王艷成， 黃升日， 董微巍， 申鵬飛， 樸春香

( 1.延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院， 吉林 延吉 133000； 2.吉林省和龍市工商業(yè)聯(lián)合會， 吉林 和龍 133400 )

超高溫堆肥作為一種新型堆肥技術(shù)，因其可加速有機(jī)物分解和縮短堆肥腐熟時間而受到廣大學(xué)者的關(guān)注[1-2].研究表明，微生物在堆肥過程中對堆肥品質(zhì)具有決定性作用[3-5].廖漢鵬等將極端嗜熱微生物菌劑添加在脫水污泥的超高溫堆肥中，經(jīng)過15～20 d超高溫好氧發(fā)酵處理實(shí)現(xiàn)了污泥(初始含水率為80%)的生物干化和高溫腐熟[6].Peng等利用極端的嗜熱菌劑顯著降低了堆體(新鮮雞糞和稻殼)中的N2O排放[7].由于超高溫堆肥環(huán)境(堆肥過程中的溫度高于100 ℃，堆肥時間超過6周)與普通環(huán)境不同，因此超高溫堆肥所產(chǎn)生的微生物種類、數(shù)目及其理化性質(zhì)(溫度、pH、含水率和C/N)與普通環(huán)境下產(chǎn)生的微生物種類、數(shù)目及其理化性質(zhì)有很大區(qū)別.目前，對超高溫堆肥過程中微生物類群變化的相關(guān)研究較少[8-10]，因此本文采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) - 變性梯度凝膠電泳(PCR - DGGE)方法對微生物群落組成進(jìn)行探討，并測定了超高溫堆肥過程中溫度、pH、含水率以及C/N等理化指標(biāo)的變化情況，以期為超高溫生境下畜禽類便的微生物資源的開發(fā)和利用提供參考.

1 材料與方法

1.1 堆置裝置與材料

自引發(fā)式堆肥裝置主體由兩層不銹鋼材料制成，如圖1所示.該裝置長、寬、高為5.5 m、4.2 m、2.0 m，裝置中層(保溫層)添加的是厚度為50 mm的聚氨酯.發(fā)酵過程中采用底部加壓通風(fēng)的方式(通風(fēng)管道直徑Φ=0.38 m)，利用重型設(shè)備移動和混合料堆.試驗(yàn)材料采用有機(jī)廢棄物(由牛糞、羊糞、馬糞、木屑組成)和全發(fā)酵堆肥，并按質(zhì)量比1∶1混合接種.

1.2 試驗(yàn)設(shè)計

利用圖1中的實(shí)驗(yàn)裝置設(shè)計高溫堆肥實(shí)驗(yàn).實(shí)驗(yàn)采用每周翻堆混勻工藝.實(shí)驗(yàn)中采用活性白土將堆體的含水率調(diào)整至60%，采用尿素將C/N調(diào)整至30，并進(jìn)行強(qiáng)制通風(fēng)供氧(曝氣量控制在0.1 L/min左右).采樣點(diǎn)設(shè)置為3個(圖1中a、b、c點(diǎn))，采樣時間為發(fā)酵的第7、14、21、28 d和35 d.在每個采樣點(diǎn)隨機(jī)采集3份樣品，且將采集的樣品混合均勻后再分裝3份，以此保證樣品的代表性.采集后的樣品立即放入液氮中并帶回實(shí)驗(yàn)室中保存(-70 ℃)備用.

圖1 自引發(fā)式堆肥裝置及采樣點(diǎn)示意圖

1.3 樣品分析

1.3.1堆體理化指標(biāo)的檢測

按文獻(xiàn)[11]中的方法測定a、b、c 采樣點(diǎn)樣品的溫度、pH值、含水率和C/N.

1.3.2樣品的DNA提取及PCR擴(kuò)增

取堆肥樣品各0.3 g，采用強(qiáng)力土壤DNA提取試劑盒(美國，MOBIO)提取基因組DNA，并將提取好的DNA用超純水稀釋20倍后繼續(xù)作擴(kuò)增實(shí)驗(yàn).采用引物GC - 341F(5′- CGC - CCG - CCG - CGC - GCG - GGC - GGG - GCG - GGG - GCA - CGG - GGG - GCC - TACGGGAGG - CAG - CAG - 3′)和907R(5′- CCG - TCA - ATT - CMT - TTR - AGT - 3′)對樣品的微生物DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增.PCR 反應(yīng)體系為： 2×Taq Master Mix 25 μL， 10 μmol/L 上下游引物各1 μL， DNA 1 μL， 雙蒸水22 μL， 共計50 μL.擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?95 ℃初始變性10 min， 93 ℃變性30 s， 65 ℃退火30 s， 60 ℃退火30 s， 55 ℃退火30 s， 25個循環(huán)， 72 ℃延伸8 min， 于4 ℃保存.擴(kuò)增目標(biāo)基因片段大小約為576 bp.

1.3.3變性梯度凝膠電泳(DGGE)的檢測

利用變性梯度凝膠電泳分離PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，使用DCodeTM通用突變檢測系統(tǒng)(Bio - Rad，Hercules，CA，USA)評估DGGE[12].變性梯度凝膠的制備方法為：在pH 7.4的20 mmol/L Tris緩沖液中加入0.5 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)和10 mmol/L醋酸鈉，制備過程所用的試劑為聚丙烯酰胺(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%～12%)、尿素(1.4～4.9 mol/L)和變性劑(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%～70%).制備出的變性梯度凝膠的長、寬、高分別為160 mm、60 mm、1 mm.凝膠制備完成后，將其放在20 mmol/L Tris緩沖液(pH 8.0)中電泳850 min(電壓為100 V，溫度為60 ℃)，然后利用SYBR Green I對凝膠染色30 min.染色完成后，利用凝膠影像分析系統(tǒng)觀察凝膠并拍照.采用Quantity One 軟件分析所拍攝的圖像.

1.3.4條帶回收及測序方法

將清晰單一的條帶進(jìn)行切割后溶于50 μL超純水(4 ℃)放置24 h，然后繼續(xù)PCR擴(kuò)增、DGGE電泳、切膠，直到條帶清晰并單一.切下處理好后的代表性條帶裝入1.5 mL離心管中，并按SK8131試劑盒方法回收目的DNA片段.取適量回收的DNA做模板并進(jìn)行PCR擴(kuò)增(擴(kuò)增條件及步驟同1.3.2方法)，然后將產(chǎn)物送至日本三島信息生物學(xué)中心進(jìn)行測序.利用DNA數(shù)據(jù)庫提供的DDBJ - Blast程序?qū)λ脳l帶進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析.

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用OriginPro 2021軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行計算、作圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 堆體溫度的變化情況

微生物生長繁殖的最適溫度為30～60 ℃.當(dāng)溫度高于65 ℃時，大多數(shù)微生物轉(zhuǎn)變?yōu)檠挎咝菝?，只有少部分嗜熱菌可以繼續(xù)存活[13].由圖2可知，堆體的溫度變化趨勢主要分為2個階段.第1階段為快速升溫期(0～7 d)， 3個采樣點(diǎn)的堆體溫度均在第7 d達(dá)到峰值，分別為91.0 ℃、104.0 ℃和50.0 ℃.其原因是好氧微生物能夠快速分解物料中的可降解有機(jī)物，并釋放能量，進(jìn)而快速提高堆體溫度.第2階段為緩慢降溫期(7～35 d)，該階段堆體溫度從峰值緩慢下降至略高于室溫.其原因是堆體中的有機(jī)物含量減少，使得微生物活性和熱量下降所致.

圖2 堆肥過程中的溫度變化情況

2.2 堆體的pH變化情況

圖3為堆肥過程中pH的變化.由圖3可以看出：在0～7 d，堆體的pH呈升高趨勢.其原因是在此過程中微生物進(jìn)行的是有氧呼吸，物料中的蛋白質(zhì)、尿素、尿酸等高氮有機(jī)物能夠快速降解，并產(chǎn)生大量銨態(tài)氮所致.在7～14 d，堆體的pH呈下降趨勢.其原因是在該階段嗜熱微生物進(jìn)行的是厭氧呼吸，由此產(chǎn)生了大量有機(jī)酸所致.在14～35 d，堆體的pH再次呈升高趨勢.其原因是在該階段嗜熱微生物代謝的是蛋白質(zhì)，進(jìn)而使堆肥的氨氮的含量不斷增加所致.在第35 d，各采樣點(diǎn)的pH值均高于8.0.

圖3 堆肥過程中的pH變化情況

2.3 堆體含水率的變化情況

由于微生物只能利用水溶性有機(jī)物進(jìn)行生長、代謝和繁殖，所以堆肥過程中需保持合適的含水率.由于含水率>65%時，含水率會影響堆料空隙中的空氣擴(kuò)散，進(jìn)而易形成厭氧環(huán)境(不利于堆肥發(fā)酵)，因此本試驗(yàn)用活性白土將堆體的含水率調(diào)整至60%.由圖4可以看出：在堆肥的整個過程中堆體的含水率總體呈逐漸下降趨勢，其中堆肥在7～14 d時堆體的含水率下降得最快，其主要原因是微生物在堆肥過程中產(chǎn)生了大量熱量，進(jìn)而加速了水分的蒸發(fā)所致.而在21～35 d時含水率下降得相對較為緩慢，其原因是溫度逐漸降低，水分蒸發(fā)變得緩慢.另外，3個采樣點(diǎn)的含水率為b點(diǎn)>a點(diǎn)>c點(diǎn).

圖4 堆肥過程中的含水率變化情況

2.4 堆體C/N的變化情況

C/N變化通常用于衡量堆肥腐熟度.堆肥腐熟時堆體的C/N值趨向于微生物菌體的C/N值(12左右).由圖5可以看出：堆體的C/N值隨堆肥時間呈逐漸下降趨勢，其中在0～7 d時下降得最快，且此時溫度和含水率均較高.當(dāng)堆肥時間為第35 d時C/N值達(dá)到12左右，由此可認(rèn)定堆肥發(fā)酵基本完成.

圖5 堆肥過程中的C/N值變化情況

2.5 條帶序列的DGGE譜圖分析

微生物總DNA的DGGE圖譜如圖6所示.圖中，條帶的數(shù)量越多表示樣品中微生物的種類越豐富，條帶越亮表示種類數(shù)量越多.從圖6可以看出：在整個堆肥過程中，條帶k、o、p、q為共有的優(yōu)勢菌群，表明這些菌群可能對堆肥起關(guān)鍵作用；條帶f、h、k、l、m的亮度隨著堆肥進(jìn)程的推進(jìn)而明顯增加，說明這幾種菌種的含量隨堆肥時間而逐漸提高；條帶a、b、c、e出現(xiàn)在28～35 d，說明這些菌種不適應(yīng)前期的超高溫環(huán)境，而適應(yīng)堆肥后期的堆體環(huán)境.另外，不同采樣點(diǎn)的菌群組成和數(shù)量也存在差異.在采樣點(diǎn)a和c， 條帶q在發(fā)酵前期含有的微生物數(shù)量較多，但在末期含有的微生物數(shù)量降低；在采樣點(diǎn)b， 在 7～14 d范圍內(nèi)無條帶q產(chǎn)生.

將圖6中的不同條帶切割后回收并對其DNA進(jìn)行測序.測序后的分析結(jié)果見表1.由表1可知，堆肥過程中共檢測出6個細(xì)菌門、8個綱(或者目)、17種不同種屬的細(xì)菌，其中在條帶h、m、 o、 p和q上檢測出的細(xì)菌與未培養(yǎng)堆肥細(xì)菌屬(Uncultured compost bacterium)、嗜熱鹽菌屬(Rhodothermussp.)、 熱桿菌屬(Thermaerobactercomposti)、嗜熱棲熱菌屬(Thermusthermophilus)和嗜熱球形桿菌(Sphaerobacterthermophilus)的相似性達(dá)到100%，其余條帶a、b、c、d、e、f、g、i、j、k、l、n分別與鞘脂桿菌(Sphingobacteriaceaebacterium)、類芽胞桿菌(Paenibacillussp.)、高溫放線菌(Thermoactinomycetaceaebacterium)、Alviniconchahesslerigillendosymbiont、鳥氨酸芽孢桿菌(Ornithinibacillussp.)、土芽孢桿菌(Geobacillussp.)、酸微菌(Acidimicrobiaceaebacterium)、Planifilumfimeticola、Planifilumyunnanense、馬氏酵母菌株(Rhodothermusmarinusstrain)和未培養(yǎng)的堆肥細(xì)菌(Uncultured compost bacterium)檢測出的微生物相似性均達(dá)90%以上.由以上可以看出，高溫堆肥過程中微生物呈多樣性，且有明顯的差異動態(tài)演替性.本文檢測出的上述微生物與文獻(xiàn)[14-15]中檢測到的微生物相類似，由此進(jìn)一步表明上述種類的微生物對極端環(huán)境具有較強(qiáng)的耐受性.

圖6 堆肥過程中微生物總DNA的DGGE圖譜

表1 DGGE條帶細(xì)菌16S rDNA部分基因序列比對分析

3 結(jié)論

對超高溫堆肥過程中的微生物類群變化和堆體的理化性質(zhì)(含水率、pH、溫度、C/N)進(jìn)行研究顯示：堆肥在35 d完成，堆肥過程中微生物呈多樣性，且不同微生物的相對含量有所差異；在堆肥過程中共測出6個細(xì)菌門(其中Firmicutes菌門為主要優(yōu)勢菌門)和17種不同種屬的細(xì)菌(其中嗜熱菌為主要優(yōu)勢菌屬).堆體的理化性質(zhì)隨微生物的類群變化而變化，其中除pH外其他指標(biāo)均隨堆肥時間呈下降趨勢.本研究結(jié)果可為超高溫堆肥畜禽糞便發(fā)酵菌種的篩選和功能菌劑的制備提供理論基礎(chǔ).在今后的研究中，我們將對超高溫堆肥過程中出現(xiàn)的嗜熱菌種進(jìn)行篩選和純化，以制備出更為優(yōu)良的超高溫堆肥復(fù)合工程菌劑.