞和北京油雞肌纖維直徑和面積比白洛克雞和科尼什雞大，但肌纖維直徑差異不顯著（P＞0.05），肌纖維面積差異顯著（P＜0.05），而白來航雞和北京油雞肌纖維密度顯著低于白洛克雞和科尼什雞（P＜0.05）；白來航雞和北京油雞肌纖維面積和肌纖維密度差異不顯著（P＞0.05），白洛克雞和科尼什雞肌纖維面積和肌纖維密度差異不顯著（P＞0.05）。

腿肌肌纖維在胚胎后期增加較快，本研究將D1時腿肌肌纖維形態(tài)學在4個品種間差異作對比分析。由表2可知，D1時腿肌肌纖維密度，白洛克雞和科尼什雞顯著高于白來航雞和北京油雞（P＜0.05），且白來航雞和北京油雞之間、白洛克雞和科尼什雞之間差異均不顯著（P＞0.05）。

表2 4個雞品種胚胎后期肌纖維組織特性統(tǒng)計Table 2 Statistical of the tissue characteristics of muscle fibers in the late embryonic period of four chicken breeds

圖4 4個雞品種肌肉橫切面圖（40×）Fig.4 Cross-sectional view of the muscle fibers of the four chicken breeds（40×）

3 討論

肌纖維是骨骼肌基本組成單位，占肌肉質(zhì)量75%～90%，在胚胎期由單核成肌細胞融合形成[6]。陳寬維等分析蛋雞、肉雞、地方雞和藥用雞肌纖維組織特性，發(fā)現(xiàn)不同遺傳背景雞肌纖維特性存在較大差異，說明肌纖維組織學特性與雞類型有一定關聯(lián)[7]。Tejeda等利用快速生長型肉雞和慢速生長型肉雞研究品種、性別和肌肉部位對肌纖維組織學特性影響，結果發(fā)現(xiàn)品種和性別對肌纖維面積影響較小，肌肉部位對肌纖維面積影響較大[8]，與本研究結果一致，即兩種肉雞在同一胚胎時期肌纖維面積差異較小，性別對肌纖維組織學特性影響不顯著（P＞0.05），而不同肌肉部位肌纖維面積差異顯著（P＜0.05）。趙衍銅等對不同品種肉雞在110日齡時肌纖維組織特性開展研究，得出品種間肌纖維直徑和面積差異顯著[9]。因隨著年齡增加，肌纖維直徑逐漸增大，密度逐漸減小[10]，肉雞肌纖維增大速度可能產(chǎn)生一定差異。成年后公雞通過分泌睪酮促進肌肉生長，減少肌內(nèi)脂質(zhì)沉淀[11]。李娟和譚麗勤等在1日齡、60和90日齡分別分析不同性別雞肌纖維直徑和密度，同一日齡時，公雞肌纖維密度高于母雞，肌纖維直徑低于母雞[12-13]。本研究結果顯示性別對肌纖維組織特性影響較小，可能由于胚胎期性腺處于發(fā)育初始階段，激素作用尚未體現(xiàn)，因此胚胎期公母雞之間肌纖維直徑和面積未表現(xiàn)出差異。

雞胚生長過程中所需營養(yǎng)、能量均由卵黃提供，雞胚發(fā)育至后期需更多能量促進機體生長以保證正常出雛及出雛后的活動。此時卵黃中營養(yǎng)已無法滿足雞胚能量需求，因此胚胎后期供能方式發(fā)生轉(zhuǎn)變，脂類代謝減少，糖酵解代謝增多，肝臟糖異生作用加強，進而動員雞胚胸肌中蛋白質(zhì)，為機體提供能量[14]。根據(jù)肌球蛋白ATP酶在不同pH下活性差異，可將骨骼肌分為I、IIa、IIb 3種類型。其中IIb型肌纖維內(nèi)含線粒體較少，表現(xiàn)糖酵解特性，而雞胸肌中有90%～100%肌纖維屬于IIb型肌纖維，可為胚胎后期糖酵解活動提供材料[15-16]。胸肌發(fā)生動員后，肌纖維中蛋白質(zhì)減少，胚胎后期胸肌重量降低，肌纖維直徑和面積減小，骨骼肌衛(wèi)星細胞活性降低、數(shù)量減少。陳偉研究發(fā)現(xiàn)，鴨胚從ED22至出雛當天，其胸肌肌纖維直徑減少55%，從組織形態(tài)學上證明該階段肌纖維發(fā)生萎縮[17]。對于白來航雞、北京油雞、白洛克雞和科尼什雞胚胎發(fā)育后期胸肌，其肌纖維在ED17和D1時形態(tài)差異?。≒＞0.05），進一步證明該時期胸肌發(fā)生大量糖酵解活動為機體發(fā)育供能。家禽胸肌與腿肌肌肉構造不同，其發(fā)育機制也存在差異。王珍研究發(fā)現(xiàn)AA肉雞發(fā)育至D1時，腿肌比胸肌發(fā)育快，表現(xiàn)為肌纖維直徑更大，肌纖維密度更小[18]。蔣明雅等研究發(fā)現(xiàn)我國地方肉雞在相同胚齡時，腿肌發(fā)育快于胸肌，具體表現(xiàn)為肌纖維直徑差異[19]。本研究與以上研究結果一致，即相同發(fā)育時期，腿肌發(fā)育比胸肌快，如科尼什雞在D1時胸肌肌纖維直徑為3.98μm，腿肌肌纖維直徑為7.64μm，二者差異極顯著（P＜0.01）。這與胚胎后期胸肌中蛋白質(zhì)大量降解有關，也可能是雞胚出雛后腿肌需迅速支持體重和維持運動，因此胚胎后期腿肌發(fā)育較快。鴨胚發(fā)育至后期，其胸肌和腿肌發(fā)育程度表現(xiàn)同樣差異，且在出雛后同樣存在[20]。對于不同品種雞之間腿肌發(fā)育差異，鄧宇翔研究發(fā)現(xiàn)在胚胎發(fā)育中后期，肉雞肌纖維密度少于地方雞，胚胎發(fā)育末期則高于地方雞，可能是由于這一時期肉雞腿肌中以直徑較小的慢速型肌纖維為主[21]。彭瓊等研究白羽肉雞、羅曼粉蛋雞和地方選育肉雞品種的肌纖維組織特性，比較3個品種在胚胎期骨骼肌發(fā)育特點，結果發(fā)現(xiàn)胚胎期肉雞腿肌重大于蛋雞，且腿肌分化時間早于胸肌[22]。D1時肉雞腿肌肌纖維密度顯著高于白來航雞和北京油雞（P＜0.05），說明胚胎發(fā)育后期不同品種雞腿肌發(fā)育速度不同，肉雞發(fā)育快于蛋雞和地方雞。

骨骼肌由肌纖維組成，肌肉品質(zhì)與肌纖維特性直接相關，其中肌纖維數(shù)量和肌纖維面積是影響肌肉質(zhì)量和產(chǎn)量主要因素[11,23]。胚胎期成肌細胞融合形成骨骼肌，肌纖維數(shù)量出雛后無變化，因此胚胎期形成的肌纖維數(shù)量對出雛后肌肉發(fā)育至關重要。本研究結果發(fā)現(xiàn)肉雞白洛克雞在D1時肌纖維面積為13.95μm2，與王紅楊研究結果一致[24]；但北京油雞在D1時肌纖維面積為15.88μm2，雖略高于白洛克雞，但并未達顯著水平，但王紅楊研究結果顯示北京油雞D1肌纖維面積極顯著高于科寶肉雞（P＜0.01），達到36.58μm2[24]。這可能因試驗所選肌肉視野不同，導致統(tǒng)計情況存在差異。廖菁研究發(fā)現(xiàn)，快速生長型雞肌纖維數(shù)量較慢速生長型雞多[25]。此外，隨著日齡增加，快速生長型雞肌肉中巨型肌纖維更多，肌纖維更粗，其日增重也越快[26]。胚胎期肌纖維數(shù)量與肌纖維面積呈負相關，與肌肉質(zhì)量呈正相關[27]，本研究結果從形態(tài)學上證實該點。對于快大型肉雞，其胚胎期肌纖維密度較慢速生長型蛋雞大，其肌纖維面積較慢速生長雞小，說明快大型肉雞在胚胎期成肌細胞可更多融合為肌纖維，因此出雛后快大型肉雞生長更快。肌纖維影響肌纖維束大小，快大型肉雞出雛后生長過快會導致肌肉橫切面相對粗糙，肉質(zhì)下降[28]。

4 結 論

本研究從4個維度分析雞在胚胎后期肌纖維組織學形態(tài)，結果發(fā)現(xiàn)性別對雞胚胎后期肌纖維組織特性影響小，而品種、胚齡、組織部位對其影響較大。組織形態(tài)學研究發(fā)現(xiàn)肉雞在胚胎期間形成單位面積內(nèi)更多數(shù)量肌纖維；ED17為肌纖維形成關鍵時期；腿肌在胚胎期發(fā)育速度較胸肌快。