張風(fēng)衛(wèi) 王珊珊 周紅娟 商學(xué)釵 蔡龍

浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市胸科醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)檢驗實驗中心 310003

近年來， 流感病毒跨物種感染成為流感防疫工作面臨的新挑戰(zhàn)，對人類健康造成重大影響[1-2]。接種疫苗是目前預(yù)防流感發(fā)生與傳播的最有效方法，但由于流感病毒表面蛋白易發(fā)生抗原漂移、重配，變異的流感病毒極易逃避免疫系統(tǒng)記憶，導(dǎo)致疫苗失效[3]，因此研制一種能夠應(yīng)對流感病毒快速變異的廣譜疫苗迫在眉睫。 近年來，以M2 蛋白為基礎(chǔ)的廣譜疫苗逐漸成為研究的熱點[4-8]。M2 蛋白在所有A 型流感病毒中非常保守， 可誘導(dǎo)產(chǎn)生CTL，在反應(yīng)中具有交叉保護(hù)能力，其作為流感廣譜疫苗的成分進(jìn)行研究具有潛在的意義和應(yīng)用前景。 本研究擬利用基因工程技術(shù)，將禽流感H7N9流感病毒特異性抗原M2 蛋白作為基礎(chǔ)蛋白，與高致病性禽流感H5N1 亞型膜蛋白HA 共表達(dá)，制備一種新型流感相關(guān)病毒樣顆粒（VLPs），為廣譜疫苗研究提供參考。

材料與方法

一、材料

昆蟲細(xì)胞Sf9 及培養(yǎng)基、大腸埃希菌DH10Bac、轉(zhuǎn)移載體 pFastDual、 桿粒轉(zhuǎn)染試劑 Cellfectin ⅡReagent 和轉(zhuǎn)染試劑 LipofectamineTM2000 購自Invitrogen 公司； 含 H5N1 的 HA 編碼序列的質(zhì)粒pVRC-H5N1 HA 由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市胸科醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)檢驗實驗中心保存； 含H7N9 M2基因的A 型流感病毒H7N9 M2 質(zhì)粒購自北京義翹神州科技有限公司；DNA Ligation Kit Ver.2.1， 限制性 內(nèi) 切 酶 EcoR Ⅰ 、Hind Ⅲ 、Kpn Ⅰ 、Xho Ⅰ 購 自TAKARA 公司； 質(zhì)粒提取試劑盒購自TIANGEN 公司； 桿粒提取試劑盒購自碧云天公司； 引物由Invitrogen 公司合成。

二、研究方法

1.重組穿梭載體的構(gòu)建

重組穿梭載體pFastBac Dual-H5N1 HA 的構(gòu)建：設(shè)計引物，引物序列：F：5'-CCGGAATTCATGGA GAAAATAGTGCTTCT-3'，R：5'-ACCAAGCTTTTA AATGCAAATTCTGCATT-3'， 以 pVRC-H5N1 HA 質(zhì)粒為模板，PCR 擴(kuò)增 HA 基因， 將 HA 基因克隆至pFastDual 的EcoRⅠ、HindⅢ位點之問，得到重組穿梭載體pFastBac Dual-H5N1 HA。

重組穿梭載體pFastDual-H5N1 HA-H7 M2 的構(gòu)建：設(shè)計引物，引物序列：F：5'-CCGCTCGAGATG AGTCTTCTAACCGAGGT-3'，R：5'-CGGGGTACCT TACTTCAGCTCTATGTTGA-3'， 以 A 型流 感 病 毒H7N9 M2 質(zhì)粒為模板，PCR 擴(kuò)增 H7N9 M2（H7 M2）基因， 將M2 基因克隆在載體pFastBac Dual p10 啟動子下的XhoⅠ、KpnⅠ位點之間，即得到重組穿梭質(zhì)粒pFastBac Dual-H5N1 HA-H7 M2。

2. 重組桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

轉(zhuǎn)座構(gòu)建重組桿狀病毒質(zhì)粒DNA H5N1 HAH7 M2 Bacmid： 參照 Invitrogen 公司的 Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)技術(shù)手冊，將構(gòu)建好的穿梭載體pFastBac Dual-H5N1 HA-H7 M2、pFastBac Dual 空載體（陰性對照）轉(zhuǎn)化DH10Bac 感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過含有卡那霉素（50 μg/mL）、慶大霉素（7 μg/mL）、四環(huán)素（10 μg/mL）、X-gal（100 μg/mL）和 IPTG（40 μg/mL）的LB 藍(lán)白斑篩選平板篩選后， 再經(jīng)含有卡那霉素（50 μg/mL）、慶大霉素（7 μg/mL）和四環(huán)素（10 μg/mL）LB 培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)， 用碧云天公司的桿粒提取試劑盒提取重組桿狀病毒質(zhì)粒H5N1 HA-H7 M2 Bacmid、control Bacmid（陰性對照）。

重組桿狀病毒質(zhì)粒通過Bac-to-Bac 系統(tǒng)操作手冊推薦的通用引物（pUC/M13 F + pUC/M13 R）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增鑒定。

3. 重組病毒以及假病毒顆粒的制備

Sf9 細(xì)胞用含10%胎牛血清的Grace’s 培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)， 用含無血清的Sf-900 ⅢSFM 培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)。 參考Invitrogen 公司的CellfectinⅡReagent轉(zhuǎn)染試劑說明， 將重組桿狀病毒質(zhì)粒H5N1 HA-H7 M2 Bacmid、control Bacmid （陰性對照） 轉(zhuǎn)染 Sf9 細(xì)胞，5 d 后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，即獲得重組桿狀病毒H5N1 HA-H7 M2 Baculoviruses（H5-M2 Bv）、control Baculoviruses（cBv）。

借助本實驗室流感假病毒包裝技術(shù)[3]，將pcDNA-Gag-pol、 pcDNA-GFP 和 pVRC-H5N1 HA三種質(zhì)粒在lipofect 2000 脂質(zhì)體介導(dǎo)下共轉(zhuǎn)染HEK 293/17 細(xì)胞， 培養(yǎng) 36~48 h 后收集上清，經(jīng)0.45 μmol/L 濾器過濾后即為只包含HA 膜蛋白的H5N1 HA 假病毒顆粒（H5N1 HA pp）。

4. H5-M2 Bv 滴度檢測及富集

參照Invitrogen 公司的Bac-to-Bac 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)操作說明，重組桿狀病毒質(zhì)粒在Cellfectin ⅡReagent 介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染對數(shù)生長期的Sf9 細(xì)胞， 培養(yǎng)5~7 d，待細(xì)胞出現(xiàn)感染病變（CPE）后收集上清液，獲得初代重組桿狀病毒（P0），測定滴度。 按病毒感染復(fù)數(shù)（MOI）值為0.1 感染懸浮培養(yǎng)的Sf9 細(xì)胞，72 h后收集上清，即為 1 代病毒（P1）；再次用 MOI＝0.1的P1 代病毒感染Sf9 細(xì)胞，72 h 后收集上清， 即為富集的2 代病毒（P2），測定病毒滴度備用。

5. 紅細(xì)胞凝集活性檢測

在96 孔U 型底血凝板上自左至右各孔加50 μL磷酸緩沖液 （PBS）。 自左側(cè)第 1 孔加 50 μL 病毒液（P3 代病毒上清及濃縮純化病毒，以H5N1 流感假病毒顆粒為陽性對照），混勻后，吸50 μL 至第2孔，依次倍比稀釋至第11 孔，混勻后吸取棄掉50 μL；第12 孔只加入為紅細(xì)胞對照。 最后，自右至左依次向各孔加入1%火雞紅細(xì)胞懸液50 μL， 振蕩均勻后，室溫下靜置30 min 后觀察血凝結(jié)果。

6. Western 印跡鑒定重組蛋白

VLPs 中蛋白的表達(dá)檢測： 用富集的重組桿狀病毒 HA-M2 Bv、cBv 分別感染 Sf9 細(xì)胞 （MOI=10），28 ℃培養(yǎng) 72 h，取懸液 5 000×g 離心 10 min以去除細(xì)胞碎片，收獲病毒液上清；取適量病毒液上清加入 5× PEG-8000 NaCl 溶液， 每 20 分鐘上下顛倒混合一次，共混合3~5 次，4 ℃放置過夜。第2 天取出，4 ℃，10 000×g 離心 50 min。 吸棄上清，加入適量的蛋白裂解液重懸病毒顆粒沉淀。 取適量裂解液行Western 印跡試驗，分別用H5N1 HA、H7N9 M2 一抗檢測 H5N1 HA、H7N9 M2 蛋白的表達(dá)。

昆蟲細(xì)胞中的蛋白表達(dá)檢測： 感染后的Sf9 細(xì)胞用細(xì)胞裂解液處理后，10 000 × g 離心 10 min，獲得細(xì)胞裂解液上清， 取細(xì)胞裂解液行Western 印跡試驗， 分別用H5N1 HA、H7N9 M2 一抗檢測H5N1 HA、H7N9 M2 蛋白的表達(dá)。

7. 電鏡觀察VLPs

取適量PEG8000 濃縮純化的VLPs， 適當(dāng)稀釋后取少量滴在支持膜的銅網(wǎng)上， 使用加速電壓為80 kV 的透射電子顯微鏡 （TECNAI 12, FEI,Blackwood, NJ）觀察 VLPs。

結(jié) 果

一、 重組桿狀病毒質(zhì)粒 H5N1 HA-H7 M2 Bacmid 的構(gòu)建和鑒定結(jié)果

重組桿狀病毒質(zhì)粒H5N1 HA-H7 M2 Bacmid的構(gòu)建示意圖如圖1所示。 穿梭質(zhì)粒pFastDual-H5N1 HA-H7 M2 轉(zhuǎn)化大腸埃希菌 DH10Bac，經(jīng)LB藍(lán)白斑篩選平板篩選，白色克隆為轉(zhuǎn)座成功的陽性菌落，如圖1所示。 重組桿狀病毒質(zhì)粒經(jīng)PCR 擴(kuò)增鑒定，PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，大小為4 558 bp，如圖1，可用于轉(zhuǎn)染Sf 9 細(xì)胞。

圖1 重組桿狀病毒質(zhì)粒H5N1 HA-H7 M2 Bacmid 的構(gòu)建與鑒定

二、 重組桿狀病毒H5-M2 Bv 滴度測定結(jié)果及Western 印跡鑒定重組蛋白

初代H5-M2 Bv 滴度約為106~107pfu/mL，病毒經(jīng)過兩輪富集后滴度達(dá)到108pfu/mL 以上。HA-M2 Bv感染Sf9 細(xì)胞，72 h 后取細(xì)胞及上清鑒定H5N1 病毒 HA 和 H7N9 病毒 M2 蛋白的表達(dá)。 經(jīng) H5N1 HA抗體檢測， 在相對分子質(zhì)量為72 000~80 000 處有特異條帶，HA1 蛋白大小約 50 000，HA2 蛋白大小約30 000； 病毒液上清中也可以檢測到與HA 抗體特異結(jié)合的蛋白帶 (略小于細(xì)胞裂解液中的蛋白大小)，陰性對照組（cBv 感染組）在相同位置無特異帶（圖2）；H7N9 M2 抗體檢測發(fā)現(xiàn)， 在 10 000~15 000 處有特異條帶，收集的細(xì)胞裂解液及病毒液上清中可以檢測到特異性條帶，而陰性對照在相同位置無特異帶（圖2）。

圖2 重組桿狀病毒蛋白的蛋白印跡鑒定

三、VLPs 血凝活性檢測

將收獲的P3 代病毒液上清及富集的VLPs 上清行紅細(xì)胞血凝試驗， 觀察到P3 代病毒液上清VLPs 有與流感H5N1 假病毒顆粒相近的血凝活性。

四、流感VLPs 的形態(tài)觀察

通過透射電鏡觀察， 在富集的VLPs 上清液中存在形態(tài)不規(guī)則、大小與流感病毒相似的病毒樣顆粒，以圓形和橢圓形為主，直徑70~80 nm（圖3）。

圖3 病毒樣顆粒透射電鏡圖（×59 000）

討 論

VLPs 可作為一種新型流感疫苗， 與傳統(tǒng)禽流感疫苗生產(chǎn)方法相比，它具有諸多優(yōu)勢[9-13]：（1）產(chǎn)生的病毒顆粒本身不具有傳染性， 生物安全性高；（2） 采用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)制備， 產(chǎn)能高；（3）VLPs 可以以天然構(gòu)象和模式提呈抗原，能誘導(dǎo)較強的體液免疫和細(xì)胞免疫。 在本研究中，借助Bac-to-Bac 桿狀病毒系統(tǒng)在Sf9 昆蟲細(xì)胞中表達(dá)了2 株禽流感病毒的部分結(jié)構(gòu)蛋白： 高致病性禽流感H5N1血凝素HA 蛋白和禽流感H7N9 M2 結(jié)構(gòu)蛋白。通過電鏡觀察發(fā)現(xiàn)上清存在類似流感病毒的顆粒，說明來自2 株亞型流感病毒的結(jié)構(gòu)蛋白可以重配組裝成流感VLPs。 Western 印跡試驗同樣證明了2 種結(jié)構(gòu)蛋白在Sf9 細(xì)胞及其上清中的表達(dá)，H5N1 HA 在昆蟲細(xì)胞中同樣可以成功將HA0 前體切割為為HA1 和HA2 二聚體， 并沒有影響病毒顆粒的成功包裝， 而且包裝出的VLP 具有一定的生物活性，比如可以使紅細(xì)胞發(fā)生凝集。 此外，本研究使用了本實驗室流感假病毒包裝平臺技術(shù)制作的高致病性禽流感假病毒顆粒作為對照[14-15]，相比之下，通過昆蟲細(xì)胞表達(dá)的VLP 在蛋白表達(dá)及血凝試驗中表現(xiàn)出了與禽流感假病毒相似的生物活性。

綜上，本研究中來自2 株亞型禽流感的結(jié)構(gòu)蛋白可以通過桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在昆蟲細(xì)胞中組成成熟的流感VLPs，且表達(dá)的結(jié)構(gòu)具有與流感病毒相似的生物活性。 今后可基于此項研究探索多株禽流感病毒抗原蛋白的VLP 疫苗的制備，并進(jìn)行相關(guān)動物試驗驗證， 以期望制備一種有效的廣譜禽流感VLP 疫苗，用于禽流感的防治。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突