程瑤佳，唐朝生，劉 博，泮曉華，王殿龍，呂 超，李 昊

南京大學(xué) 地球科學(xué)與工程學(xué)院，南京 210023

微生物誘導(dǎo)碳酸鈣沉積（Microbial Induced Calcite Precipitation，簡稱MICP）技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種新型土體改良技術(shù)。微生物分泌的脲酶水解尿素產(chǎn)生碳酸根離子，與土體中的鈣離子結(jié)合，生成具有膠結(jié)作用的碳酸鈣，從而粘結(jié)土顆粒，填充土體孔隙，達(dá)到改善土體物理力學(xué)性質(zhì)的目的（Haouzi et al., 2018; Liu et al., 2019; Jiang et al., 2020）。相比于傳統(tǒng)的土體改良技術(shù)，該技術(shù)具有生態(tài)環(huán)保、經(jīng)濟(jì)高效、對土體擾動小的優(yōu)勢（錢春香等，2015; 李明東等，2016；Choi et al., 2017）。因此，近年來引起了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，并圍繞改性土體的工程性質(zhì)進(jìn)行了廣泛研究。

微生物固化土體的影響因素眾多，菌液濃度、營養(yǎng)液成分、反應(yīng)溫度和pH等對固化效果的影響不容忽視。梁仕華等（2018）分別選用氯化鈣和硝酸鈣作為營養(yǎng)液中的鈣源，發(fā)現(xiàn)硝酸鈣的微生物固化效果較氯化鈣更好。彭劼等（2018）通過MICP水溶液試驗和一維砂柱加固試驗發(fā)現(xiàn)，在10~30℃范圍內(nèi)，相對低溫條件下，鈣離子消耗量大，砂柱固化效果更好。李成杰等（2018）探究了氯化鈣、醋酸鈣、乳酸鈣、葡萄糖酸鈣四種不同鈣源及Ca2+濃度對MICP的影響，結(jié)果表明，氯化鈣作為鈣源生成的碳酸鈣晶體最穩(wěn)定，其濃度為0.25 M時，碳酸鈣沉積效率最高。Jiang等（2019）研究發(fā)現(xiàn)0.2 M和1.0 M膠結(jié)液濃度條件下，微生物固化砂土邊坡提高其抗侵蝕性的效果最好，而2.0 M的膠結(jié)液改性效果較差。Cheng等（2014）研究不同因素對微生物固化砂土效果的影響，結(jié)果表明，較高的土體初始干密度，室溫和中性條件下，膠結(jié)的砂柱強度較好。Zhang等（2014）通過單軸抗壓強度試驗和微觀形態(tài)分析，研究表明，以醋酸鈣作為鈣源比以氯化鈣和硝酸鈣作為鈣源處理的砂柱強度更高，用醋酸鈣處理生成的碳酸鈣晶體類型主要為文石，用其他兩種鈣源處理生成的主要為方解石。在微生物誘導(dǎo)碳酸鈣沉積過程中，微生物作為成核位點，吸引大量鈣離子積聚在細(xì)胞表面，使得碳酸鈣沉淀得以產(chǎn)生（Whiffin et al., 2007）。因此，鈣源的種類對微生物誘導(dǎo)碳酸鈣沉積的效果有十分重要的影響。

目前，MICP技術(shù)多用鈣鹽（如CaCl2、Ca(NO3)2、Ca(CHCOO)2）等作為鈣源，其中應(yīng)用最廣泛的為CaCl2，其價格昂貴，具有腐蝕性，且對環(huán)境有污染（Dejong et al., 2006; Cheng et al., 2014）。因此，尋找一種成本低、污染小的鈣源具有十分重要的意義。石灰石粉是一種廉價而豐富的材料，可以從廢棄建筑材料和采石場中大量獲得，如能將其成功應(yīng)用于MICP中，將大大節(jié)約成本和提高環(huán)保性（楊華山等，2006；馬燁紅等，2007；劉數(shù)華和閻培渝，2008）。

為此，本文提出利用石灰石粉成為鈣源，用于微生物誘導(dǎo)碳酸鈣沉積作用來固化土體。通過加入乙酸溶解石灰粉釋放鈣離子，作為微生物固化土體過程的鈣源。通過開展無側(cè)限抗壓強度試驗，微觀結(jié)構(gòu)的掃描電鏡觀察、碳酸鈣含量測定等測試分析，對將石灰石作為取鈣源用于微生物固化土體的可行性進(jìn)行驗證。同時，與氯化鈣和醋酸鈣進(jìn)行對比，探討不同鈣源對改性土體力學(xué)特性和微觀結(jié)構(gòu)的影響，分析其固化機(jī)制和固化效果。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 石灰石粉

本文所用石灰石粉為重質(zhì)碳酸鈣，由天然石灰石磨碎而成。表1為所用石灰石粉成分表，其中碳酸鈣含量達(dá)到98.5%以上。

表1 石灰石粉成分表Table 1 Table of limestone powder composition

1.1.2 砂

本文所用砂為石英質(zhì)河砂，砂的比重為2.65，內(nèi)摩擦角為43°。試驗前將砂過0.25 mm和2 mm篩，經(jīng)過顆分試驗得到砂的不均勻系數(shù)Cu為1.78，曲率系數(shù)Cc為1.05，為級配不良砂。

1.2 樣品制備與處理

1.2.1 鈣源的提取與制備

鈣離子通過石灰石粉和乙酸溶液反應(yīng)獲得，其化學(xué)原理見式（1）。為了確定石灰石粉和乙酸溶液反應(yīng)的最優(yōu)配比（w：v），試驗共設(shè)置五組1：1、1：2、1：4、1：6和1：8不同配比的反應(yīng)溶液。將20 g石灰石粉分別與不同體積的20%濃度醋酸溶液混合，在室溫（30℃）下反應(yīng)3 d后，對生成物進(jìn)行過濾，取上清液，用鈣離子計測定其鈣離子濃度。取鈣離子濃度最大時的配比作為最優(yōu)配比，進(jìn)行后續(xù)鈣離子的提取。之后，參照最優(yōu)配比，將足量的石灰石粉和對應(yīng)體積的20%濃度醋酸溶液混合。充分反應(yīng)后，取上清液測定反應(yīng)后的pH，并用250 g/L NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液的pH至6.96，再次測定溶液的鈣離子濃度。之后，將溶液稀釋至鈣離子濃度為0.5 M，作為最終石灰石粉提取鈣源，以待后續(xù)試驗。

1.2.2 細(xì)菌與培養(yǎng)基

試驗所用菌株為巴氏芽孢八疊球菌（Sporosarcina pasteurii, ATCC 11859），購自美國菌種保藏中心。該菌為為化能異養(yǎng)型革蘭氏陽性菌，產(chǎn)生的脲酶具有較高的活性，其在巖土工程領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，具有代表性。試驗采用NH4-YE液體培養(yǎng)基，每升（L）含酵母提取物20 g，硫酸銨10 g和三羥甲基氨基甲烷（Tris-base，pH=9.0）15.75 g。培養(yǎng)基配置完成后，在高壓滅菌鍋內(nèi)120 ℃高溫滅菌30 min。待培養(yǎng)基冷卻，將菌液以3：100的比例接種至培養(yǎng)基。之后，在30℃恒溫震蕩培養(yǎng)箱中以150轉(zhuǎn)/分的速度震蕩培養(yǎng)24 h。用分光光度計測得菌液的OD600值為1.68，同時用電導(dǎo)率儀測得其脲酶活性為3.85 mM urea hydrolysed/min。

1.2.3 膠結(jié)液配制

膠結(jié)液包括尿素（0.5 M），鈣源（0.5 M）和營養(yǎng)肉湯（3 g/L），主要用于為MICP過程提供Ca2+和CO32-，以及為細(xì)菌的新陳代謝和生長繁殖提供充足的營養(yǎng)物質(zhì)。為探究不同鈣源的影響，同時由于乙酸根離子可以很容易地被自然微生物降解，對環(huán)境的負(fù)面影響較小。本文采用了醋酸鈣、氯化鈣和石灰石提取鈣源作為鈣源，分別進(jìn)行了試驗。

1.2.4 土樣制備

試驗所用制備砂柱的模具為高72 mm，直徑36 mm，厚度1 mm的多孔塑料軟管，孔直徑和孔間距均為5 mm，軟管外圍包裹一層紗布以防漏砂。制樣時，稱取一定質(zhì)量的砂裝入模具中，控制砂柱干密度為1.52 g/cm3。在模具底部和頂部分別放置一塊透水石，透水石用紗布包裹，以保證后續(xù)浸泡過程菌液和膠結(jié)液能夠順利入滲，同時防止砂顆粒流失，試驗砂柱模型如圖1所示。本次試驗共制備3組砂柱試樣，每組試樣包含3個平行樣。

圖1 試驗砂柱模型Fig. 1 Sand pillar model of test

1.2.5 MICP處理

將制備好的試樣在菌液中浸沒30 min，以保證試樣飽和和細(xì)菌充分定植。之后將三組試樣分別轉(zhuǎn)移入石灰石粉提取鈣源、氯化鈣和醋酸鈣三種不同鈣源的膠結(jié)液中，并確保試樣被完全浸沒，浸泡過程如圖2所示。在30℃恒溫條件下養(yǎng)護(hù)7 d之后，將試樣取出置于室內(nèi)風(fēng)干15 d直至試樣質(zhì)量不再變化，室內(nèi)溫度控制在30±1℃，相對濕度控制在50±5%。完成第一輪膠結(jié)后，更換模具外圍和透水石四周的紗布，防止紗布上沉積的碳酸鈣影響后續(xù)溶液的入滲，之后重復(fù)上述步驟，共進(jìn)行3輪膠結(jié)。

圖2 試樣浸泡過程Fig. 2 Process of sample soaking

1.3 試驗方法

1.3.1 無側(cè)限抗壓強度試驗

為評價MICP處理后固化砂柱的力學(xué)特性，對試樣開展無側(cè)限抗壓強度試驗。試樣養(yǎng)護(hù)完成后進(jìn)行拆模，并用去離子水清洗試樣以去除殘余鹽分。將試樣放入烘箱烘干后，進(jìn)行無側(cè)限抗壓強度試驗。將試樣放在試驗機(jī)平臺上，調(diào)整平臺位置，使試樣和上部加載板剛好接觸后，開始試驗，軸向應(yīng)變加載速率為1 mm/min，并記錄量力環(huán)變形和位移值，直到試樣破壞。

1.3.2 碳酸鈣含量測定試驗

用酸洗法測定試樣碳酸鈣含量，其化學(xué)原理見式（2）。取破壞后未壓碎的砂塊，稱其質(zhì)量為m1，用研缽研磨粉碎后，加入燒杯中，為保證試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，每組選取的砂塊質(zhì)量均為20 g左右。再用5 M的鹽酸溶液浸泡，直至沒有氣泡產(chǎn)生，視為碳酸鈣完全溶解。將反應(yīng)后的砂樣用去離子水清洗，烘干后，稱砂樣質(zhì)量為m2（g）。碳酸鈣含量λ（%）可用式（3）計算得到。

1.3.3 掃描電鏡試驗

為分析試樣的微觀結(jié)構(gòu)特征，對試樣進(jìn)行掃描電子顯微鏡（SEM）試驗。在對試樣開展無側(cè)限抗壓強度試驗后，選取一些典型塊狀樣品用于SEM觀測。本文選用的掃描電鏡型號是ZEISS Sigma 500。

2 結(jié)果與討論

2.1 鈣源提取

圖3為在不同石灰石粉和乙酸溶液配比（W：V）下，反應(yīng)后溶液中的鈣離子濃度。從圖中可以看出，在1:1，1:2，1:4和1:6配比下，鈣離子濃度隨著配比的減小而略有減小，但相差不大，基本維持在1.99左右。而在1:8配比下，鈣離子濃度顯著減小，僅為1.41 M，這主要是因為乙酸溶液過量，溶液體積增大。為獲得較高的鈣離子濃度，并避免石灰石粉的浪費，試驗確定1:6的石灰石粉和乙酸溶液配比為最優(yōu)配比，在此配比下進(jìn)行后續(xù)鈣源的提取。

圖3 不同配比（W：V）下反應(yīng)溶液中鈣離子濃度Fig. 3 Concentration of calcium ion in reaction solution under different proportioning (W:V)

2.2 無側(cè)限抗壓強度

無側(cè)限抗壓情況下不同鈣源固化砂柱的應(yīng)力—應(yīng)變曲線見圖4。從圖中可以看出：不同鈣源固化的砂柱表現(xiàn)出了相似的曲線特征，在加載前期，砂柱內(nèi)的孔隙逐漸被壓密，曲線呈現(xiàn)緩慢增長。隨后，應(yīng)力隨應(yīng)變線性快速增加，達(dá)到峰值后，應(yīng)變繼續(xù)增加，應(yīng)力急劇減小到零，呈現(xiàn)典型的脆性破壞模式。

圖4 三組試樣的應(yīng)力-應(yīng)變曲線Fig. 4 Stress-strain curves of three soil samples

圖5展示了不同鈣源固化砂柱的平均無側(cè)限抗壓強度。醋酸鈣固化砂柱的無側(cè)限抗壓強度略高于石灰石粉提取鈣源固化砂柱。而氯化鈣固化砂柱的無側(cè)限抗壓強度遠(yuǎn)低于前兩者，僅為2.49 MPa，是醋酸鈣固化砂柱的一半。這一研究結(jié)果與Zhang等（2014）的研究結(jié)果一致，即醋酸鈣和石灰石粉提取鈣源試樣的強度高于氯化鈣試樣的強度。

圖5 三組試樣無側(cè)限抗壓強度Fig. 5 Unconfined compression strengths of three soil samples

圖6為不同鈣源固化砂柱的表觀圖和破壞形態(tài)。觀察圖6a、c和e固化砂柱的表觀圖可以看出，醋酸鈣和石灰石鈣源固化砂柱的表面較光滑，孔隙少，而氯化鈣固化砂柱的表面較粗糙，可見明顯砂顆粒，孔隙較多。其原因是醋酸鈣和石灰石鈣源條件下產(chǎn)生的碳酸鈣較多，填充了砂柱與模具接觸的孔隙以及表面砂顆粒間的孔隙，因而其強度也更高。從圖6b、f中可以看出，醋酸鈣和石灰石鈣源固化砂柱的破壞主要發(fā)生在薄弱區(qū)，而其他部分仍然保持完整，試樣的整體性較高。觀察圖6e，氯化鈣固化砂柱破壞后的殘余砂塊較小，試樣整體發(fā)生破壞。這主要是由于氯化鈣條件下，碳酸鈣產(chǎn)量更小，試樣的強度低，松散度高，完整性差。

圖6 砂柱表觀圖和破壞形態(tài)Fig. 6 Sand column view and damage morphology

2.3 碳酸鈣產(chǎn)量

學(xué)界普遍認(rèn)為，評價微生物固化土體效果的重要指標(biāo)之一是微生物誘導(dǎo)生成的碳酸鈣含量。圖7為三組試樣中各個平行樣的平均碳酸鈣含量。如圖所示，同一組試樣的碳酸鈣相差不大。醋酸鈣和石灰石粉提取鈣源固化砂柱的平均碳酸鈣含量分別為16.6%和17.1%，二者相差不大，氯化鈣固化砂柱中碳酸鈣含量最少，僅為13.4%。醋酸鈣和石灰石粉提取鈣源的產(chǎn)量更高，說明二者作為鈣源與巴氏芽孢八疊球菌的生物化學(xué)反應(yīng)更加充分。

圖7 三組試樣的碳酸鈣含量Fig. 7 Calcium carbonate content of three soil samples

圖8給出了各組試樣的平均碳酸鈣含量以及無側(cè)限抗壓強度。從圖中可以看出，不同鈣源固化砂柱的碳酸鈣含量和無側(cè)限抗壓強度基本呈正相關(guān)關(guān)系，這與以往的研究結(jié)果相似（Cheng et al., 2014; 梁仕華等，2018）。

圖8 不同鈣源對碳酸鈣含量和無側(cè)限抗壓強度的影響Fig. 8 Influence of different calcium on calcium carbonate content and unconfined compression strengths

2.4 微觀結(jié)構(gòu)

為探究不同鈣源對微生物固化砂柱微觀結(jié)構(gòu)的影響，選取試樣的SEM圖像進(jìn)行分析，如圖9所示。觀察30倍放大條件下的SEM圖像可以看出，醋酸鈣固化砂柱中砂土顆粒的表面和接觸點間均沉積大量碳酸鈣，土體結(jié)構(gòu)較致密。碳酸鈣主要通過沉積在砂土顆粒接觸點之間，聯(lián)結(jié)相鄰的土顆粒，從而促進(jìn)土顆粒的膠結(jié)，土體完整性上升，強度提高（Van Paassen et al., 2009; Soon et al., 2013, 2014; Cheng et al., 2016; 季斌等, 2017）。而氯化鈣作為鈣源固化的砂柱中，砂土顆粒表面和孔隙間沉積的碳酸鈣較醋酸鈣少，存在更多的土顆粒接觸處以及土顆粒表面未被碳酸鈣覆蓋。石灰石鈣源固化砂柱中，砂土顆粒表面和顆粒之間亦形成了大量的碳酸鈣沉積。

圖9 不同鈣源在不同放大倍數(shù)下的SEM圖像Fig. 9 SEM photos of of different calcium sources at different magnification

從200~1000倍放大條件下的SEM圖像中可以看出，以醋酸鈣作為鈣源，利用巴氏芽孢桿菌誘導(dǎo)生成的碳酸鈣晶體主要為薄片狀堆疊的方解石。氯化鈣誘導(dǎo)生成的碳酸鈣晶體主要為六面體狀的方解石。利用石灰石鈣源誘導(dǎo)生成的晶體亦為薄片狀堆疊的方解石型碳酸鈣，但其尺寸和致密性略小于醋酸鈣誘導(dǎo)生成的碳酸鈣晶體。

對石灰石鈣源固化砂柱試樣的位置1和位置2（圖9）進(jìn)行EDS元素分析，試驗結(jié)果如圖10所示。位置1的主要元素為O、Si和C（圖10a），這主要是由于該處位置為砂土顆粒以及少量CH3COO-。位置2的主要元素為O、C和Ca，驗證了該位置處大量碳酸鈣沉淀的存在。

圖10 石灰石鈣源固化砂柱試樣的EDS圖Fig. 10 EDS photos of sand column sample treated by calcium source from limestone

從以上結(jié)果可以看出，醋酸鈣和石灰石鈣源固化砂柱的性質(zhì)類似。這是由于利用石灰石粉提取鈣源過程中使用的是醋酸提取石灰石粉中的鈣離子，生成的鈣源主要為醋酸鈣，故二者性質(zhì)類似。而醋酸鈣和氯化鈣誘導(dǎo)生成不同的形狀的方解石型碳酸鈣，這是因為微生物誘導(dǎo)碳酸鈣沉積過程中，鈣源作為重要的反應(yīng)物，對于生成的碳酸鈣晶體形貌有一定的影響（李沛豪等，2010; Liu et al., 2017）。由此可見，不同的鈣源主要通過影響微生物成礦過程的晶型晶貌、晶體含量、晶體分布及膠結(jié)特征來改變固化效果。

3 結(jié)論

本文將石灰石粉提取鈣源用于微生物固化土體反應(yīng)，通過開展無側(cè)限抗壓強度試驗，對石灰石鈣源固化砂柱的力學(xué)特性進(jìn)行研究，并與醋酸鈣和氯化鈣鈣源進(jìn)行對比，結(jié)合不同鈣源固化砂柱的碳酸鈣產(chǎn)量和微觀結(jié)構(gòu)的分析，得到以下主要結(jié)論：

（1）將石灰石粉提取鈣源用于微生物誘導(dǎo)碳酸鈣固化土體是可行的，甚至優(yōu)于傳統(tǒng)的鈣源，固化砂柱的強度和碳酸鈣含量較高，結(jié)構(gòu)致密，完整性高。

（2）不同鈣源固化砂柱的力學(xué)特性不同。三者均呈典型的脆性破壞模式，但醋酸鈣固化砂柱的無側(cè)限抗壓強度略高于石灰石鈣源固化砂柱，而氯化鈣固化砂柱的無側(cè)限抗壓強度遠(yuǎn)低于前兩者。氯化鈣固化砂柱破壞后的完整性低于其他兩者。

（3）不同鈣源固化砂柱的碳酸鈣含量不同。醋酸鈣和石灰石鈣源固化砂柱的碳酸鈣含量相差不大，氯化鈣固化砂柱中碳酸鈣含量更少。不同鈣源固化砂柱的碳酸鈣含量和無側(cè)限抗壓強度基本呈正相關(guān)關(guān)系。

（4）醋酸鈣和石灰石鈣源固化砂柱中砂土顆粒的表面和接觸點間均沉積大量碳酸鈣，碳酸鈣晶體主要為薄片狀堆疊的方解石。氯化鈣固化砂柱中碳酸鈣沉積量低于前兩者，碳酸鈣晶體主要為六面體狀的方解石。

（5）不同的鈣源主要通過影響微生物成礦過程的晶型晶貌、晶體含量、晶體分布及膠結(jié)特征來改變固化效果。