栗利芳,劉新月,張 蕾,董春娜,肖 進,汪 明,郭 鑫

(1. 中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院,北京 海淀 100193 ； 2. 中牧實業(yè)股份有限公司 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用生物制品 與化藥重點實驗室 北京市獸用多肽疫苗設計與制備工程技術中心,北京 海淀 100095)

豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是一種嚴重危害養(yǎng)豬生產(chǎn)的重要病原，與豬圓環(huán)病毒相關疾病(Porcine circovirus associated diseases，PCVAD)的發(fā)生密切相關，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[1]。伴隨著我國養(yǎng)豬業(yè)受到PCV2的危害日益嚴重，研制更好的PCV2血清抗體檢測方法的需求也變得越來越迫切。目前，PCV2抗體的血清學檢測方法較多，其中ELISA方法因其方便快捷和能大規(guī)模檢測，較為常用[2]。近年來，隨著表位研究的不斷深入，合成肽除了用作圓環(huán)病毒表位疫苗的研究，還應用于ELISA反應中包被抗原的篩選。研究表明在PCV2 Cap蛋白上含有多個主要抗原表位，具有良好的免疫原性和反應原性，是檢測該種病毒抗體的理想靶位[3]。本試驗在表位研究的基礎上，建立了基于合成肽包被抗原的用于檢測豬圓環(huán)病毒2型抗體的間接ELISA檢測方法，該方法可以作為臨床PCV2血清抗體檢測及作為疫苗免疫效果評價的技術手段。

1 材料與方法

1.1 合成肽抗原 0701、0702、0703、0704、0705、0706、0707、0708，從PCV2 Cap蛋白表位篩選，由中牧實業(yè)股份有限公司研究院制備。

1.2 主要試劑及設備 兔抗豬IgG酶標二抗，購自Sigma公司；其他ELISA相關試劑，均購自Amresco公司； PCV2 Cap蛋白包被試劑盒，由南京農(nóng)業(yè)大學友情饋贈；豬圓環(huán)病毒2-dCap-ELISA抗體檢測試劑盒(銳捷)，購自保定瑞普生物藥業(yè)有限公司。酶標儀，美國 Bio-Rad公司；全自動多肽合成儀PSI300，購自美國多肽科技有限公司。

1.3 試驗用血清 用于包被抗原篩選的120份PCV2陽性血清，由中牧實業(yè)股份有限公司蘭州生物藥廠提供；豬圓環(huán)陰、陽性對照血清，50份豬圓環(huán)病毒感染豬血清，50份豬圓環(huán)疫苗免疫血清，30份豬圓環(huán)抗體陰性血清，由中牧實業(yè)股份有限公司蘭州生物藥廠提供；豬瘟病毒(CSFV)陽性血清、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)陽性血清和豬偽狂犬病毒(PRV)陽性血清，均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；豬口蹄疫O型病毒(FMDV)陽性血清、豬口蹄疫A型病毒陽性血清和130份臨床豬血清，由中牧實業(yè)股份有限公司蘭州生物藥廠提供。

1.4 試驗方法

1.4.1 合成肽包被抗原的設計、合成與篩選 通過分析PCV2 Cap蛋白表位，結合文獻報道及軟件預測，對PCV2 Cap蛋白上的抗原表位進行篩選，用化學合成方法分段合成，獲得8條合成肽抗原0701、0702、0703、0704、0705、0706、0707、0708。用化學方法對這些抗原表位肽段合成，作為包被抗原，相應PCV2陽性血清為一抗，HRP標記的兔抗豬IgG作為二抗，參照常規(guī)間接 ELISA 方法對潛在表位進行篩選鑒定，篩選出反應最強的候選肽段，并通過對120份臨床血清進行檢測進一步確定包被抗原。

1.4.2 最佳抗原包被濃度和血清稀釋倍數(shù)的測定 采用棋盤法來篩選。將合成肽抗原用包被液(0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液，pH=9.6)分別稀釋至每條肽濃度為8、4、2、1、0.5 μg/mL和0.25 μg/mL；分別加入1∶50、1∶100、1∶200、1∶400和1∶800稀釋的陽性血清，比較P/N值。以陽性血清OD450值達到并接近1.0，且P/N值最大的孔所在的抗原濃度和稀釋倍數(shù)為最佳抗原包被濃度和血清稀釋倍數(shù)。

1.4.3 最佳封閉液的篩選 酶標板按選擇的條件包被后，分別用0.5%、1%和1.5%BSA的 PBST(0.01 mol/L，pH=7.2)進行2 h封閉試驗，選擇P/N值最大孔為最適封閉條件。

1.4.4 待檢血清作用時間的篩選 酶標板按選擇的條件包被、封閉后，加入陰陽性血清，37 ℃分別作用0.5、1、1.5 h和2 h，進行ELISA測定，選擇合適的血清作用時間。

1.4.5 酶標抗體工作濃度的篩選 陰陽性血清按1.4.4確定的時間作用后，將酶標抗體進行1∶3 000、1∶5 000、 1∶10 000 和1∶20 000稀釋，100 μL/孔進行ELISA測定，選擇合適的酶標抗體工作濃度。

1.4.6 酶標抗體作用時間的篩選 將酶標抗體按確定好的稀釋倍數(shù)加入酶標板后，37 ℃分別作用0.5、1 h和1.5 h，進行ELISA測定，選擇合適的酶標抗體作用時間。

1.4.7 底物反應時間的確定 加入底物后在37 ℃分別反應10、15 min和20 min，選擇最佳底物反應時間。

1.4.9 敏感性試驗 采用已建立的ELISA方法對50份豬圓環(huán)感染豬血清和50份豬圓環(huán)疫苗免疫血清進行檢測，確定該方法的敏感性。

1.4.10 特異性試驗 采用已建立的ELISA方法，分別檢測CSFV、FMDV、PRV、PRRSV及30份PCV2抗體陰性血清，確定該方法的特異性。

1.4.11 重復性試驗 選取PCV2陰性血清、陽性血清各5份，用3個批次的合成肽抗原包被板按照上述篩選方法進行ELISA檢測，另外采用同一批次不同包被板，進行ELISA檢測，分別計算批間變異系數(shù)和批內(nèi)變異系數(shù)，分析該方法的重復性。

1.4.12 符合率試驗 分別用PCV2 Cap蛋白包被試劑盒、豬圓環(huán)病毒2-dCap-ELISA抗體檢測試劑盒(銳捷)和本試驗建立的方法，檢測130份臨床血清，計算本方法與這2種檢測方法的符合率。

2 結果

2.1 合成肽包被抗原的設計、合成與篩選 通過分析PCV2 Cap蛋白表位，結合文獻報道及軟件預測，對PCV2 Cap蛋白上的抗原表位進行篩選，用化學合成方法分段合成，獲得合成肽抗原，見表1。

表1 豬圓環(huán)病毒2型候選合成肽包被抗原Table 1 Candidate synthetic peptide coat antigens of PCV2

2.1.1 合成肽包被抗原的篩選 分別以合成肽抗原(0701、0702、0703、0704、0705、0706、0707、0708)作為包被抗原，PCV2陽性血清和陰性血清作為一抗，對潛在表位進行篩選鑒定。結果顯示，0701、0703、0706、0708作為包被抗原P/N值較高。因而確定0701、0703、0706、0708合成肽抗原為豬圓環(huán)病毒2型ELISA抗體檢測包被抗原。結果見圖1。

2.1.2 合成肽包被抗原的評價 將0701、0703、0706、0708以單條肽和4條肽混合肽(每條肽濃度均為1 μg/mL)，作為包被抗原，分別對120份臨床血清進行檢測。0701、0703、0706、0708單條肽和4條肽混合肽作為包被抗原對120份臨床血清的陽性檢出率分別為39.2%、37.5%、40.0%、38.3%和46.7%，表明以混合肽作為包被抗原對臨床血清的陽性檢出率高于單條肽作為包被抗原的陽性檢出率，因此選擇4條肽的混合肽作為包被抗原。結果見表2。

圖1 候選合成肽包被抗原的篩選Fig.1 Screening results of candidate synthetic peptide coating antigens標記不同的字母表示差異顯著(P<0.05); 下同Marking different letters indicated significant differences (P<0.05). The same as below

表2 單條肽和混合肽作為包被抗原對120份臨床血清的檢測結果Table 2 Test results of 120 clinical sera with single peptide and mixed peptide as coating antigens

2.2 最佳抗原包被濃度和血清稀釋倍數(shù)的測定 試驗結果顯示，當抗原包被濃度為每條肽2 μg/mL，血清稀釋度為1∶200時，陽性血清OD值大于并接近1.0，P/N值最大。從而確定抗原最佳包被濃度為每條肽2 μg/mL，血清最佳稀釋度為1∶200。結果見表3。

2.3 最佳封閉液的篩選 分別用含0.5%、1%和1.5%BSA的 PBST(0.01 mol/L，pH=7.2)封閉2 h， 顯示用1.5%BSA封閉的P/N值最高，效果最好。結果見圖2。

2.4 待檢血清作用時間的篩選 陰陽性血清分別反應0.5、1、1.5 h和2 h，顯示當陽性血清作用1 h時，P/N值最高，因此優(yōu)選1 h作為待檢血清作用時間。結果見圖3。

表3 最佳抗原包被濃度和血清稀釋度的確定(P/N比值)Table 3 Determination of optimal concentration of coating antigen and serum dilution(P/N value)

圖2 最佳封閉條件的篩選Fig.2 Screening of optimal sealing conditions

圖3 待檢血清反應時間的篩選Fig.3 Screening of optimal reaction time for test serum

2.5 酶標抗體工作濃度的篩選 酶標抗體按1∶3 000、 1∶5 000、1∶10 000 和1∶20 000倍稀釋，進行ELISA反應，結果顯示當酶標抗體1∶10 000稀釋時，P/N值最高。結果見圖4。

2.6 酶標抗體作用時間的篩選 酶標抗體按1∶10 000 稀釋加入酶標板，37 ℃分別作用0.5、1 h和1.5 h，顯示當酶標抗體作用1 h時，P/N值最高。結果見圖5。

2.7 底物反應時間的確定 加入底物后在37 ℃分別顯色10、15 min和20 min，進行ELISA測定，顯示當?shù)孜镲@色15 min時，P/N值最高。結果見圖6。

圖4 酶標抗體工作濃度的篩選Fig.4 Screening of optimal working concentration of enzyme labeled antibody

圖5 酶標抗體作用時間的篩選Fig.5 Screening of optimal action time of enzyme labeled antibody

圖6 底物作用時間的篩選Fig.6 Screening of optimal substrate reaction time

2.9 敏感性試驗 用50份豬圓環(huán)感染豬血清和50份豬圓環(huán)疫苗免疫血清，采用本試驗建立的方法進行檢測，結果95份檢測為陽性，5份檢測為陰性，計算敏感性為95.0%(95/100)。結果見表4。

表4 敏感性試驗結果Table 4 Results of sensitivity test

2.10 特異性試驗 用該方法分別檢測30份豬圓環(huán)抗體陰性血清，僅有1份顯示陽性；而對CSFV、FMDV、PRV、PRRSV陽性血清檢測均顯示陰性，計算特異性為97.5%(39/40)。結果見表5。

表5 特異性試驗結果Table 5 Results of specificity test

2.11 重復性試驗 將選取的10份豬血清分別進行批內(nèi)和批間重復性檢測，結果顯示批內(nèi)變異系數(shù)為3.4%～7.2%，批間變異系數(shù)為4.8%～8.6%，表明該方法重復性和穩(wěn)定性較好。結果見表6。

表6 重復性試驗結果Table 6 Results of repeatability test

2.12 符合率試驗 分別用PCV2 Cap蛋白包被試劑盒(PCV2-Cap-ELISA)、豬圓環(huán)病毒2-dCap-ELISA抗體檢測試劑盒(銳捷)和本試驗建立的方法，檢測130份臨床血清，計算本方法與這2種試劑盒的符合率。本方法檢測130份臨床血清，結果可見112份為陽性，18份為陰性；PCV2-Cap-ELISA方法檢出陽性108份，陰性21份；PCV2-dCap-ELISA抗體檢測試劑盒(銳捷)檢出陽性為115份，陰性為15份。本方法和PCV2-Cap-ELISA方法符合率為91.5%，和PCV2-dCap-ELISA抗體檢測試劑盒(銳捷)符合率為94.6%。結果見表7。

表7 間接ELISA與其他試劑盒比對試驗結果Table 7 Comparsion between indirect ELISA and other kits

3 討論

PCV2的抗體檢測在PCV2流行病學調(diào)查、陰性仔豬篩選、疫苗免疫效果評價等多方面均有較為重要的作用。目前針對PCV2的抗體檢測方法主要有病毒中和試驗(SN)、間接免疫熒光試驗(IFA)、免疫過氧化物酶單層細胞試驗(IPMA)和酶聯(lián)免疫吸附試驗，前三者均需要感染性病毒，在制備過程中存在散毒危險，同時難以滿足自動化、高通量檢測需求，且在結果判定方面還存在一定的主觀因素，因此推廣和使用均受到限制[4]。而ELISA方法操作簡單，特異性好，敏感性高，能快速檢測大量的樣品，因此仍是現(xiàn)階段臨床最主要的檢測方法。

Cap蛋白是PCV2的主要結構蛋白，由PCV2ORF2編碼，表達的PCV2 Cap蛋白常用于基因工程疫苗的研究和診斷抗原的使用[5]。國內(nèi)目前批準的商品化豬圓環(huán)病毒2-dCap-ELISA抗體檢測試劑盒(銳捷)也是采用Cap蛋白包被抗原，市場使用效果較好。最近的對于PCV3間接ELISA抗體檢測方法的研究也采用了Cap蛋白作為包被抗原[6]，可見現(xiàn)有圓環(huán)病毒ELISA抗體檢測基本還局限于包被Cap蛋白的方法。但也有研究者認為，基因工程表達的Cap蛋白受純化技術等限制原因，無法去除雜蛋白干擾，容易造成假陽性。曹晶晶等以5H7酶標鼠單抗為基礎，建立了PCV2 Cap蛋白的阻斷ELISA抗體檢測方法,特異性更好，能更準確的反應血清抗體水平[7]。本試驗中所采用的合成肽是針對特定抗原位點設計合成，與相應抗體的結合力強，以此為包被抗原建立的ELISA抗體檢測方法敏感性、特異性更高，能更好避免傳統(tǒng)試劑盒的缺陷。近年合成肽作為包被抗原也成功應用在口蹄疫ELISA抗體檢測上，所建立的豬、?？谔阋逴型VP1合成肽ELISA抗體檢測方法已進入市場并廣泛應用[8-9]。

研究表明，在PCV2 Cap蛋白上含有多個抗原表位，如92～103 aa、156～162 aa、175～192 aa、195～201 aa和231～233 aa等都是高免疫原性的表位[10]。劉博奇等選取PCV2 Cap蛋白的65～87 aa、113～146 aa、158～183 aa、194～207 aa等表位，化學合成制備疫苗取得顯著的免疫效果[11]。本試驗通過對國內(nèi)豬圓環(huán)病毒2型流行毒株的序列測定并結合豬圓環(huán)疫苗毒株序列，結合計算機輔助進行豬圓環(huán)抗原位點的分析預測，對可能的抗原位點肽段進行化學合成。進而，通過血清學試驗對這些候選多肽抗原進行篩選，得到免疫原性較高的肽段。將這些肽段作為包被抗原建立ELISA抗體檢測方法。通過120份PCV2陽性血清篩選，選取出4條肽混合作為包被抗原。進一步試驗可見本方法敏感性為95.0%，特異性為97.5%，重復性穩(wěn)定性好。另外目前豬圓環(huán)病毒2型阻斷ELISA抗體檢測方法是豬圓環(huán)ELISA抗體檢測的標準方法，標準編號：GB/T 35910—2018[12]，但這一試劑盒暫未商品化。而豬圓環(huán)病毒2-dCap-ELISA抗體檢測試劑盒(銳捷)是經(jīng)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部批準的商品化試劑盒，市場應用效果較好。此外，另一個檢測方法中的PCV2 Cap蛋白與標準方法中的Cap蛋白是同一蛋白，因此本方法選取這2個方法進行符合率試驗。經(jīng)試驗比對，本方法與Cap-ELISA方法符合率為91.5%，與豬圓環(huán)病毒2-dCap-ELISA抗體檢測試劑盒(銳捷)符合率為94.6%，符合檢測要求，可用于豬PCV2 ELISA抗體檢測。本試驗方法的建立為PCV2抗體檢測提供了一種新方法，也為進一步研發(fā)相應試劑盒提供了科學依據(jù)。同時也應看到，目前豬圓環(huán)病毒相關ELISA抗體檢測試劑盒還不能有效對自然感染和疫苗免疫進行鑒別。有研究者對這一問題進行了研究，陳清清等以大腸桿菌表達的PCV2 Rep蛋白為包被抗原，建立PCV2 Rep抗體檢測的間接ELISA方法，能檢測出PCV2全病毒疫苗免疫以及接種PCV2活毒的豬血清中的Rep抗體，而不能與PCV2亞單位疫苗免疫豬血清中的抗體發(fā)生免疫結合反應，血清學交叉試驗顯示Rep-ELISA具有良好的特異性，能有效鑒別自然感染或全病毒滅活疫苗免疫豬與亞單位疫苗免疫豬[13]。因此PCV2 診斷檢測的下一個方向可以是對感染PCV2病毒和疫苗免疫進行鑒別診斷，為豬場凈化PCV2提供支持。