吳遠(yuǎn)波 劉宇政 吳 靚 吳克勤 冷紅文 焦 濤 張 鴻*

1.江西省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，江西 南昌 330006；2.遼寧省丹東市市場(chǎng)監(jiān)管事務(wù)服務(wù)中心藥檢部，遼寧 丹東 118002

中藥配方顆粒既繼承了傳統(tǒng)湯劑的優(yōu)點(diǎn)，又具有服用方便、易于貯藏、質(zhì)量穩(wěn)定、便于調(diào)劑等優(yōu)勢(shì)[1]，被廣泛關(guān)注，也越來(lái)越多地被醫(yī)生和患者接受。然而，中藥配方顆粒與傳統(tǒng)中藥飲片湯劑在臨床應(yīng)用中是否等效備受爭(zhēng)議[2-3]，且尚無(wú)統(tǒng)一的制備工藝和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[4-5]，仍需進(jìn)一步規(guī)范和完善。為解決中藥配方顆粒發(fā)展面臨的問(wèn)題，2021年1月，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局在征求意見(jiàn)稿的基礎(chǔ)上正式發(fā)布《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》 (以下簡(jiǎn)稱《技術(shù)要求》)，提出標(biāo)準(zhǔn)湯劑為衡量單味中藥配方顆粒是否與其相對(duì)應(yīng)的單味中藥飲片臨床湯劑基本一致的物質(zhì)基準(zhǔn)，并提出中藥配方顆粒的所有藥學(xué)研究均須與標(biāo)準(zhǔn)湯劑進(jìn)行對(duì)比[6-7]。

覆盆子為薔薇科植物華東覆盆子RubuschingiiHu的干燥果實(shí)，夏初果實(shí)由綠變綠黃時(shí)采收，為常用中藥，具有益腎固精縮尿、養(yǎng)肝明目的功效，用于遺精滑精，遺尿尿頻，陽(yáng)痿早泄，目暗昏花[8]。覆盆子含有萜類、黃酮、甾體類、香豆素和酚酸等活性化合物[9-14]，具有抗腫瘤、降血糖血脂、抗氧化、抗衰老等作用[15-20]。研究選用主產(chǎn)區(qū)、且符合藥典要求的12批覆盆子飲片制備標(biāo)準(zhǔn)湯劑，以鞣花酸為指標(biāo)成分，對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算出膏率和鞣花酸轉(zhuǎn)移率范圍，并對(duì)標(biāo)準(zhǔn)湯劑進(jìn)行HPLC指紋圖譜研究，為覆盆子飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的作為物質(zhì)基準(zhǔn)的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Thermo Scientific UltiMate 3000高效液相色譜儀(包括四元梯度泵，WPS-3000SL自動(dòng)進(jìn)樣器，TCC-3000RS柱溫箱，DAD-3000檢測(cè)器，ThermoFisher公司)；LGJ-10冷凍干燥機(jī)(四環(huán)福瑞科儀科技發(fā)展有限公司)；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)； EX125ZH電子天平(奧豪斯儀器有限公司，感量0.01mg)；FR124CN電子天平(奧豪斯儀器有限公司，感量0.1mg)；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；KQ-500E超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；DKM610C干燥箱(重慶雅馬拓科技有限公司)；DK-98-ⅡA電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.2 試藥 鞣花酸對(duì)照品(批號(hào)：wkq19010702，含量以99.8%計(jì))、椴樹苷(批號(hào)：wkq18122702，含量以98.0%計(jì))均購(gòu)自四川省維克奇生物科技有限公司。山柰酚-3-O-蕓香糖苷對(duì)照品(批號(hào)：S-065-180314，含量以99.3%計(jì))購(gòu)自成都瑞芬思生物科技有限公司。乙腈、甲醇為色譜純，水為娃哈哈純凈水，甲醇、乙醇、磷酸等其他試劑均為分析純。

12批不同來(lái)源覆盆子藥材，經(jīng)丹東市市場(chǎng)監(jiān)管事務(wù)服務(wù)中心藥檢部焦?jié)鞴苤兴帋熻b定為薔薇科植物華東覆盆子Rubus chingii Hu的干燥果實(shí)，覆盆子信息見(jiàn)表1。

表1 12批覆盆子來(lái)源信息表

2 方法與結(jié)果

2.1 覆盆子飲片的檢測(cè) 取覆盆子飲片按《中國(guó)藥典》2015年版一部“覆盆子”飲片項(xiàng)下[21]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果符合藥典規(guī)定。

2.2 覆盆子飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備 取覆盆子飲片，敲破，稱取100.0 g，加水煎煮二次，第一次加800 mL水，浸泡30 min，煎煮30 min，趁熱用200 目不銹鋼篩網(wǎng)濾過(guò)，濾液應(yīng)迅速冷卻，第二次加600 mL水，煎煮20 min，趁熱用200 目不銹鋼篩網(wǎng)濾過(guò)，濾液迅速冷卻，合并兩次的藥液。將藥液采用減壓濃縮的方法進(jìn)行低溫濃縮，控制濃縮溫度不超過(guò)50 ℃，將水煎濾液體積濃縮至約 200 mL(0.5 g生藥/mL)。將濃縮液放置到冷凍干燥機(jī)的干燥盤中，再放置到冷凍干燥機(jī)上進(jìn)行冷凍干燥，得標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品。測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品的水分，并計(jì)算出膏率。標(biāo)準(zhǔn)湯劑的樣品信息見(jiàn)表2。

表2 覆盆子標(biāo)準(zhǔn)湯劑水分、出膏率的考察

2.3 覆盆子標(biāo)準(zhǔn)湯劑鞣花酸含量測(cè)定 《中國(guó)藥典》2020年版一部“覆盆子”項(xiàng)下將鞣花酸作為含量測(cè)定項(xiàng)的控制指標(biāo)，規(guī)定覆盆子飲片含量不得少于0.20%[8]，本文選擇鞣花酸為覆盆子標(biāo)準(zhǔn)湯劑含量測(cè)定的指標(biāo)成分。

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Capcell Pak C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸溶液(15∶85)；檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm；柱溫為 30 ℃；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL。該色譜條件下，供試品溶液鞣花酸峰分離良好。如圖1所示。

1.鞣花酸圖1 鞣花酸對(duì)照品(A)、覆盆子標(biāo)準(zhǔn)湯劑(B)HPLC圖

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 取鞣花酸對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并制成含鞣花酸 4.97 μg/mL 的對(duì)照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備 取覆盆子標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉適量，置碾缽中研細(xì)，取約0.15 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，將錐形瓶密塞，稱定重量，超聲處理(功率 500 W，頻率40 KHz)30 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取鞣花酸對(duì)照品溶液(49.68 μg/mL)0.2、0.4、1、1.6、2、4 mL，置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度線，搖勻，即得系列濃度的對(duì)照品溶液。按“2.3.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，分別進(jìn)樣10 μL，記錄鞣花酸的峰面積。以對(duì)照品的進(jìn)樣量(X，μg)為橫坐標(biāo)，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得線性回歸方程：Y=1.6562X+0.2975(r=0.9994)。結(jié)果表明，鞣花酸的進(jìn)樣量在0.009936～0.1987 μg范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關(guān)系。

2.3.5 儀器精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.3.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液10 μL，按“2.3.1”項(xiàng)下的色譜條件，連續(xù)進(jìn)行6 次的進(jìn)樣測(cè)定，記錄鞣花酸的峰面積。按峰面積計(jì)算，鞣花酸的RSD為0.9%。結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.3.6 重復(fù)性 取同一批樣品(批號(hào)：1912004)，按“2.3.3”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液6 份，按“2.3.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄鞣花酸的峰面積，計(jì)算待測(cè)目標(biāo)成分的含量。結(jié)果鞣花酸的平均含量為1.12%，RSD為1.2%，表明該含量測(cè)定方法的重復(fù)性良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取覆盆子標(biāo)準(zhǔn)湯劑同一份供試品溶液，分別在制備后0、2、4、8、12、24 h，按“2.3.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣10 μL，記錄鞣花酸的峰面積，考察樣品溶液的穩(wěn)定性。計(jì)算得鞣花酸峰面積的RSD為1.0%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的樣品(批號(hào)：1912004)適量，研細(xì)，取6份，每份約0.075 g，精密稱定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)湯劑中鞣花酸的含量按1∶1的比例添加鞣花酸對(duì)照品，按“2.3.3”項(xiàng)下的方法制備，按“2.3.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，計(jì)算得鞣花酸平均回收率為97.9%，RSD為1.5%。結(jié)果表明本法具有良好的回收率。

2.3.9 樣品測(cè)定 取覆盆子標(biāo)準(zhǔn)湯劑12批樣品，置碾缽中研細(xì)，取約0.15 g，精密稱定，按“2.3.3”項(xiàng)下的方法制備，按“2.3.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，記錄鞣花酸峰面積，計(jì)算12批覆盆子飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑中鞣花酸的含量，并計(jì)算含量轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 覆盆子標(biāo)準(zhǔn)湯劑鞣花酸含量及轉(zhuǎn)移率

2.4 覆盆子標(biāo)準(zhǔn)湯劑HPLC指紋圖譜測(cè)定

2.4.1 色譜條件 色譜柱為Capcell Pak C18(4.6mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈(A)-0.2%磷酸(B)，梯度洗脫(0～10 min，10%A；10～25 min，10%～15%A；25～40 min，15～20% A；40～55 min，20%～45% A；55～60 min，45% A；60～61 min，45%～10% A；61～73 min，10% A)；檢測(cè)波長(zhǎng)為340 nm；柱溫為35 ℃；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為5 μL。混合對(duì)照品與標(biāo)準(zhǔn)湯劑色譜圖見(jiàn)圖2。

5.鞣花酸；6.山柰酚-3-O-蕓香糖苷；8.椴樹苷?qǐng)D2 混合對(duì)照品(A)、覆盆子標(biāo)準(zhǔn)湯劑(B)HPLC圖

經(jīng)查閱文獻(xiàn)[8,22]，并對(duì)比對(duì)照品色譜圖，判別5、6、8號(hào)峰分別為鞣花酸、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、椴樹苷。其中鞣花酸峰含量高、穩(wěn)定性較好、分離度較好，且《中國(guó)藥典》2020年版一部“覆盆子”項(xiàng)下鞣花酸為其含量測(cè)定項(xiàng)的控制指標(biāo)，故選擇鞣花酸峰為參照峰(S)[23]，計(jì)算覆盆子標(biāo)準(zhǔn)湯劑中主要共有峰的相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積。

2.4.2 對(duì)照品溶液的制備 取鞣花酸對(duì)照品、山柰酚-3-O-蕓香糖苷對(duì)照品、椴樹苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并制成含鞣花酸84.79 μg/mL、山柰酚-3-O-蕓香糖苷32.58 μg/mL、椴樹苷7.74 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.4.3 供試品溶液的制備 取覆盆子標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉適量，置碾缽中研細(xì)，取約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇25 mL，將錐形瓶密塞，稱定重量，超聲處理(功率500 W，頻率40 KHz)30 min，放冷，再稱定重量，用50%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.4.4 儀器精密度試驗(yàn) 精密吸取覆盆子標(biāo)準(zhǔn)湯劑同一份供試品溶液5 μL，按“2.4.1”項(xiàng)下的色譜條件，連續(xù)進(jìn)行6 次的進(jìn)樣測(cè)定，記錄液相色譜圖，以鞣花酸峰為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD。結(jié)果顯示相對(duì)保留時(shí)間RSD<0.5%，相對(duì)峰面積RSD<3%，表明儀器精密度良好。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取覆盆子標(biāo)準(zhǔn)湯劑同一份供試品溶液，分別于制備后0、2、4、8、12、24 h，按“2.4.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣5 μL，以鞣花酸峰為參照峰，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD。結(jié)果顯示相對(duì)保留時(shí)間RSD<0.5%，相對(duì)峰面積RSD<3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批覆盆子標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品，按“2.4.3”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以鞣花酸峰為參照峰，計(jì)算各共有峰相對(duì)相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD。結(jié)果顯示相對(duì)保留時(shí)間RSD<0.5%，相對(duì)峰面積RSD<3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.7 樣品測(cè)定與分析 取12 批覆盆子飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑，按“2.4.3”項(xiàng)下方法分別制備供試品液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄12批液相色譜圖，用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012.130723版)”進(jìn)行分析[24]，生成對(duì)照指紋圖譜，見(jiàn)圖3，圖4，相似度結(jié)果見(jiàn)表4。覆盆子標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜中確定了9 個(gè)共有峰，12 批覆盆子標(biāo)準(zhǔn)湯劑與對(duì)照?qǐng)D譜之間的相似度均>0.9。

圖3 12批覆盆子飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑( S1～S12)的HPLC指紋圖譜及對(duì)照指紋圖譜(R)

圖4 覆盆子標(biāo)準(zhǔn)湯劑對(duì)照指紋圖譜

表4 12批覆盆子標(biāo)準(zhǔn)湯劑相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

3 討論

3.1 標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品制備 本實(shí)驗(yàn)所采用的覆盆子飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備工藝是參照國(guó)家藥品監(jiān)督管理局公布的《技術(shù)要求》和衛(wèi)生部、國(guó)家中醫(yī)藥管理局共同下發(fā)的《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》[25]，選取合格的覆盆子飲片，以水為提取溶劑，按照臨床湯劑煎煮方法規(guī)范化煎煮[6-7]，過(guò)濾，低溫減壓濃縮，冷凍干燥，制得樣品。為抑制熱敏性成分的分解，減少成分損失，確保與飲片臨床湯劑基本一致，嚴(yán)格按《技術(shù)要求》，煎煮結(jié)束后趁熱進(jìn)行過(guò)濾，濾液迅速冷卻，控制濃縮溫度不超過(guò)50 ℃，采用冷凍干燥的方法對(duì)浸膏進(jìn)行干燥。冷凍干燥方法不僅可使標(biāo)準(zhǔn)湯劑有效成分的分解和損失最小，而且可以改進(jìn)湯劑懸濁液狀態(tài)難以保證均勻取樣和不易貯藏的缺點(diǎn)。

3.2 鞣花酸含量測(cè)定方法的建立 供試品制備方法通過(guò)對(duì)提取溶劑(50%甲醇、70%甲醇、甲醇)、提取方式(超聲處理和加熱回流)和超聲處理時(shí)間(20、30和40 min)的考察，最后選擇正文的提取方法。比較了不同的色譜柱(Capcell Pak C18、Agilent ZORBAX SB C18、Thermo Scientific Syncronis C18)，結(jié)果供試品液在3種色譜柱上均能得到較好的分離。

3.3 指紋圖譜分析方法的建立 供試品制備方法通過(guò)對(duì)提取溶劑(50%甲醇、50%乙醇、70%甲醇、甲醇)，提取方式(超聲處理和加熱回流)的考察，最后選擇正文的提取方法。研究比較了甲醇和乙腈作為有機(jī)相，0.2%磷酸、0.5%醋酸作為無(wú)機(jī)相，經(jīng)過(guò)優(yōu)化流動(dòng)相洗脫條件，最終選擇乙腈-0.2%磷酸的梯度洗脫系統(tǒng)，各色譜峰分離效果好，色譜峰數(shù)量多、基線較平穩(wěn)。本研究使用DAD檢測(cè)器在190～400 nm全紫外波長(zhǎng)掃描樣品光譜圖，提取254、280、310、340 nm處的色譜圖進(jìn)行比對(duì)，并參考相關(guān)文獻(xiàn)[22]，綜合考慮色譜峰數(shù)、色譜信號(hào)、分離情況、基線平穩(wěn)情況等方面因素，最終確定340 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。同時(shí)考察 25 ℃、30 ℃、35 ℃柱溫對(duì)色譜分離的影響，結(jié)果顯示柱溫對(duì)色譜分離效果有較大影響，35 ℃時(shí)所得指紋圖譜的分離效果較好，故建議柱溫設(shè)定為35 ℃。

本研究選取合格的12 批覆盆子飲片作為研究用樣品，建立了質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，得出鞣花酸的轉(zhuǎn)移率范圍為49.9%～82.8%，出膏率范圍13.2%～15.5%，均符合《技術(shù)要求》的范圍要求；建立了HPLC指紋圖譜，標(biāo)定了9 個(gè)共有峰，指認(rèn)了鞣花酸、山柰酚-3-O-蕓香糖苷和椴樹苷峰，各標(biāo)準(zhǔn)湯劑圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度均大于0.9。本文研究的標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率、指標(biāo)成分轉(zhuǎn)移率和指紋圖譜三個(gè)參數(shù)是其作為物質(zhì)基準(zhǔn)的重要依據(jù)。本文的研究結(jié)果可為覆盆子配方顆粒后續(xù)的工藝研究、質(zhì)量控制方法制定等提供標(biāo)準(zhǔn)參考。