張穎

（華東師范大學(xué)，上海 200241）

流式細(xì)胞儀(Flow Cytometer，F(xiàn)CM)是一種對(duì)懸浮液中處于高速且直線流動(dòng)的單細(xì)胞或顆粒，實(shí)現(xiàn)高速且單細(xì)胞的多參數(shù)定量分析或分選的儀器。同時(shí)，對(duì)單個(gè)細(xì)胞（顆粒）進(jìn)行多參數(shù)、快速、準(zhǔn)確、高精度的分析（選）的功能，已經(jīng)成為當(dāng)前先進(jìn)的細(xì)胞（顆粒）定量分析技術(shù)。

1 流式細(xì)胞儀的工作原理

液流系統(tǒng)、光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)、電子控制系統(tǒng)、數(shù)據(jù)儲(chǔ)存與分析系統(tǒng)構(gòu)成了流式的分析儀，具有分選功能的流式細(xì)胞儀還包括分選系統(tǒng)。在一定的壓力下，懸浮的細(xì)胞或顆粒進(jìn)入鞘液，通過(guò)動(dòng)力學(xué)聚焦作用居于鞘液流中心，鞘液包裹著細(xì)胞或顆粒通過(guò)噴嘴中心進(jìn)入流動(dòng)室，在流動(dòng)式的分析點(diǎn)，激光照射到細(xì)胞（顆粒）上，發(fā)生光的散射、反射、折射；細(xì)胞所攜帶的熒光素被激光激發(fā)，發(fā)出不同波長(zhǎng)的熒光。散射光、不同波長(zhǎng)的熒光，通過(guò)不同的濾光片分配到光電倍增光檢測(cè)器（PMT）上，散射光被PMT轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，熒光則被聚光器收集，PMT將熒光信號(hào)對(duì)數(shù)放大，轉(zhuǎn)化成電信號(hào)。散射光信號(hào)和熒光信號(hào)經(jīng)放大后，再經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)化處理輸入電腦并儲(chǔ)存。分選系統(tǒng)目前是在流式細(xì)流動(dòng)室的出口噴嘴上安裝的壓電晶片，根據(jù)光學(xué)信號(hào)的反饋使液流束解離出單細(xì)胞液滴并帶上相應(yīng)電荷。帶電液滴進(jìn)入一個(gè)恒定靜電場(chǎng)后發(fā)生方向偏轉(zhuǎn)，包含目標(biāo)細(xì)胞的液滴流入收集容器。

2 流式細(xì)胞儀的光學(xué)系統(tǒng)及濾光片

光學(xué)系統(tǒng)是流式細(xì)胞儀的核心結(jié)構(gòu)之一，包括光源和信號(hào)接收系統(tǒng)。光源是指激光器；流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞及微粒的檢測(cè)是通過(guò)對(duì)光信號(hào)的收集實(shí)現(xiàn)的，包括散射光信號(hào)和熒光信號(hào)的檢測(cè)。

流式細(xì)胞儀的光學(xué)系統(tǒng)是由激光器、若干組透鏡、小孔和一系列的濾光片等組成。熒光分光系統(tǒng)是由多組濾光片組成，濾光片的主要作用是將不同波長(zhǎng)的熒光信號(hào)傳送到相應(yīng)的PMT上。濾光片主要有三類(lèi)：短通濾光片（Shortpass filter）：小于特定波長(zhǎng)的光信號(hào)通過(guò)；長(zhǎng)通濾光片（Long-pass filter）：大于特定波長(zhǎng)以上的光信號(hào)通過(guò)。帶通濾光片（Band-pass filter）：只允許一定的波段范圍內(nèi)特定波長(zhǎng)的光信號(hào)通過(guò)。不同的濾光片組合可以將不同波長(zhǎng)的熒光信號(hào)傳送到相應(yīng)的PMT上。

3 流式細(xì)胞儀原濾光片配置的局限性及優(yōu)化的必要性

熒光素光的強(qiáng)度有強(qiáng)弱之分，單熒光素的選擇標(biāo)記的流式抗體一般盡量選擇熒光較強(qiáng)的熒光素，只要在儀器的檢測(cè)范圍，受濾光片配置影響較??；多熒光素組合的流式實(shí)驗(yàn)在熒光素的選擇上優(yōu)先考慮的是樣本表面或者內(nèi)部各種抗原表達(dá)量的不同。表達(dá)高的抗原選擇較弱熒光素標(biāo)記的抗體，而表達(dá)量低的抗原則要選擇強(qiáng)熒光素標(biāo)記的抗體。但在10種熒光素以上的流式檢測(cè)設(shè)計(jì)方案，低表達(dá)的檢測(cè)標(biāo)記多，儀器原有配置不能滿足檢測(cè)需求。

目前，流式細(xì)胞儀配有多個(gè)熒光檢測(cè)器，可以同時(shí)檢測(cè)多種熒光。每個(gè)熒光檢測(cè)器只允許一種特定波長(zhǎng)的熒光信號(hào)通過(guò)并被檢測(cè)到，因此我們必須選擇適當(dāng)?shù)男盘?hào)接收器，才能收到最佳信號(hào)，儀器的濾光片的配置決定了哪些信號(hào)通道可以被檢測(cè)到。在進(jìn)行流式的多色分析實(shí)驗(yàn)時(shí)，如果想得到理想的檢測(cè)結(jié)果，就必須選擇最佳的熒光素抗體搭配。在檢測(cè)過(guò)程中，由于儀器出廠時(shí)間比較久，濾光片配置根據(jù)當(dāng)時(shí)在市場(chǎng)上應(yīng)用的熒光素種類(lèi)進(jìn)行設(shè)置，但隨著科技的進(jìn)步，新熒光素不斷被開(kāi)發(fā)出來(lái)并應(yīng)用到流式熒光抗體中，儀器老舊的配置使很多新染料得不到應(yīng)用，影響科學(xué)研究的多色檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的步伐。

科學(xué)研究的多色檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，受限于儀器的出廠配置，熒光素的顏色搭配不能達(dá)到最佳，就會(huì)產(chǎn)生大量的熒光溢漏，必須進(jìn)行補(bǔ)償?shù)恼{(diào)節(jié)，帶來(lái)大量的額外工作。為解決上述問(wèn)題，我們仔細(xì)研究了流式細(xì)胞儀的配置，探索通過(guò)優(yōu)化濾光片的搭配，使光路系統(tǒng)的配置更加靈活，建立可實(shí)現(xiàn)多種熒光素檢測(cè)且盡可能少補(bǔ)償調(diào)節(jié)的配色方案。實(shí)現(xiàn)檢測(cè)多色流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的目的。以流式細(xì)胞技術(shù)平臺(tái)的BD LSR Fortessa優(yōu)化405激發(fā)光的熒光檢測(cè)通道為例，出廠儀器配置如圖所示1。

在研究光學(xué)系統(tǒng)時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)激光接收盤(pán)的結(jié)構(gòu)放置濾光片的位置有頂簧，濾光片的架子規(guī)格是固定的，這可以保證濾光片插進(jìn)去的角度不變，流式細(xì)胞儀固定的校準(zhǔn)光路設(shè)計(jì)，保證了激光的接收效果。根據(jù)光的性質(zhì)性的理論分析，利用流式細(xì)胞儀熒光接受盤(pán)的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)特點(diǎn)，我們定制濾光片，優(yōu)化儀器光學(xué)系統(tǒng)，根據(jù)實(shí)際檢測(cè)工作的需要靈活地組合搭配濾光片。

由圖1我們可知，原405激光器的有6個(gè)檢測(cè)器可接受并檢測(cè)熒光信號(hào)，長(zhǎng)通570nm和帶通586/15nm組合名為Qdot585的通道與長(zhǎng)通為535nm帶通為540/30nm名為Qdot565的通道，接受熒光信號(hào)波段差小，產(chǎn)生的熒光補(bǔ)償大；而且市場(chǎng)上Qdot585同波段的熒光素抗體應(yīng)用較少。經(jīng)市場(chǎng)和用戶(hù)使用調(diào)研，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，進(jìn)行光學(xué)系統(tǒng)優(yōu)化搭配組合濾光片，改善儀器配置，定制750nm長(zhǎng)通濾光片和帶通為780/60nm的帶通濾光片，搭配使用，引入熒光強(qiáng)度較強(qiáng)，與其他熒光通道波段差異大，相互產(chǎn)生溢漏小，且標(biāo)記抗體多的BV785（6）熒光素所需750～810nm通道取代Qdot585通道。

圖1 原儀器405nm激光接受器配置

將定制濾光片750nm的長(zhǎng)通濾光片和780/60nm的帶通濾光片置于405nm激發(fā)光接收器的A位置，如圖2所示，根據(jù)光的波段從長(zhǎng)到短的行走路徑和光性質(zhì)，重新布局各濾光片的分布，如圖2所示。在儀器上重新布局濾光片后，需在軟件里重新設(shè)置新的“Configration”，405nm激光器激發(fā)的熒光接受通道布局按圖2進(jìn)行設(shè)置。在新的“Configration”下通過(guò)質(zhì)量控制監(jiān)測(cè)后，發(fā)現(xiàn)儀器性能各項(xiàng)指標(biāo)正常通過(guò)質(zhì)控，未因?yàn)V光片的重新布局，受到影響。我們進(jìn)行BV785（6）熒光素的檢測(cè)，該通道無(wú)論是單色BV786熒光素檢測(cè)，還是多色的染色方案中都可以檢測(cè)到BV786熒光素抗體標(biāo)記的細(xì)胞亞群，如圖3所示。

圖2 405nm激光接受器濾光片的新布局

圖3 優(yōu)化的BV786檢測(cè)通道

4 結(jié)語(yǔ)

優(yōu)化濾光片配置，對(duì)其進(jìn)行靈活的組合，引入新的熒光檢測(cè)通道，減少了多色檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中的熒光補(bǔ)償，在多色的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及檢測(cè)過(guò)程中節(jié)省實(shí)驗(yàn)費(fèi)用和時(shí)間成本。我們對(duì)流式細(xì)胞儀405nm激光器的一個(gè)通道的濾光片進(jìn)行優(yōu)化的探索，其他檢測(cè)通道及其他激光器檢測(cè)通道的濾光片的優(yōu)化提供了可循的方案，為多色檢測(cè)在科研的廣泛應(yīng)用貢獻(xiàn)了一份力量。