李 倩，朱怡文，李玲玲

(1. 上海市兒童醫(yī)院，上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院，中心實驗室，上海 200040； 2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳研究所，上海 200040； 3. 國家衛(wèi)健委醫(yī)學(xué)胚胎分子生物學(xué)重點實驗室，上海市胚胎與生殖工程重點實驗室，上海 200040

慢性炎性痛是一種嚴(yán)重破壞患者生活質(zhì)量的常見疾病。盡管目前對炎性痛的分子機制尚未完全闡明，但脊髓中的促炎性細(xì)胞因子是公認(rèn)的關(guān)鍵病理因素。IL-1β和IL-33等白介素(IL)-1超家族細(xì)胞因子可通過作用于其特異性受體參與炎性痛的發(fā)生發(fā)展[1]。

IL-36α(以前稱為IL-1F6)、IL-36β(IL-1F8)和IL-36γ(IL-1F9)是最近報道的IL-1細(xì)胞因子家族新成員。IL-36細(xì)胞因子的每個成員都可通過結(jié)合IL-36受體(IL-36R)及IL-1R輔助蛋白(IL-1RAcP)激活下游絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase， MAPK)和核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor kappa B，NF-κB)等信號通路促進(jìn)炎癥反應(yīng)[2]。而IL-36R拮抗劑(IL-36 receptor antagonist，IL-36Ra)可競爭性結(jié)合IL-36R，阻斷IL-36R及其下游信號通路[3]。已證實，IL-36及其受體參與多種炎性疾病的病理過程。我們之前研究也表明，CFA炎性痛小鼠脊髓IL-36γ與IL-36R表達(dá)升高，而給予IL-36Ra可緩解小鼠痛行為[4]。但I(xiàn)L-36Ra緩解炎性痛的具體作用機制目前尚不清楚。

IL-36R在小鼠脊髓內(nèi)主要表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞，星形膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)數(shù)量最多的一類細(xì)胞，在炎性痛調(diào)控中至關(guān)重要。在外周炎性刺激時，脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞可被激活，形態(tài)上增生、肥大，稱為反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞。反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放的促炎、趨化因子可直接作用于神經(jīng)元，導(dǎo)致中樞敏化，促進(jìn)炎性痛維持與發(fā)展[5]。最新研究表明，星形膠質(zhì)細(xì)胞激活后可向A1和A2兩種不同的表型極化，A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞可分泌促炎性細(xì)胞因子，加劇神經(jīng)炎癥反應(yīng)；A2型星形膠質(zhì)細(xì)胞可分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子，具有神經(jīng)保護(hù)性[6]。本研究旨在研究IL-36Ra對CFA炎性痛小鼠痛行為以及脊髓A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞極化的作用。揭示其緩解炎性痛的分子作用機制，為臨床治療炎性痛提供可能靶點。

1 材料

1.1 動物成年♂ C57BL/6小鼠53只，6-8周齡，體質(zhì)量(25～30)g，由上海靈暢生物科技有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2018-0003。飼養(yǎng)環(huán)境為12 h光照/黑夜循環(huán)，溫度(22-25)℃。

1.2 試劑CFA試劑購自Sigma公司(F5881-10 mL)；IL-36Ra純化蛋白購自R&D公司(2714-ML-025/CF)；GFAP抗體購自Millipore公司(MAB360)、C3抗體購自Abcam公司(ab200999)；FITC或Cy3標(biāo)記的熒光二抗購自Jackson公司；RNA提取試劑盒購自Qiagen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Takara公司，SYBR Green試劑購于Roche公司。

2 方法

2.1 動物分組與處理行為學(xué)實驗將32只小鼠隨機分為4組，每組8只：對照治療組(CFA + Saline組)、IL-36Ra不同劑量治療組：CFA+IL-36Ra 50 ng、CFA+IL-36Ra 100 ng、CFA+IL-36Ra 200 ng。每組均在造模后d 1至d 7鞘內(nèi)注射給藥，每日1次。造模后d 1、3、5、7檢測各組小鼠痛行為變化。

分子實驗將12只小鼠隨機分為4組，每組3只：正常組、對照治療組(CFA + Saline組)、CFA+IL-36Ra 100 ng組、CFA+IL-36Ra 200 ng組。造模及給藥方法同行為學(xué)實驗，給藥7 d后新鮮取材脊髓組織用于RT-PCR實驗。

形態(tài)學(xué)實驗將9只小鼠隨機分為3組，每組3只：正常組、對照治療組(CFA + Saline組)、CFA+IL-36Ra 200 ng組。造模及給藥方法同行為學(xué)實驗，給藥7 d后灌流固定取材脊髓組織用于免疫熒光實驗。

2.2 動物模型建立外周炎性痛小鼠模型制備：固定小鼠，抓取小鼠右后爪，使用微量注射器向小鼠足底正中表面注射20 μL完全弗氏佐劑。

2.3 機械刺激縮足閾值分別在造模前以及造模后d 1、3、5、7檢測各組小鼠的機械刺激縮足閾值 (mechanical withdraw threshold, MWT)。方法如下：將小鼠置于鋪有小孔鐵絲網(wǎng)的籠中適應(yīng)至少30 min。然后使用一組von Frey弗萊毛(0.02、0.04、0.07、0.16、0.4、0.6、1.0和1.4 g)垂直刺激右側(cè)后爪的掌面正中。采用Dixon介紹的Up and down方法測得小鼠的50% MWT[7]。

2.4 輻射熱刺激縮爪潛伏期分別在造模前以及造模后d 1、3、5、7檢測各組小鼠的輻射熱刺激縮爪潛伏期(paw withdrawal latency，PWL)。具體方法：將小鼠放置在底部鋪有玻璃板的亞克力籠中，將輻射熱施加到右側(cè)后爪足底表面，直到小鼠將其爪子從玻璃板上抬起。縮爪潛伏期為從輻射熱開始到小鼠縮爪的時間，截止時間設(shè)為20 s[7]。

2.5 用免疫熒光法測定脊髓GFAP、C3表達(dá)正常、CFA+Saline以及CFA+IL-36Ra 200 ng小鼠在給藥7 d后取材，每組3只。具體方法：采用1%戊巴比妥鈉50 mg·kg-1腹腔注射麻醉后灌流多聚甲醛固定取材，取腰膨大段脊髓組織，經(jīng)蔗糖梯度脫水OCT包埋后冰凍切片。采用小鼠來源GFAP以及兔來源C3一抗進(jìn)行免疫熒光染色，激光共聚焦顯微鏡拍照采集結(jié)果。

2.6 用RT-PCR法檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)正常、CFA+Saline以及CFA+IL-36Ra 100和200 ng小鼠在給藥7 d后新鮮取材，每組3只。具體方法：采用1%戊巴比妥鈉50 mg·kg-1腹腔注射麻醉，生理鹽水灌注后新鮮取材腰膨大段脊髓組織。提取脊髓組織的RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用SYBR Green試劑進(jìn)行實時熒光定量PCR反應(yīng)。結(jié)果以2-△△Ct計算靶基因的轉(zhuǎn)錄水平。

3 結(jié)果

3.1 IL-36Ra對CFA炎性痛小鼠MWT和PWL作用使用雄性C57BL/6小鼠成功建立CFA炎性痛小鼠模型。與造模前相比，各組小鼠在造模后d 1即出現(xiàn)MWT明顯下降。而IL-36Ra 100、200 ng在連續(xù)給藥5 d后可有效提高CFA小鼠造模側(cè)機械痛閾，且較生理鹽水對照組差異有顯著性(P<0.05)。IL-36Ra 200 ng在治療7 d后，可使CFA小鼠MWT恢復(fù)至造模前71.9%，明顯緩解炎性痛小鼠機械性痛覺超敏(Fig 1A)。

CFA小鼠造模后各組PWL明顯下降，出現(xiàn)明顯熱痛覺過敏。而IL-36Ra 100、200 ng連續(xù)給藥3 d后，均可以明顯提高CFA小鼠PWL(P<0.05)。IL-36Ra 100、200 ng在治療7 d后，可使CFA小鼠PWL分別提高50.0%與66.2%(Fig 1B)。

Fig 1 Effects of IL-36Ra on ipsilateral MWT and PWL of CFA mice n=8)

3.2 IL-36Ra對CFA炎性痛小鼠脊髓反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞作用為了進(jìn)一步探索IL-36Ra緩解炎性痛的作用機制，選取IL-36Ra有效劑量100 ng和200 ng觀察其對脊髓反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用。RT-PCR實驗發(fā)現(xiàn)，CFA小鼠脊髓內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞激活標(biāo)志物GFAP、Lcn2的mRNA表達(dá)水平較正常小鼠明顯升高(P<0.05)。與生理鹽水相比，IL-36Ra 100 ng與200 ng連續(xù)治療7 d后均可明顯抑制CFA誘導(dǎo)的GFAP mRNA水平升高。同時，IL-36Ra 200 ng可顯著抑制Lcn2 mRNA水平升高(P<0.05)(Fig 2)。表明IL-36Ra可抑制CFA引起的小鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞激活。

Fig 2 Effects of IL-36Ra on mRNA expression changes of GFAP, Lcn2 in spinal cord of CFA mice n=3)

3.3 IL-36Ra對CFA炎性痛小鼠脊髓A1、A2型星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的作用RT-PCR實驗發(fā)現(xiàn)，在CFA小鼠上，IL-36Ra 200 ng連續(xù)治療7 d可逆轉(zhuǎn)CFA誘導(dǎo)的脊髓A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Serping1、H2-T23表達(dá)升高，且較生理鹽水治療組差異有顯著性(P<0.05)，見Fig 3A-B。CFA小鼠造模后脊髓A2型星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物S100a10、Ptx3的mRNA表達(dá)水平下降，但I(xiàn)L-36Ra治療對其無明顯影響(P>0.05)，見Fig 3C-D。提示IL-36Ra可抑制CFA小鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞向A1型極化。

3.4 IL-36Ra對CFA小鼠脊髓A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物C3表達(dá)影響為了進(jìn)一步從形態(tài)上觀察IL-36Ra對CFA小鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞激活以及向A1表型極化的作用，采用正常組、CFA+生理鹽水組以及IL-36Ra有效劑量200 ng組進(jìn)行形態(tài)學(xué)實驗。免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn)，CFA+生理鹽水組小鼠在造模后d 7，造模側(cè)脊髓背角內(nèi)A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物C3與GFAP的信號均顯著增多，星形膠質(zhì)細(xì)胞增生、肥大(Fig 4)。而IL-36Ra 200 ng可抑制CFA小鼠脊髓中C3與GFAP信號升高。統(tǒng)計相對熒光強度發(fā)現(xiàn)，IL-36Ra治療可以顯著抑制CFA小鼠脊髓背角A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物C3與GFAP的共定位信號水平(P<0.05)，見Fig 5。

Fig 3 Effects of IL-36Ra on mRNA expression changes of A1 and A2 astrocyte maker in spinal cord of CFA mice n=3)

Fig 4 Effects of IL-36Ra on GFAP (green) and C3 (red) immunoreactivity in ipsilateral spinal cord dorsal horn of CFA mice (×200,n=3)

Fig 5 Statistical results of GFAP (green) and C3 (red) immunoreactivity in ipsilateral spinal cord dorsal horn of CFA mice n=3)

4 討論

外周炎性痛是臨床上最常見的癥狀之一，常伴發(fā)于局部感染以及關(guān)節(jié)肌肉炎癥等病理過程。中樞敏化是炎性痛發(fā)生的重要病理機制。脊髓作為處理疼痛信息的低級中樞，外周神經(jīng)傳入的傷害性信息會在脊髓進(jìn)行加工整合，繼而上行投射到腦干與大腦皮層產(chǎn)生痛覺[8]。而由膠質(zhì)細(xì)胞激活、促炎性細(xì)胞因子大量生成為特征的神經(jīng)炎癥可降低脊髓神經(jīng)元興奮性閾值，在炎性痛的發(fā)生發(fā)展中起了非常重要的作用[9]。本研究通過CFA進(jìn)行炎性痛造模，小鼠造模后表現(xiàn)有穩(wěn)定的痛行為，且脊髓內(nèi)存在星形膠質(zhì)細(xì)胞激活，說明存在神經(jīng)炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步證實模型建立成功。

IL-36α、IL-36β和IL-36γ是IL-1細(xì)胞因子超家族的新成員，而在小鼠脊髓中僅可檢測到IL-36γ表達(dá)。IL-36γ表達(dá)于脊髓神經(jīng)元，而其受體IL-36R則主要表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞。IL-36γ/IL-36R作為一條新發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)元—星形膠質(zhì)細(xì)胞間信號通路，可通過誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞激活促進(jìn)神經(jīng)炎癥[4]。在本研究中，IL-36R拮抗劑IL-36Ra連續(xù)鞘內(nèi)給藥可顯著緩解CFA小鼠機械性痛覺超敏與熱痛覺過敏，證實IL-36R及其下游信號通路參與炎性痛過程。此外，IL-36Ra還有效抑制了脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞激活，進(jìn)一步證實阻斷IL-36R可直接調(diào)節(jié)脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞活性。

在神經(jīng)炎癥過程中，激活后的星形膠質(zhì)細(xì)胞可向A1表型極化。有研究證實，A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)C3等補體蛋白過度表達(dá)，生成大量SERPINA3、CXCL10等趨化因子、促炎因子[10]。而抑制脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞向A1型極化可有效緩解慢性痛痛行為[11]。本研究發(fā)現(xiàn)CFA小鼠脊髓內(nèi)A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)升高，而IL-36Ra 200 ng治療7 d后，A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物明顯降低。同時有體外試驗證實，IL-36Ra可有效抑制IL-36γ誘導(dǎo)的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)CCL2、IL-6表達(dá)升高[4]。進(jìn)一步說明，IL-36R拮抗劑IL-36Ra可抑制脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞向A1極化，進(jìn)而抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)。

關(guān)于IL-36Ra抑制A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞極化的分子機制，尚未完全闡明。有研究表明，小膠質(zhì)細(xì)胞激活后釋放的IL-1α、TNF-α和C1q可在直接體外誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞激活并向A1表型極化[12]。CFA炎性痛小鼠脊髓內(nèi)，已證實存在小膠質(zhì)細(xì)胞激活、TNF-α炎癥因子大量生成等病理變化[13]。因此，我們推測在炎性痛造模后，脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞激活并釋放促炎性細(xì)胞因子，進(jìn)而誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞向A1型極化。雖然有研究表明，抑制神經(jīng)痛大鼠脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞激活可阻止星形膠質(zhì)細(xì)胞A1型極化[14]。但I(xiàn)L-36Ra可直接與星形膠質(zhì)細(xì)胞表面IL-36R結(jié)合并阻斷第二受體IL-1RAcP的募集來拮抗下游信號通路，調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞活性[15]。有證據(jù)表明，IL-36Ra可抑制脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)JNK、NF-κB等信號通路激活[4]。因此我們認(rèn)為，IL-36Ra可通過直接調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)信號通路，而非通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活，來阻斷脊髓A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞極化。

綜上所述，CFA小鼠脊髓內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞激活并向A1型表型極化，IL-36Ra可抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞向A1型極化并緩解炎性痛。本研究結(jié)果首次證實了IL-36R對脊髓A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞極化的調(diào)節(jié)作用，為神經(jīng)元-星形膠質(zhì)細(xì)胞間的功能調(diào)節(jié)提供了新的線索與思路，而IL-36Ra可能成為外周炎性痛有效的治療藥物。