周珂輝，劉延慶，陶 麗

(揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，國家中醫(yī)藥管理局胃癌毒邪論治重點研究室，江蘇 揚州 225009)

DNA損傷修復(fù)是保障基因組穩(wěn)定性，并將遺傳信息準確無誤地傳給子代細胞的關(guān)鍵。損傷一旦發(fā)生后，細胞啟動一系列損傷監(jiān)控和修復(fù)機制，即所謂的DNA損傷應(yīng)答(DNA damage response，DDR)。作為最為嚴重的DNA損傷形式——DNA雙鏈斷裂(double-strand breaks，DSBs)，細胞采取兩種修復(fù)途徑，即同源重組(homologous recombination，HR)和非同源末端連接(non-homologous end joining，NHEJ)。決定這兩條途徑選擇性進行的關(guān)鍵步驟是末端切除及切除的核苷酸長度。HR途徑中，DSBs一條鏈末端5′→3′方向首先被切除掉上千個堿基，另一條鏈則形成較長的3′突出單鏈DNA(single-stranded DNA，ssDNA)尾，這一過程被稱為末端切除(end resection)[1]。乳腺癌易感基因1(breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1)與其它核心蛋白(BARD等)形成復(fù)合體促進末端切除，BRCA2負責與重組酶RAD51結(jié)合并將其招募至3′單鏈DNA末端，形成RAD51單鏈DNA纖維(RAD51 filament)，侵入姐妹染色單體中的同源序列完成修復(fù)過程；NHEJ則是將斷裂的DNA末端直接相連，利用損傷區(qū)域微同源序列形成粘性末端，通過堿基互補配對，無需切除或只需切除末端小片段非同源ssDNA，再將斷裂的DNA重新連接。NHEJ包括3條途徑，異二聚體Ku依賴的經(jīng)典途徑(canonical NHEJ，c-NHEJ)，Ku非依賴的替代性途徑(alternative NHEJ，a-NHEJ)與及單鏈退火途徑(single-strand annealing，SSA)。這3種NHEJ途徑的主要區(qū)別在于微同源序列的長度不同。c-NHEJ只需0-5 bp的同源序列，a-NHEJ需5-25 bp的同源序列，而SSA則需要>30 bp的同源序列[2]。因此，限制或保護DNA斷端不被大范圍切除，即可將HR修復(fù)途徑轉(zhuǎn)向NHEJ途徑。DNA斷端保護介導(dǎo)的DSBs修復(fù)途徑轉(zhuǎn)換機制一直是DNA損傷修復(fù)研究的國際前沿問題[3]。

1 Shieldin的發(fā)現(xiàn)

作為HR與NHEJ修復(fù)途徑選擇的決定因子，p53結(jié)合蛋白(p53 binding protein 1，53BP1)，通過招募另一染色質(zhì)支架蛋白RIF1(Rap1 interacting factor)競爭性抑制BRCA1依賴的末端切除，將DSBs修復(fù)引導(dǎo)至NHEJ途徑[4]。但是53BP1-RIF1通路抑制末端切除機制的下游效應(yīng)因子仍不清楚。2015年，DNA聚合酶ζ的小亞基REV7(又稱為MAD2L2或MAD2B)被鑒定為53BP1-RIF1限制末端切除的一個下游因子[5-6]。2018年，丹麥哥本哈根大學(xué)研究團隊在利用親和純化與質(zhì)譜偶聯(lián)的鄰近標記技術(shù)繪制了53BP1參與DNA損傷修復(fù)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)了與REV7直接互作的CTC-534A2.2，并揭示其促進NHEJ的生物功能，命名為RINN1，同時發(fā)現(xiàn)另外兩種協(xié)作蛋白FAM35A與C20orf196，分別命名為RINN2與RINN3。作者首次將REV7、RINN1、RINN2與RINN3組成的復(fù)合物命名為Shieldin。顧名思義，Shieldin具有DNA末端防衛(wèi)、保護的寓意，取自于端粒保護復(fù)合體Shelterin[7]。

根據(jù)協(xié)同致死作用，BRCA1/2突變的HR缺陷腫瘤對PARP(poly (ADP-ribose) polymerase)抑制劑格外敏感[8]，而去除53BP1使腫瘤恢復(fù)了HR修復(fù)能力而產(chǎn)生PARP抑制劑抵抗。加拿大多倫多大學(xué)研究團隊基于這一實驗表型，利用CRISPR/Cas9技術(shù)篩選53BP1遺傳互作分子，也發(fā)現(xiàn)了FAM35A、C20orf196與CTC-534A2.2在促進NHEJ并抑制HR功能中的作用，并將C20orf196重新命名為SHLD1(RINN3)，F(xiàn)AM35A重新命名為SHLD2(RINN2)，CTC-534A2.2重新命名為SHLD3(RINN1)[9]。與此同時，國際上其它多個課題組也相繼證實了Shieldin復(fù)合體是53BP1-RIF1下游效應(yīng)因子，引發(fā)了Shieldin研究熱潮[10-14]。

2 Shieldin的分子結(jié)構(gòu)與組裝機制

Shieldin復(fù)合物4個亞基中的REV7是編碼211個氨基酸，分子量大小為24 ku的適配蛋白，中間含有1個HORMA結(jié)構(gòu)域，C端含有1個被稱之為“安全帶”的結(jié)合模序(Seatbelt-binding motif，SBM)，是連接SHLD2和SHLD3的橋梁分子。SHLD1C20orf196位于20號染色體，編碼205個氨基酸，分子量為23 ku，位于復(fù)合體信號鏈末端；SHLD2FAM35A位于10號染色體，編碼835個氨基酸，分子量為92 ku，其C端含有3個寡核苷酸/寡糖結(jié)合折疊(OB-fold)結(jié)構(gòu)域(OBA/OBB/OBC)，使Shieldin復(fù)合物定位并組裝在斷裂DNA末端單鏈DNA上，C端OBC上的兩個CXXC模序與SHLD1綁定，N端與REV7綁定。SHLD3CTC-534A2.2位于5號染色體，編碼250個氨基酸，分子量為29 ku，其N端含有兩個預(yù)測的REV7結(jié)合模序(PxxxpP，REV7-binding motif，RBM)，C端含有翻譯延長因子EIF4E樣結(jié)構(gòu)域。同其它含有RBM模序的REV7結(jié)合蛋白相同，SHLD3通過自身的RBM與REV7上的SBM綁定在一起，位于復(fù)合體信號鏈最上游(Fig 1A)。綜上，Shieldin復(fù)合物自上而下的工作順序為SHLD3-REV7-SHLD2-SHLD1[15]。

2020年，中國科學(xué)院生物物理研究所周政課題組首次解析了SHLD3結(jié)合REV7的高級結(jié)構(gòu)SHLD3-RBD(REV7-binding domain)。SHLD3-RBD形似長柄勺，通過N端loop勺柄及其C端α-螺旋勺體與REV7的SBM拴在一起[16]。同年，北京大學(xué)尹玉新課題組成功制備并解析了含SHLD3-REV7-SHLD2三元復(fù)合物的高分辨率晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)SHLD3-SHLD2結(jié)合2個REV7分子，分別呈現(xiàn)關(guān)閉(Closed)C-REV7和開放(Open)O-REV7的兩種構(gòu)象，即C-REV7-O-REV7構(gòu)象二聚體(conformational dimer)，重新定義了SHLD3-REV7-SHLD2復(fù)合物實為四聚體結(jié)構(gòu)，且REV7構(gòu)象二聚體為NHEJ效率所必需[17]。Clairmont等[18]也通過冷凍電鏡技術(shù)證實了REV7構(gòu)象二聚體的存在，發(fā)現(xiàn)C-REV7為結(jié)合態(tài)/激活態(tài)而O-REV7為松弛態(tài)/失活態(tài)，進一步明確C-REV7與SHLD3通過SBM綁定在一起(Fig 1B)。REV7二聚化依賴HORMA結(jié)構(gòu)域[19]，Sarangi等[20]發(fā)現(xiàn)C-REV7向O-REV7轉(zhuǎn)變不僅依賴TRIP13(下文介紹)，還依賴于p31comet適配蛋白，該蛋白自身也包含一個HORMA結(jié)構(gòu)域，具體的機制還有待解析。

Fig 1 Subunits and model of Shieldin complex

3 Shieldin抑制HR修復(fù)的分子機制

Shieldin抑制HR修復(fù)存在兩種機制，一是限制HR上游末端切除的進行(末端切除前)，其二是限制HR下游BRCA2/RAD51的加載(末端切除后)。一方面，Shieldin通過招募一種單鏈DNA保護蛋白——端粒結(jié)合蛋白復(fù)合物CST(Ctc1、Stn1、Ten1)作為聚合酶α/引物酶輔助因子(polymeraseα/primase accessory factor)，通過合成新的ssDNA填充斷裂DNA末端缺口，從而防止末端切除的發(fā)生?；プ鞣治霭l(fā)現(xiàn)，SHLD1與CST復(fù)合物中的Ctc1強烈結(jié)合，提示SHLD1是Shieldin招募CST的主導(dǎo)者[11]。另一方面，Shieldin抑制HR修復(fù)還存在末端切除后機制。BRCA1缺陷細胞替代性利用E3泛素連接酶RNF168招募乳腺癌易感基因相關(guān)蛋白PALB2與BRCA2而啟動RAD51纖維形成。Shieldin復(fù)合物中的SHLD3可以抑制該通路，減少RAD51纖維而阻斷HR修復(fù)途徑，使得BRCA1/53BP1雙突變細胞中發(fā)生末端切除正常而無RAD51加載的現(xiàn)象[13]。此外，在BRCA1/53BP1雙敲除細胞中，SHLD2完整的OB折疊結(jié)構(gòu)域與ssDNA的結(jié)合作為BRCA2/RAD51物理屏障對抑制HR途徑十分關(guān)鍵[18]。末端切除后機制的發(fā)現(xiàn)也從側(cè)面證實了HR途徑中RAD51加載可以與末端切除解耦聯(lián)。

4 Shieldin信號的滅活機制

為進一步理解Shieldin介導(dǎo)的末端保護與促進NHEJ修復(fù)途徑的負向調(diào)控機制，Clairmont等從REV7結(jié)合蛋白組中又鑒定了新的靶蛋白TRIP13(thyroid hormone receptor interacting protein 13)。TRIP13是甲狀腺激素受體相互作用蛋白，屬于AAA-ATPase家族。研究顯示TRIP13通過負向調(diào)控紡錘體組裝檢查點和DNA修復(fù)促進染色體不穩(wěn)定性，從而促進腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。與敲除REV7產(chǎn)生RARP抑制劑抵抗效應(yīng)相反，敲除TRIP13可以增強PARP抑制劑敏感性，因此推測TRIP13可以負向調(diào)控REV7。根據(jù)TRIP13催化其已知底物紡錘體組裝檢查點蛋白MAD2從關(guān)閉構(gòu)象(C-MAD2)轉(zhuǎn)為開放構(gòu)象(O-MAD2)，研究同樣證實了REV7構(gòu)象二聚體現(xiàn)象，且其中的C-REV7通過SBM與SHLD3結(jié)合，TRIP13可以使C-REV7-SHLD3解聚從而拮抗REV7功能，促進末端切除與HR修復(fù)，使BRCA1缺失腫瘤對PARP抑制劑的敏感性降低[21-22]。最近，Xie等[22]解析了TRIP13去組裝Shieldin的結(jié)構(gòu)機制，發(fā)現(xiàn)TRIP13利用其六聚分子馬達介導(dǎo)的孔道旋轉(zhuǎn)動力促進C-REV7的N端未折疊肽段拉入至TRIP13中心孔道，實現(xiàn)C-REV7從Shieldin復(fù)合物中分離。

5 Shieldin與腫瘤的關(guān)系及其臨床價值

一方面，去除Shieldin復(fù)合物的任何一個亞基均使BRCA1缺陷的腫瘤產(chǎn)生PARP抑制劑抵抗，Shieldin功能喪失可以挽救BRCA1缺陷腫瘤HR活性，誘導(dǎo)PARP抑制劑耐藥的發(fā)生。在BRCA1缺失的臨床腫瘤樣本的PDX(patient-derived xenografts)模型小鼠中，SHLD1/2的表達水平與PARP抑制劑的敏感性成正相關(guān)性[18]。因此，針對革命性抗腫瘤藥物PARP抑制劑耐藥的臨床困境，Shieldin復(fù)合物及其分子互作可以為解析PARP抑制劑耐藥機制提供新的視角。另一方面，與易錯修復(fù)的NHEJ相比，HR是一種精準無誤的修復(fù)途徑，Shieldin是負向調(diào)控HR且正向調(diào)控NHEJ的終末效應(yīng)因子，因此Shieldin信號過度活躍可以誘導(dǎo)突變的積累與基因組不穩(wěn)定性，從而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在荷瘤小鼠模型中，敲除Shieldin中的SHLD1或SHLD2能夠增加BRCA1缺失腫瘤對鉑類化療藥物與電離輻射(IR)的敏感性，提示在BRCA1缺失腫瘤中靶向Shieldin與放化療療效之間存在協(xié)同關(guān)系[18]。因此，深入探討Shieldin復(fù)合物的分子間交互或旁路交互機制對BRCA1突變/缺失腫瘤的分類治療具有轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)意義。

Shieldin結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究的更新進一步提供了針對該復(fù)合物設(shè)計可藥靶的結(jié)構(gòu)位點。REV7的安全帶結(jié)構(gòu)是其與多種互作蛋白結(jié)合的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[23]。在SHLD3-REV7互作界面上，除了設(shè)計干擾REV7安全帶結(jié)構(gòu)從而促進SHLD3解綁的小分子調(diào)節(jié)劑外，最新研究提出SHLD3疏水性氨基酸殘基(38-FIPWF-42)覆蓋的REV7-β轉(zhuǎn)角界面，又稱為site-S，是一個更為理想的藥物靶位。由于site-S還部分存在于REV7-REV1互作界面，而靶向REV7-REV1互作，可以抑制跨損傷DNA合成(translesion DNA synthesis, TLS)帶來的基因組突變與放化療抵抗。因此，設(shè)計針對site-S的小分子藥物，實現(xiàn)NHEJ與TLS的雙重抑制而增強放化療敏感性，具有一定的應(yīng)用前景[22]。

6 結(jié)語與展望

Shieldin是近3年DNA損傷修復(fù)的新興熱點方向，其研究處于起步上升階段。我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[24]，中藥三萜類活性分子可以誘導(dǎo)DSBs，在抑制53BP1功能的同時上調(diào)細胞核內(nèi)RAD51的加載，提示三萜活性分子可以調(diào)控53BP1與RAD51互為拮抗的作用。作為53BP1下游直接阻斷RAD51加載的調(diào)控分子，Shieldin的發(fā)現(xiàn)對進一步在藥理學(xué)上闡明中藥活性分子干預(yù)兩種修復(fù)途徑轉(zhuǎn)換機制提供了新的科學(xué)依據(jù)。鑒于其結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度，特別是REV7構(gòu)象二聚體在調(diào)控Shieldin復(fù)合物活性發(fā)揮DSBs修復(fù)途徑的選擇性機制仍不明晰。同時，Shieldin對腫瘤生物學(xué)與放化療、靶向治療的響應(yīng)產(chǎn)生重要影響，對病人預(yù)后的評估提供新的參考或治療機遇，并在病人腫瘤樣本中證實Shieldin的臨床價值，開發(fā)特異性阻斷Shieldin復(fù)合物分子內(nèi)互作(C-REV7-SHLD3)或旁路互作(C-REV7-TRIP13或SHLD1-CST)的小分子調(diào)節(jié)劑可能為腫瘤的精準治療帶來曙光。此外，除了DSBs修復(fù)，Shieldin在抗體類別轉(zhuǎn)換重組、端粒保護以及停滯復(fù)制叉等其它生物學(xué)過程發(fā)揮重要功能[15]，是今后需要開辟與延續(xù)的研究方向。