林漢卿,溫貴蘭,張喜懿,汪德生,龔新勇,程振濤

(1. 貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,貴州 貴陽(yáng) 550025 ； 2. 思南縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心, 貴州 銅仁 565100 ； 3. 貴州大學(xué)大數(shù)據(jù)學(xué)院,貴州 貴陽(yáng) 550025)

禽白血病(Avian leukosis，AL)是由禽白血病肉瘤病毒群引起的以造血細(xì)胞惡性增生為主要特征的多種腫瘤性疾病的總稱(chēng)[1]。J亞群禽白血病病毒(ALV-J)于1988年在英國(guó)肉雞中被首次分離，是禽白血病11個(gè)病毒亞群中致病力相對(duì)較強(qiáng)、流行范圍相對(duì)較廣的一個(gè)病毒亞群，可引起骨髓細(xì)胞瘤病或骨髓白血病，導(dǎo)致雞群產(chǎn)生免疫抑制、消瘦、產(chǎn)蛋量下降[2-3]。作為禽類(lèi)的三大腫瘤病之一，禽白血病對(duì)家禽的危害不可小覷，尤其是與網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥及馬立克病混合感染時(shí)，三者之間的協(xié)同作用使得毒力增加，破壞力更強(qiáng)，也更加難以控制[4]。禽白血病目前尚無(wú)廣泛應(yīng)用的特效疫苗，因此尋找能有效控制禽白血病的藥物迫在眉睫。

中藥是我國(guó)傳統(tǒng)的醫(yī)療方式，作為天然產(chǎn)物，中藥的毒副作用小，且不易產(chǎn)生耐藥性，有抗病毒、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力等功效，是防治禽類(lèi)疾病的重要手段。黃芪有補(bǔ)氣固表，利尿消腫，托毒生肌，增加免疫功能等功效，是從古至今最常用的中藥之一[5]。本試驗(yàn)以J亞型禽白血病病毒為研究對(duì)象，用熒光定量PCR方法，從細(xì)胞水平探索黃芪對(duì)禽白血病病毒復(fù)制的影響，試驗(yàn)結(jié)果可為禽白血病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及病毒 ALV-J病毒由揚(yáng)州大學(xué)秦愛(ài)建教授惠贈(zèng)；DF-1細(xì)胞由貴州福斯特生物技術(shù)有限公司惠贈(zèng)。

1.2 藥品 中藥黃芪購(gòu)自貴陽(yáng)同濟(jì)大藥堂，前期已用水煎法制成黃芪提取液，并測(cè)得最大安全濃度為62.5 mg/mL。

1.3 試劑 大腸埃希菌DH5α、四季青新生牛血清，均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；RNA提取試劑盒，購(gòu)自北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司；HiFiScript cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購(gòu)自北京康為世紀(jì)有限公司；2×EsTaqMasterMix、pMD-18T、連接酶Solution I、DL2 000 Marker，均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒，購(gòu)自生工生物工程有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)瓶和12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，均購(gòu)自美國(guó)康寧公司；0.25%胰蛋白酶、F12 DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，均購(gòu)自賽默飛世爾(蘇州)儀器有限公司；SYBR Green I熒光定量PCR反應(yīng)試劑盒，購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。

1.4 方法

1.4.1 熒光定量PCR方法的建立

1.4.1.1 引物設(shè)計(jì) 采用Primer Premier 5.0軟件，參照ALV-J原型毒株(基因登錄號(hào):Z45390)的gp37基因序列設(shè)計(jì)1對(duì)熒光定量PCR特異性引物(F：5′-CAAGACGTGGAAGGGATG-3′；R：5′-GCAATGCAAACAGTAGCG-3′)，預(yù)擴(kuò)增長(zhǎng)度為196 bp。18S rRNA內(nèi)參引物(F：5′-GTTCAGCCACCCGAGATTGA-3′；R：5′-CCCATCACGAATGGGGTTCA-3′)為本實(shí)驗(yàn)保存，預(yù)擴(kuò)增長(zhǎng)度為145 bp。

1.4.1.2 重組標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建 將ALV-J接種于生長(zhǎng)良好的DF-1細(xì)胞上，72 h后提取細(xì)胞RNA，以其cDNA為模板，用設(shè)計(jì)的gp37基因熒光引物和18S rRNA內(nèi)參引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系25 μL：cDNA 2 μL，2×EsTaqMasterMix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，鑒定正確后，純化回收并連接到pMD-18T載體上，連接體系：目的片段 4 μL、pMD-18T 1 μL、Solution I 5 μL，于16 ℃連接過(guò)夜。與載體連接好后，將連接體系全部轉(zhuǎn)入大腸埃希菌DH5α中，于氨芐平板上過(guò)夜培養(yǎng)，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，體系同上。鑒定為陽(yáng)性的質(zhì)粒送出測(cè)序，將測(cè)序正確的陽(yáng)性質(zhì)粒分別命名為pMD-T-gp37和pMD-T-18SrRNA。

1.4.1.3gp37與18S rRNA標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建 對(duì)pMD-T-gp37和pMD-T-18SrRNA標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行10倍 倍比稀釋?zhuān)?0-2～10-7共5個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度設(shè)3個(gè)平行，在熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。反應(yīng)體系20 μL：SYBR Green I 熒光定量PCR酶 10 μL，cDNA 2 μL，上下游引物各0.6 μL、ddH2O 6.8 μL。

1.4.2 熒光定量PCR方法檢測(cè)黃芪對(duì)ALV-J轉(zhuǎn)錄水平的影響

1.4.2.1 黃芪對(duì)ALV-J的直接滅活作用 前期已測(cè)得黃芪提取液的最大安全濃度(TC0)為62.5 mg/mL。將ALV-J病毒液和稀釋至最大安全濃度的黃芪提取液按1∶1的比例混合均勻，接種于DF-1細(xì)胞12孔板，接種3孔，每孔1 mL，此3孔為直接滅活組。另設(shè)3孔為病毒對(duì)照組，每孔加1 mL ALV-J病毒液。作用2 h后，用DMEM依次洗凈，換成細(xì)胞維持液，置于37 ℃溫箱培養(yǎng)72 h。同時(shí)設(shè)置3孔只加維持液的細(xì)胞對(duì)照組。72 h后提取各孔R(shí)NA進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。

1.4.2.2 黃芪對(duì)ALV-J的預(yù)防作用 設(shè)置3孔作預(yù)防組，先用稀釋好的黃芪提取液作用于單層DF-1細(xì)胞，1 h后棄掉，用DMEM洗凈，換成同體積的ALV-J病毒液，作用1 h后洗凈，換成細(xì)胞維持液。同樣設(shè)置3孔只加ALV-J病毒液的病毒對(duì)照組，作用2 h后換成細(xì)胞維持液。同樣設(shè)置3孔細(xì)胞對(duì)照組。37 ℃培養(yǎng)72 h后提取RNA進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.2.3 黃芪對(duì)ALV-J的治療作用 設(shè)置3孔做治療組，先用ALV-J病毒液攻擊細(xì)胞，1 h后棄掉并洗凈，換成同體積的黃芪提取液，作用1 h后洗凈，換成細(xì)胞維持液。同樣設(shè)置病毒對(duì)照組和細(xì)胞對(duì)照組，72 h后提取RNA進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。

1.4.3 統(tǒng)計(jì)分析 將熒光PCR檢測(cè)結(jié)果導(dǎo)出，用SPSS軟件進(jìn)行分析差異。以細(xì)胞對(duì)照組作參照，通過(guò)2-ΔΔCt方法分別計(jì)算出病毒對(duì)照組與直接滅活組、預(yù)防組及治療組之間gp37基因轉(zhuǎn)錄水平的差異。

2 結(jié)果

2.1 熒光定量PCR方法的建立

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建 以接種ALV-J的DF-1細(xì)胞cDNA為模板，用設(shè)計(jì)的2對(duì)熒光引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)圖1，分別擴(kuò)增出了196 bp和145 bp左右的特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果一致。將PCR產(chǎn)物連接轉(zhuǎn)化后送出測(cè)序，序列比對(duì)結(jié)果也與預(yù)期一致。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 以pMD-T-gp37和pMD-T-18SrRNA為標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖2所示：2個(gè)質(zhì)粒的熔解曲線均為單一峰型，所設(shè)引物的特異性較強(qiáng)；pMD-T-gp37標(biāo)準(zhǔn)曲線E=102.0%，R2= 0.999，pMD-T-18SrRNA標(biāo)準(zhǔn)曲線E=98.6%，R2=0.996，2對(duì)引物的擴(kuò)增效率符合要求。綜合分析，本試驗(yàn)所建熒光定量PCR方法具有一定的特異性，可用于下一步試驗(yàn)。

圖1 gp37基因(A)與18S rRNA(B) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoresis of PCR amplified products of gp37 gene (A) and 18S rRNA (B)M： DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量(DL2 000); 1、2: 細(xì)胞上清cDNAM: DNA Marker DL2 000; 1,2: Cell supernatant cDNA

圖2 18S rRNA和gp37基因的擴(kuò)增曲線(A、B)、熔解曲線(C、D)和標(biāo)準(zhǔn)曲線(E、F)Fig.2 Amplification curves (A,B),melting curves (C,D) and standard curves (E,F) of 18S rRNA and gp37 gene

2.2 黃芪對(duì)ALV-J轉(zhuǎn)錄水平的影響

2.2.1 黃芪對(duì)ALV的直接滅活作用 用2-ΔΔCt方法計(jì)算各組間gp37基因轉(zhuǎn)錄水平的差異，結(jié)果見(jiàn)圖3，直接滅活組的gp37基因表達(dá)量顯著低于病毒對(duì)照組(P<0.05)，與細(xì)胞對(duì)照組無(wú)顯差異(P>0.05)。

圖3 黃芪對(duì)ALV-J的直接滅活作用Fig.3 Direct inactivation effect of Astragalus on ALV-J不同小寫(xiě)字母表示組間差異顯著，P<0.05;下圖同Different lowercase letters mean significant difference among groups,P<0.05.The same as below

2.2.2 黃芪對(duì)ALV的預(yù)防作用 結(jié)果見(jiàn)圖4，預(yù)防組gp37基因的表達(dá)顯著低于病毒對(duì)照組(P<0.05)，與細(xì)胞對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。

圖4 黃芪對(duì)ALV-J的預(yù)防作用Fig.4 Preventive effect of Astragalus on ALV-J

2.2.3 黃芪對(duì)ALV的治療作用 先接種ALV-J病毒，再用黃芪治療，結(jié)果如圖5顯示，治療組gp37基因的表達(dá)量顯著低于病毒對(duì)照組(P<0.05)。相比直接滅活組和預(yù)防組，治療組與細(xì)胞對(duì)照組的差異較大。

圖5 黃芪對(duì)ALV-J的治療作用Fig.5 Therapeutic effect of Astragalus on ALV-J

3 討論

由于ALV-J不能導(dǎo)致細(xì)胞病變，需借助熒光定量PCR等方法觀察病毒的生長(zhǎng)、繁殖情況，故本試驗(yàn)首先建立了ALV-J的熒光定量PCR檢測(cè)方法，便于后續(xù)研究。ALV為單股正鏈RNA，其編碼區(qū)主要有g(shù)ag、pol和env三個(gè)結(jié)構(gòu)基因。gag和pol基因保守性強(qiáng)，各亞群間的同源性在96%～98%，而ALV-J的env基因與其他亞群的同源性僅有40%左右，因此針對(duì)ALV-J的研究，常選擇env基因作為研究對(duì)象。env蛋白由表面糖蛋白亞單位gp85(SU)和跨膜糖蛋白亞單位gp37(TM)組成[6]。gp85基因常被用來(lái)鑒定ALV亞群，但因其具有高度的變異性，故不適宜用作設(shè)計(jì)熒光引物。gp37蛋白在病毒與細(xì)胞的融合中起到了非常關(guān)鍵的作用，當(dāng)表面蛋白gp85與宿主細(xì)胞結(jié)合后，gp37的構(gòu)象會(huì)發(fā)生改變，同時(shí)暴露出融合肽，融合肽作用于細(xì)胞膜，促成病毒粒子與細(xì)胞的融合[7-8]。gp37蛋白內(nèi)部存在許多高度保守的序列，這些序列可能是抗病毒的重要靶點(diǎn)[9]。本試驗(yàn)以ALV-J標(biāo)準(zhǔn)毒株ADOL-7501的gp37基因序列為參照，設(shè)計(jì)了1對(duì)熒光定量PCR引物，經(jīng)驗(yàn)證其特異性較強(qiáng)，擴(kuò)增效率較高，可廣泛應(yīng)用于ALV-J的研究。

黃芪又稱(chēng)綿芪，味甘性溫，有補(bǔ)氣升陽(yáng)、托毒排膿、利水消腫、斂汗固脫、托瘡生肌的功效，被稱(chēng)為“補(bǔ)藥之長(zhǎng)”[10]。黃芪的主要成分為黃芪皂苷、黃芪多糖及黃酮類(lèi)化合物，還含有氨基酸和硒、錳、鋅、銅、鐵、鈣等微量元素[11]。已有大量研究證明，黃芪在抗病毒、抗腫瘤方面有明顯作用，其作用機(jī)制可能包括抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、減少自由基生成、逆轉(zhuǎn)耐藥性等[12-13]。本試驗(yàn)分預(yù)防、治療、直接滅活3個(gè)組，將ALV-J和黃芪藥液先后或同時(shí)作用于DF-1細(xì)胞，用熒光定量PCR方法檢測(cè)ALV-J的轉(zhuǎn)錄情況，發(fā)現(xiàn)黃芪能明顯下調(diào)ALV-J的gp37基因的表達(dá)。3個(gè)組相比，預(yù)防組與細(xì)胞對(duì)照組差異最小，直接滅活組次之，治療組差異最大，提示黃芪用于預(yù)防時(shí)效果最好，用于治療時(shí)效果相對(duì)較差。試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證明了黃芪的抗腫瘤作用，說(shuō)明黃芪對(duì)禽白血病病毒復(fù)制有明顯影響，但產(chǎn)生作用的具體成分以及黃芪在動(dòng)物水平抗ALV-J的效果仍有待研究。