嘎利兵嘎,錫林塔娜,劉志成

(1. 內蒙古農業(yè)大學職業(yè)技術學院,內蒙古 包頭 014109 ； 2. 錫林郭勒盟生態(tài)環(huán)境監(jiān)測站, 內蒙古 錫林浩特 026000 ； 3. 廣東省農業(yè)科學院動物衛(wèi)生研究所,廣東 廣州 510640)

隨著聚合酶鏈式反應 (Polymerase chain reaction,PCR) 技術的不斷更新發(fā)展，基于PCR方法的單核苷酸多態(tài)性 (Single nucleotide polymorphisms，SNP) 位點基因分型技術在畜牧獸醫(yī)臨床中的應用也日趨普遍。目前，基于PCR方法的SNP基因分型方法主要包括單鏈構象多態(tài)性聚合酶鏈式反應(Single strand conformation polymorphism-PCR,SSCP-PCR)[1]技術、限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈式反應(Restriction fragment length polymorphism-PCR，RFLP-PCR)[2]技術、擴增片段長度多態(tài)性聚合酶鏈式反應(Amplified restriction fragment polymorphism-PCR,AFLP-PCR)[3]技術、等位基因特異性擴增(Amplification refractory mutation system-PCR,ARMS-PCR)[4]技術、水解探針聚合酶鏈式反應(TaqMan probe-PCR)[5]技術、雙脫氧鏈終止法測序(Sanger sequence)[6]技術、基因芯片(Gene chip)[7]技術、高分辨率熔解曲線聚合酶鏈式反應(High resolution melting analysis-PCR,HRM-PCR)[8]技術和探針熔解曲線聚合酶鏈式反應(Fluorescence melting curve analysis-PCR,FMCA-PCR)[9]技術等。

在以上方法中，HRM-PCR和FMCA-PCR技術均通過PCR擴增產物的熔解溫度差異來區(qū)分不同SNP位點。HRM-PCR方法通過實時監(jiān)測升溫過程中雙鏈DNA熒光染料與PCR擴增產物的結合情況，來判斷是否存在SNP，而且不同SNP位點、是否是雜合子等都會影響熔解曲線的峰形，因此HRM-PCR分析能夠有效區(qū)分不同SNP位點。FMCA-PCR技術借助普通TaqMan探針近似分子信標的空間二級結構特點，通過其探針的熔解溫度差異來分析不同SNP位點的一種新型基因分型技術(圖1)。FMCA-PCR技術顛覆了傳統(tǒng)TaqMan探針無法做熔解曲線分析的觀點，并可在單個PCR管內同時進行多個SNP位點的檢測。本試驗利用犬細小病毒2型(Canine parvovirus-2，CPV-2)不同基因型樣本(CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c)來比較2種熔解曲線基因分型方法的優(yōu)缺點，為熔解曲線基因分型技術在獸醫(yī)臨床中的應用提供實際參考依據(jù)。

圖1 探針熔解曲線分析原理[10]Fig.1 Principle of probe melting curve analysis[10]

1 材料與方法

1.1 樣品 樣品為本實驗室從江蘇省常州市和廣東省廣州市寵物醫(yī)院收集的30份犬糞便棉拭子陽性樣本(膠體金試紙條陽性)核酸。

1.2 引物與探針設計 根據(jù)NCBI上已公布的CPV-2VP2基因序列分別設計出能夠區(qū)分CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c不同基因型的HRM-PCR擴增引物CPV-426F/426R、FMCA-PCR擴增引物cpv-F2/ab-Rev、探針P2以及測序引物CPV-1270F/1270R(表1)。HRM-PCR引物和FMCA-PCR引物擴增片段均包含2個SNP 位點，第1個SNP位點為A4062G，分別對應CPV-2a(AAT)和CPV-2b (GAT)；第2個SNP位點為T4064A，分別對應CPV-2b(GAT)和CPV-2c (GAA)(圖2)。

1.3 PCR反應與熔解曲線分析 HRM-PCR反應體系參照PremixTaqTMKit[生工生物工程(上海)股份有限公司]產品說明書配制反應液，總反應體系為20 μL：PremixEx-Taq預混液10 μL、CPV-426F 引物1 μL、CPV-426R引物1 μL、Eva Green 核酸染料1 μL、CPV-2病毒核酸模板DNA 1 μL、去離子水6 μL。 將配制好的反應液置于Rotor-GeneTMQ (凱杰，德國)儀器上，HRM-PCR 反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸30 s， 循環(huán)35次；PCR反應結束后68～80 ℃ 以0.3 ℃/s 的熔解速率進行熔解曲線分析。HRM-PCR試驗結果用Rotor-GeneTMQ 2.0.2軟件進行分析。由于SNP 位點A和T之間熔解溫度差異△Tm較小(小于0.2 ℃)，為了更好地區(qū)分CPV-2b 和CPV-2c 基因型(T4064A)，HRM-PCR分析完成后，將對照樣本CPV-gd1(CPV-2b)與未知臨床樣品等體積混合形成雜合子后再次運行HRM-PCR。

表1 引物與探針序列Table 1 Primer and probe sequences

圖2 引物及探針設計Fig.2 Primer and probe design

FMCA-PCR反應體系：參照Premix TaqTMKit(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)產品說明書配制反應液，總反應體系為20 μL：TaqPlus Master Mix 10 μL、cpv-F2引物1 μL(0.03 μmol/L)、ab-Rev引物1 μL (0.3 μmol/L)、P2 探針1 μL、CPV-2病毒核酸模板DNA 1 μL、去離子水6 μL。將配制好的反應液置于LightCycler?96 (羅氏，瑞士) 儀器上，F(xiàn)MCA-PCR反應程序：95 ℃ 預變性5 min；95 ℃ 變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃ 延伸15 s，循環(huán)55次；PCR反應結束后37～97 ℃ 以0.1 ℃/s的熔解速率進行熔解曲線分析。

1.4 靈敏度對比分析 利用引物CPV-1270R/1270F構建陽性樣品質粒CPVpf，用NanoDrop 2000 (美國賽默飛世爾科技公司)測定起始濃度，并把質粒樣品梯度稀釋后進行HRM-PCR和FMCA-PCR靈敏度試驗，比較2種熔解曲線基因分型方法的最低檢測限。

1.5 準確性對比分析 為了比較2種熔解曲線基因分型方法的準確性，本試驗對來自不同地區(qū)30份犬糞便棉拭子臨床陽性樣本依次進行HRM-PCR和FMCA-PCR分析，并利用測序引物CPV-1270R/1270F對所有30份陽性樣本進行測序，比較其2種熔解曲線基因分型方法的準確性。

2 結果

2.1 標準質粒樣本不同SNP熔解溫度差異比較 CPV-2病毒3種基因型(CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c)HRM-PCR和FMCA-PCR熔解曲線基因分型結果如圖3、圖4。HRM-PCR方法中CPV-2a標準樣品Tm為(71.40±0.03) ℃，而CPV-2b和CPV-2c標準樣品Tm相對較高，分別為(71.90±0.04) ℃和(71.80±0.03) ℃。由于CPV-2b和CPV-2c基因型之間熔解溫度差異(△Tm)只有0.15 ℃，因此為了更好地區(qū)分以上2個基因型，通過形成雜合子的方法進一步區(qū)分CPV-2b和CPV-2c(圖3B)。FMCA-PCR方法中CPV-2各基因型熔解溫度差異明顯，CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c標準樣品Tm分別為(58.50±0.20) ℃、(51.80±0.10)℃和(48.80±0.12)℃(圖4)。

以上熔解溫度比較結果表明，在HRM-PCR方法中CPV-2a型和CPV-2b型、CPV-2b型和CPV-2c型之間△Tm只有(0.60±0.03)℃和(0.20±0.01) ℃；而在FMCA-PCR方法中CPV-2a型和CPV-2b型、CPV-2b型和CPV-2c型之間△Tm分別為(6.85±0.22)℃和(3.01±0.2) ℃。FMCA-PCR方法不同SNP位點熔解溫度差異遠大于HRM-PCR方法(圖5)。

圖3 HRM-PCR方法CPV-2標準質粒樣品熔解曲線基因分型結果Fig.3 Melting curve genotyping results of CPV-2 standard plasmid samples by HRM-PCRA：雜合前HRM-PCR熔解曲線； B：雜合后HRM-PCR熔解曲線A：HRM-PCR melting curve before ungenerating heteroduplexes； B：HRM-PCR melting curve after generating heteroduplexes

圖4 FMCA-PCR方法CPV-2標準質粒樣品熔解曲線基因分型結果Fig.4 Melting curve genotyping results of CPV-2 standard plasmid samples by FMCA-PCR

圖5 HRM-PCR和FMCA-PCR方法CPV-2不同基因型之間熔解溫度差異對比結果Fig.5 Comparison of melting temperature differences between HRM-PCR and FMCA-PCR for genotyping CPV-2A：HRM-PCR； B：FMCA-PCR 不同小寫字母表示不同基因型之間熔解溫度差異顯著，P<0.05Different lowercase letters mean significant difference between different genotypes,P<0.05

2.2 靈敏度和準確性比較 HRM-PCR和FMCA-PCR熔解曲線基因分型方法最低檢測限分別11.9 copies/μL和1.0 copy/μL(CPV-2標準質粒樣品)。為了對比2種熔解曲線基因分型方法的準確性，本試驗對來自不同地區(qū)的30份犬糞便棉拭子核酸陽性樣本依次進行HRM-PCR和FMCA-PCR熔解曲線基因分型(圖6、7)，并對基因分型結果進行測序驗證。

30份臨床樣本經過HRM-PCR分析(未形成雜合子)后可歸類為19份CPV-2a型、7份CPV-2b型、3份CPV-2b型和1份CPV-2a、CPV-2b混合感染型。CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c 各基因型熔解溫度(Tm)分別為(71.42±0.07)℃、(72.01±0.07) ℃ 和 (71.77±0.03) ℃。樣品CPV-js11(混合感染)的 2個熔解峰Tm分別為(68.78±0.04)℃ 和(71.84±0.00)℃(圖6A)。在HRM-PCR方法中CPV-2a基因型與CPV-2b和CPV-2c基因型之間△Tm較大(大于0.6 ℃)，因此CPV-2a基因型易與其他2個基因型相互鑒別。而CPV-2b 和CPV-2c基因型之間△Tm較小(只有0.15 ℃)，兩者如果直接按照Tm值區(qū)分基因型的話，會影響分型準確性。為了進一步區(qū)分CPV-2b和CPV-2c基因型，在第1次HRM-PCR反應運行結束后7份CPV-2b PCR產物和3份CPV-2c PCR產物中依次加入已知基因型對照樣品(CPV-2b)形成雜合子熔解曲線。雜合子熔解曲線結果顯示，當PCR產物中加入對照樣品CPV-2b時，3份CPV-2c樣品中2份樣品熔解曲線形狀發(fā)生改變(形成2個熔解峰)，而剩余1份樣品和7份CPV-2b樣品熔解曲線形狀未發(fā)生改變(仍然1個熔解峰)，如圖6B。HRM-PCR基因分型結果(形成雜合子后)與測序結果完全一致(表2)。

30份臨床樣本經過FMCA-PCR分析可歸類為19份CPV-2a型、8份CPV-2b型、2份CPV-2b型和1份CPV-2a、CPV-2b混合感染型。CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c 各基因型熔解溫度(Tm)分別為(58.34±0.36)℃、(51.70±0.40) ℃ 和(48.81±0.30)℃。樣品CPV-js11(混合感染)的 2個熔解峰Tm分別為(51.80±0.30)℃ 和(58.50±0.40)℃。FMCA-PCR基因分型結果與測序結果完全一致(表2)。

圖6 HRM-PCR臨床樣本檢測結果Fig.6 Results of HRM-PCR from clinical specimens A：雜合前HRM-PCR熔解曲線； B：雜合后HRM-PCR熔解曲線 A：HRM-PCR melting curve before ungenerating heteroduplexes； B：HRM-PCR melting curve after generating heteroduplexes

3 討論

本試驗比較了2種熔解曲線基因分型技術對不同SNP位點的分型鑒別能力。在本試驗中，2種基因分型方法均通過PCR擴增產物的熔解溫度差異來區(qū)分不同SNP。在FMCA-PCR方法中不同SNP位點之間熔解溫度變化遠大于HRM-PCR方法。引起這一變化的主要原因為2種方法所產生的DNA雙鏈(熔解片段)差異所致。這種差異一方面體現(xiàn)在2種方法中所產生的DNA雙鏈長度各不相同。DNA雙鏈越短，SNP位點之間熔解溫度變化越大[11-12]。在HRM-PCR方法中DNA雙鏈長度即為PCR擴增產物長度52 bp，而在FMCA-PCR方法中由于使用探針序列，DNA雙鏈長度等于探針序列長度即只有27 bp。熔解溫度差異另一方面體現(xiàn)在SNP位點氫鍵數(shù)量變化上。在FMCA-PCR方法中由于使用探針序列，當探針和CPV-2a型完全匹配時產生較高的熔解溫度；當探針和CPV-2b型有1個堿基錯配(氫鍵數(shù)量由3個變?yōu)?個)時導致CPV-2a與CPV-2b型△Tm相差約6 ℃；當CPV-2b與CPV-2c型之間存在1個堿基錯配(2個氫鍵變化)時兩者 △Tm相差約3 ℃；而CPV-2a與CPV-2c型之間同時存在2個堿基錯配(5個氫鍵變化)時導致更大的△Tm變化約9 ℃。在HRM-PCR方法中，CPV-2 VP2基因序列第4 062位點由A變成G時只有1個氫鍵變化，導致了CPV-2a與CPV-2b型PCR擴增產物△Tm相差0.6 ℃。而CPV-2b與CPV-2c型核酸序列第4 064位點由T變成A(未涉及氫鍵數(shù)量變化)，兩者PCR擴增產物△Tm只差約0.15 ℃。雖然HRM-PCR方法中，氫鍵數(shù)量變化較少，導致各個SNP位點熔解溫度差異不明顯(表2)，但該方法通過雜合子熔解曲線峰型變化來提高分型準確率，而FMCA-PCR方法無這一特點。

圖7 FMCA-PCR臨床樣本檢測結果Fig.7 Results of FMCA-PCR from clinical specimens

表2 2種熔解曲線基因分型方法準確性比較Table 2 Comparison of accuracy between HRM-PCR and FMCA-PCR

HRM-PCR和FMCA-PCR方法均能區(qū)分混合感染樣品。然而在HRM-PCR方法中，需要混合標準樣品作為對照才可以區(qū)分混合感染樣品中的每個基因型；但在FMCA-PCR方法中，無需混合標準樣品只需純對照樣品即可。這是由于2種方法所使用熒光物不同導致。HRM-PCR方法使用雙鏈DNA嵌合熒光染料，而FMCA-PCR方法使用序列特異性探針作為熒光物。前者凡是遇到雙鏈DNA即可發(fā)光，而后者只和特異性序列匹配后才可發(fā)熒光。在混合感染樣品PCR擴增產物中同時存在2 種DNA雙鏈，即2個同源DNA雙鏈和2個異源DNA雙鏈。在HRM-PCR混合感染樣品中，2個同源DNA雙鏈構成溫度較高的熔解峰(堿基完全匹配)，而2個異源雙鏈構成溫度較低的熔解峰(有堿基錯配)(圖6A)。在FMCA-PCR混合感染樣品中，探針和目標序列完全匹配形成了較高溫度的熔解峰，探針和目標序列有錯配形成了較低溫度的熔解峰，而溶液中其他DNA雙鏈則不出現(xiàn)熔解峰(圖7)。因此，在檢測混合感染樣品時FMCA-PCR方法只需純對照樣本即可。

HRM-PCR基因分型方法由于使用DNA嵌合熒光染料，無需探針因此檢測成本相對較低。而該方法的缺點為HRM-PCR試驗必須在攜帶HRM分析模塊功能的PCR儀上進行。另外，該方法的檢測通量相對較低，HRM-PCR方法很難在單個PCR管內同時分析多個SNP位點(3個以上)。FMCA-PCR基因分型方法由于使用探針，該方法的檢測通量和靈敏度相對較高，即單個PCR反應管內可同時檢測5種不同顏色探針信號(每個探針檢測3個SNP)，檢測限可達到1 copy/μL。另外，該基因分型方法不受熒光PCR儀器種類限制，任何一種普通熒光定量PCR儀上即可實現(xiàn)FMCA-PCR試驗。而該方法的缺點為由于使用探針其檢測成本較HRM-PCR方法相對要高。

綜上所述，2種基于PCR方法的熔解曲線基因分型技術(HRM-PCR和FMCA-PCR)對CPV-2不同SNP位點均有較高的分型鑒別能力，其中HRM-PCR方法試劑檢測成本低廉、設計簡單，檢測通量較低等特點；而FMCA-PCR方法試劑檢測成本較高、設計較復雜，檢測通量高等特點。本試驗為熔解曲線基因分型技術在獸醫(yī)臨床中的應用提供參考依據(jù)。