馮梅 張娟 佘春燕 張青松

人視網(wǎng)膜微血管病變是多種代謝性疾病和心血管疾病的并發(fā)癥，如糖尿病、高血壓、白血病等都可引起視網(wǎng)膜微血管發(fā)生病變。以機(jī)體內(nèi)大分子物質(zhì)為原料，通過非酶促反應(yīng)生成的穩(wěn)定共價(jià)鍵產(chǎn)物-糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products, AGEs)是損傷視網(wǎng)膜微血管的重要因素之一。AGEs能夠刺激內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，使細(xì)胞發(fā)生凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)皮屏障功能發(fā)生障礙[1，2]。一氧化氮(nitric oxide, NO)是重要的舒血管因子，當(dāng)視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞受到一系列損傷時(shí)，其NO釋放量會(huì)減少，血管平衡穩(wěn)態(tài)被打破[3]。蛋白激酶/內(nèi)皮型一氧化氮合酶(protein kinase/endothelial nitric oxide synthase, AKT/eNOS)通路的活化可以促進(jìn)NO的釋放，從而降低血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和凋亡[4，5]研究報(bào)道，氫氣(hydrogen,H2)在機(jī)體中具有一定的生理作用，可作為抗氧化劑降低機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)[6]。多個(gè)研究表明，大鼠腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ臀霘錃夂笸ㄟ^抗氧化作用可以減輕再灌注損傷和炎性病變[7，8]。目前關(guān)于氫氣對(duì)AGEs誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及AKT/eNOS通路的影響并不十分清晰，我們圍繞此課題展開研究，揭示了氫氣在抗視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的部分機(jī)制。

資料與方法

一、主要試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)研究。人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞(human retinal microvascular endothelial cells,hRMECs)購自上海澤葉生物科技有限公司；AGE-BSA購自美國Biovision公司；二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO)、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、DMEM培養(yǎng)基、鏈霉素和青霉素均購自美國Gibco公司；細(xì)胞培養(yǎng)板購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；0.2%胰蛋白酶溶液購自武漢普諾賽生命科技有限公司；噻唑藍(lán)(MTT)、蛋白濃度測定試劑盒和蛋白提取試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；NO檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；AKT抗體、eNOS抗體、p-AKT抗體和p-eNOS抗體均購自TaKaRa公司。

超凈工作臺(tái)購自江蘇蘇凈集團(tuán)安泰公司；CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱購自德國Heraeus公司；高速低溫離心機(jī)購自SIGMA公司；Facscalibur流式細(xì)胞儀購自美國BD公司；電泳儀、凝膠成像儀、分光光度儀均購自Bio-Rad公司。

二、方法

1.HRM制備及實(shí)驗(yàn)分組：將H2在0.4 MPa高氣壓下溶解于細(xì)胞培養(yǎng)基中，現(xiàn)配現(xiàn)用并過濾消毒，富氫培養(yǎng)基的有效濃度為0.06 mmol[9]。

將hRMECs隨機(jī)分為4組，每組各設(shè)置5個(gè)平行對(duì)照：(1)正常組：正常培養(yǎng)hRMECs 24 h，不加干預(yù)；(2)AGEs組：向hRMECs中加入200 μg/ml的AGE-BSA[10]，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h；(3)HRM組：用HRM培養(yǎng)基培養(yǎng)hRMECs 24 h，不另加干預(yù)；(4)HRM+AGEs組：向hRMECs中加入200 μg/ml的AGE-BSA和HRM培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。

2.MTT法檢測hRMECs活力：將hRMECs以1×104個(gè)/ml的密度接種于96孔板中，每孔200 μl，培養(yǎng)24 h使細(xì)胞融合度達(dá)到90%左右時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。按照hRMECs的分組進(jìn)行干預(yù)和培養(yǎng)后，每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)溶液，37 ℃孵育4 h，棄去培養(yǎng)基，每孔加入150 μl DMSO，避光并用振蕩器混勻，酶標(biāo)儀測定每孔細(xì)胞的570 nm吸光度(A)值。細(xì)胞活性(%)=(A1～4組-A空白組)/(A1組-A空白組)×100%，空白組為150 μl的細(xì)胞培養(yǎng)基，用以排除培養(yǎng)板和培養(yǎng)基本底吸光值對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。

3.流式細(xì)胞術(shù)檢測hRMECs凋亡：配制密度為1×106個(gè)/ml的hRMECs單細(xì)胞懸液，2 ml/孔接種于6孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。按照hRMECs的分組對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)和培養(yǎng)后，棄去上層培養(yǎng)基并加入胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化，加入新的培養(yǎng)基終止消化后，4 ℃、1500 r/min離心10 min收集細(xì)胞，無菌磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)洗滌細(xì)胞2次，隨后用Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒中的緩沖液將細(xì)胞重懸，再次調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/ml。取各組100 μl重懸后的細(xì)胞分別加入流式管中，做好分組標(biāo)記，再向流式管中加入5 μl Annexin V-FITC抗體和5μl Annexin V-PI抗體，快速混合均勻后避光孵育15 min，加入400 μl緩沖液混勻后上樣流式細(xì)胞儀，分析細(xì)胞凋亡情況，全程冰上操作。

4.比色法hRMECs中Caspase-3和Caspase-9活性：將hRMECs以1×106個(gè)/ml的密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，按照hRMECs的分組進(jìn)行處理和培養(yǎng)。加入胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化，1500 r/min離心10 min，棄去培養(yǎng)基，用無菌PBS洗滌1次，收集細(xì)胞并加入細(xì)胞裂解液作用15 min，4 ℃低溫10000 r/min離心10 min。按照試劑盒說明書，取離心后上清液進(jìn)行Caspase-3和Caspase-9活性測定，通過酶標(biāo)儀測定405 nm吸光度(A)值。

5.檢測hRMECs的NO含量：將hRMECs以1×106個(gè)/ml的密度接種于6孔板中，每孔2 ml，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h使其形成單細(xì)胞層。按照hRMECs的分組對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)和培養(yǎng)，棄去舊培養(yǎng)基并加入胰蛋白酶消化細(xì)胞，終止消化后離心，無菌PBS洗滌細(xì)胞2次，離心收集細(xì)胞再加入細(xì)胞裂解液，4 ℃低溫10000 r/min離心10 min。按照試劑盒說明書，取離心后上清液進(jìn)行檢測，酶標(biāo)儀測定各組540 nm吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各組NO的含量。

6.蛋白質(zhì)印跡法(Western-Blot, WB)檢測hRMECs的AKT、eNOS、p-AKT及p-eNOS蛋白水平：hRMECs接種同比色法hRMECs中Caspase-3和Caspase-9活性測定，再按照hRMECs的分組對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)和培養(yǎng)。棄去培養(yǎng)基，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，培養(yǎng)基終止消化，1500 r/min離心10 min收集細(xì)胞，用無菌PBS洗滌細(xì)胞2次，1500 r/min、10 min再次離心并棄上清，加入細(xì)胞裂解液，低溫10000 r/min離心10 min，按照試劑盒說明書提取細(xì)胞總蛋白。蛋白定量后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，小心取出凝膠并使用電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行PVDF轉(zhuǎn)膜，在室溫下用5%脫脂奶封閉1h，加入稀釋(1:1000)后的對(duì)應(yīng)一抗，4 ℃搖床孵育過夜，棄去一抗溶液并洗滌PVDF膜，加入稀釋(1:2000)后的二抗溶液，室溫?fù)u床1 h，洗膜3次，ECL顯色并用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

利用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，方差齊性采用one way ANOVA檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，方差不齊采用one way ANOVA中Welch修正值，組間兩兩比較采用tamhane's T2值，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、H2對(duì)AGEs誘導(dǎo)hRMECs活力的影響

從結(jié)果中可以看出，相較于正常組和HRM組，AGEs組和HRM+AGEs組的細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05)；相較于AGEs組，HRM+AGEs組的細(xì)胞活力顯著升高(P<0.05)，各組細(xì)胞活性數(shù)據(jù)見表1。

表1 H2對(duì)AGEs誘導(dǎo)hRMECs活力的影響

二、H2對(duì)AGEs誘導(dǎo)hRMECs凋亡的影響

結(jié)果顯示，AGEs組和HRM+AGEs組的細(xì)胞凋亡率相比于正常組和HRM組顯著升高(P<0.05)；HRM+AGEs組的細(xì)胞凋亡率相比于AGEs組顯著降低(P<0.05)，結(jié)果見表2、圖1。

表2 H2對(duì)AGEs誘導(dǎo)hRMECs凋亡的影響

圖1 各組hRMECs細(xì)胞凋亡情況

三、H2對(duì)AGEs誘導(dǎo)hRMECs凋亡相關(guān)蛋白水平的影響

由結(jié)果可知，與正常組和HRM組相比，AGEs組和HRM+AGEs組的Caspase-3和Caspase-9活性明顯升高(P<0.05)；與AGEs組相比，HRM+AGEs組的Caspase-3和Caspase-9活性明顯降低(P<0.05)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 H2對(duì)AGEs誘導(dǎo)hRMECs的Caspase-3和Caspase-9活性的影響

四、H2對(duì)AGEs誘導(dǎo)hRMECs的NO含量的影響

結(jié)果顯示，AGEs組和HRM+AGEs組的細(xì)胞NO含量相比于正常組和HRM組明顯降低(P<0.05)；HRM+AGEs組的細(xì)胞NO含量相比于AGEs組明顯升高(P<0.05)，結(jié)果見表4。

表4 H2對(duì)AGEs誘導(dǎo)hRMECs的NO含量的影響

五、H2對(duì)AGEs誘導(dǎo)hRMECs的AKT、p-AKT、eNOS及p-eNOS蛋白水平的影響

從結(jié)果中可以看出，與正常組相比，HRM組、AGEs組和HRM+AGEs組的細(xì)胞AKT和eNOS蛋白水平無明顯差異(P>0.05)；但各組磷酸化信號(hào)蛋白p-eNOS和p-AKT水平明顯改變：與正常組和HRM組相比，AGEs組和HRM+AGEs組細(xì)胞的p-eNOS/eNOS和p-AKT/AKT比值顯著降低(P<0.05)；與AGEs組相比，HRM+AGEs組細(xì)胞的p-eNOS/eNOS和p-AKT/AKT比值顯著升高(P<0.05)，見表5、圖2。

圖2 H2對(duì)AGEs誘導(dǎo)hRMECs的AKT、p-AKT、eNOS及p-eNOS蛋白水平的影響

表5 各組hRMECs中p-AKT/AKT、p-eNOS/eNOS水平

討 論

視網(wǎng)膜病變可由多種代謝性疾病引發(fā)，以糖尿病為例：患者體內(nèi)的胰島素代謝異常致使血液成分發(fā)生改變，高血糖的環(huán)境會(huì)使AGEs不斷產(chǎn)生并積累，引起視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和功能異常，隨著病情的發(fā)展，表現(xiàn)為糖尿病性視網(wǎng)膜病變[11，12]。視網(wǎng)膜微血管發(fā)生病變會(huì)導(dǎo)致視力下降、眼底出血，甚至視網(wǎng)膜脫離造成失明[13]。因此，探究AGEs誘導(dǎo)視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的機(jī)制對(duì)于防治血管病變具有重要的臨床意義。

目前，研究者們對(duì)氫氣在多種疾病治療中發(fā)揮的抗氧化能力、抗炎癥能力和抗凋亡能力等方面進(jìn)行了研究。Zhang等[14]發(fā)現(xiàn)，哮喘小鼠模型吸入氫氣后，可通過抑制炎癥介質(zhì)和抗氧化失衡來減輕氣道炎癥和改善肺功能。除了氫氣吸入治療，富含氫的溶液也具有抗氧化應(yīng)激保護(hù)細(xì)胞的作用[15]。王衛(wèi)娜等[16]研究顯示，富含氫的培養(yǎng)基能顯著抵抗脂多糖導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞損傷。本研究構(gòu)建人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞AGEs損傷模型并設(shè)置富氫培養(yǎng)基干預(yù)組，結(jié)果顯示相較于正常組和HRM組，AGEs組和HRM+AGEs組細(xì)胞活力降低，凋亡率升高，凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3和Caspase-9活性升高；與AGEs組相比，HRM+AGEs組細(xì)胞活力升高，細(xì)胞凋亡率下降，凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3和Caspase-9活性降低。表明H2在人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞中對(duì)AGEs導(dǎo)致的凋亡具有抑制作用。

多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)，不同藥物在對(duì)AGEs誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的抑制過程中涉及到AKT/eNOS信號(hào)通路的激活，細(xì)胞內(nèi)活化的AKT與eNOS結(jié)合定位于細(xì)胞膜，并使eNOS磷酸化，活化的eNOS催化產(chǎn)生NO，用于保護(hù)細(xì)胞[17-19]。NO是維持血管正常張力所不可缺少的，它可與血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)受體結(jié)合，引起血管平滑肌松弛，使血管擴(kuò)張[20]。在糖尿病患者體內(nèi)，血糖持續(xù)升高會(huì)使eNOS活性降低，NO的產(chǎn)生也隨之減少，使得血管舒張功能紊亂，造成血液局部流速降低，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。為探究H2在AGEs導(dǎo)致的人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡中發(fā)揮抑制作用是否與AKT/eNOS信號(hào)通路相關(guān)，本研究檢測了各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的NO含量以及AKT、eNOS、p-AKT和p-eNOS蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示AGEs組和HRM+AGEs組與正常組和HRM組相比，細(xì)胞的p-eNOS/eNOS和p-AKT/AKT水平顯著降低，NO含量降低；HRM+AGEs組與AGEs組相比，細(xì)胞的p-eNOS/eNOS和p-AKT/AKT水平顯著升高，NO含量升高。該結(jié)果表明，H2可激活A(yù)KT/eNOS信號(hào)通路，通過促進(jìn)AKT和eNOS磷酸化，上調(diào)NO的釋放量，從而抑制人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，氫氣對(duì)AGEs誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡具有抑制作用，該作用可能通過激活A(yù)KT/eNOS/NO通路得以發(fā)揮。本研究初步探討了氫氣對(duì)AGEs誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用及機(jī)制，為防治血管病變相關(guān)研究提供一定方向和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，但其中涉及的具體機(jī)制以及應(yīng)用氫氣的臨床安全性還有待于更深一步的研究和更多的臨床實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。