樊 麗，張建東，劉德娟，徐吉榮，劉雪梅，孫明軍，孫翔翔，樊曉旭，田莉莉，邵衛(wèi)星，孫淑芳，劉蒙達(dá)

（1.泰安市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，山東泰安 271000；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東泰安 271000；3.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；4.泰山護(hù)理職業(yè)學(xué)院，山東泰安 271000）

布魯氏菌?。╞rucellosis，簡(jiǎn)稱(chēng)布?。┦且环N流行范圍廣、危害嚴(yán)重的人獸共患病。目前有60多種動(dòng)物可以作為布病儲(chǔ)存宿主。該病一年四季均可發(fā)生，流產(chǎn)為其典型發(fā)病癥狀[1]。該病曾在20世紀(jì)50 至70 年代在國(guó)內(nèi)大范圍流行，此后經(jīng)過(guò)嚴(yán)格控制，在80 年代保持了較低流行率[2]。然而，從90 年代開(kāi)始該病發(fā)病率又明顯上升，現(xiàn)在已成為影響畜牧業(yè)和公共健康的重要危害之一[3]。目前我國(guó)大陸地區(qū)的所有省級(jí)地區(qū)都有布病病例報(bào)道[4]。

在布病流行嚴(yán)重的地區(qū)，往往采用疫苗免疫進(jìn)行防控。目前主要使用A19、S2 和M5 等弱毒株活疫苗。其中A19 弱毒株疫苗被廣泛采用，其有效期長(zhǎng)，使用6×109CFU 活菌的標(biāo)準(zhǔn)計(jì)量或稀釋10 倍劑量的疫苗預(yù)防牛布病，均可以達(dá)到較好的免疫效果，免疫有效期可達(dá)72 個(gè)月[5]。A19 疫苗株與國(guó)際上普遍使用的S19 疫苗株同源性非常高，而后者是目前世界公認(rèn)的防控奶牛布病最有效的疫苗株[6]。

病原分離是診斷布病的金標(biāo)準(zhǔn)，但病原分離率低，分離條件嚴(yán)格，不便于普遍應(yīng)用[7]。血清學(xué)診斷是布病篩檢和確診的主要臨床診斷方法。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)》（GB 18646—2018）中的免疫學(xué)檢測(cè)方法包括虎紅平板凝集、試管凝集、間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（iELISA）、競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（cELISA）和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)等。其他免疫學(xué)檢測(cè)方法包括膠體金和熒光偏振。病原學(xué)檢測(cè)方法包括PCR 和qPCR。

疫苗在提供保護(hù)的同時(shí)，也為布病的確診增加了困難[8]。由于缺乏便捷有效的區(qū)別診斷方法，免疫牛群中自然感染牛和免疫陽(yáng)性牛很難區(qū)分[9]。本研究針對(duì)某免疫過(guò)A19 株疫苗的奶牛場(chǎng)，采用多種檢測(cè)方式開(kāi)展平行檢測(cè)。通過(guò)比較多種方法的檢測(cè)結(jié)果，分析該場(chǎng)是否存在野毒感染，同時(shí)比較不同方法的檢測(cè)特性。

1 材料與方法

1.1 奶樣、血清樣品

40 份血清樣品和40 份牛奶樣品，于2020 年5 月收集自某奶牛場(chǎng)4 頭未免疫奶牛和36 頭免疫A19 株疫苗的奶牛。奶牛年齡、胎次以及距離最后一次免疫時(shí)間詳見(jiàn)表1。

表1 采樣奶牛年齡、胎次等背景信息

1.2 試劑

布病虎紅平板凝集和試管凝集試驗(yàn)抗原，購(gòu)自青島立見(jiàn)生物科技有限公司；A19 株疫苗，為新疆天康畜牧生物有限公司生產(chǎn)的活毒疫苗；布病iELISA 試劑盒（批號(hào)20191008），購(gòu)自愛(ài)德仕公司；cELISA 試劑盒（批號(hào)20191022）、布病抗體瓊擴(kuò)法檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20190812），購(gòu)自西班牙INGENASA 公司；間接法布病抗體膠體金試紙條，購(gòu)自青島瑞爾唯特生物技術(shù)有限公司；熒光定量PCR 引物和探針，購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。

1.3 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法

虎紅平板凝集試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)、cELISA、iELISA，均按照國(guó)標(biāo)（GB 18646—2018）操作。

1.4 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)

抗體瓊脂擴(kuò)散（瓊擴(kuò)）試驗(yàn)基于布魯氏菌野毒株和疫苗株的表面抗原差異，可區(qū)分被檢動(dòng)物是否存在野毒感染[10]。血清中抗體與相應(yīng)抗原在瓊脂膠中擴(kuò)散，相遇后會(huì)結(jié)合形成沉淀線(xiàn)。試劑中的抗原包含一種布魯氏菌中普遍存在的脂多糖（LPS）和一種野毒株表面的多糖類(lèi)半抗原（NH）。檢測(cè)時(shí)，在瓊脂膠中央孔里加入抗原，在周邊孔中加入陰陽(yáng)性對(duì)照和血清樣品，室溫靜置24～48 h。若無(wú)沉淀線(xiàn)且對(duì)照成立，則認(rèn)為動(dòng)物無(wú)感染或免疫；若只出現(xiàn)LPS 的沉淀線(xiàn)，則被檢動(dòng)物很可能僅免疫未感染；若出現(xiàn)兩條沉淀線(xiàn)，則認(rèn)為被檢動(dòng)物存在野毒感染。

1.5 膠體金試紙條檢測(cè)法

吸取5 μL 血清樣品滴入間接法膠體金試紙條加樣孔中，10～20 min 觀(guān)察結(jié)果。當(dāng)對(duì)照線(xiàn)和檢測(cè)線(xiàn)同時(shí)出現(xiàn)，則認(rèn)為樣品為陽(yáng)性。另用相同試紙條檢測(cè)牛奶樣品，方法同上。

1.6 病原學(xué)檢測(cè)

1.6.1 引物 采用熒光定量PCR（qPCR，探針?lè)ǎ?duì)牛奶中布魯氏菌進(jìn)行檢測(cè)。首先建立布魯氏菌屬（BSSP）和牛種布魯氏菌（BA）的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。BSSP 作為通用引物，可檢測(cè)所有種的布魯氏菌，起到雙重檢測(cè)目的，從而保證陽(yáng)性結(jié)果的準(zhǔn)確性。引物信息詳見(jiàn)表2。

表2 qPCR 引物

1.6.2 奶樣處理 吸取10 mL 采集的奶液加入3%檸檬酸鈉-磷酸緩沖液，振蕩混勻，3 000 r/min 離心30 min；用移液器將表層脂類(lèi)及上清棄去，留下沉淀；加入PBS 緩沖液（pH7.6），振蕩混勻，轉(zhuǎn)移至1.5 mL 離心管中，12 000 r/min 離心10 min，棄上清，將沉淀保留下來(lái)；按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作提取核酸，反應(yīng)條件為95 ℃變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，40 個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

多份樣品在不同檢測(cè)方法中顯示出不同的陽(yáng)性判定，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 血清及牛奶樣品檢測(cè)結(jié)果

2.1 國(guó)標(biāo)方法對(duì)血清樣品檢測(cè)

4 種國(guó)標(biāo)方法檢測(cè)出的陽(yáng)性樣品數(shù)量有較大差距?；⒓t平板凝集試驗(yàn)檢出陽(yáng)性樣品16 份，陽(yáng)性率為40.0%；試管凝集試驗(yàn)檢出陽(yáng)性樣品6 份，陽(yáng)性率為15.0%；cELISA 和iELISA 方法分別檢出陽(yáng)性樣品33 和23 份，陽(yáng)性率分別為82.5%和57.5%。其中，試管凝集試驗(yàn)檢測(cè)的陽(yáng)性血清（樣品1～6 號(hào)），經(jīng)其他3 種國(guó)標(biāo)方法檢測(cè)也為陽(yáng)性。

2.2 膠體金試紙條檢測(cè)

膠體金試紙條共檢出9 份陽(yáng)性血清（樣品1～9 號(hào)），陽(yáng)性率略高于試管凝集試驗(yàn)。其中，樣品1～4 號(hào)被所有血清學(xué)檢測(cè)方法判定為陽(yáng)性，樣品5～7 號(hào)被膠體金試紙條以外的4 種血清學(xué)方法判定為陽(yáng)性，樣品8、9 號(hào)被虎紅平板凝集試驗(yàn)、iELISA 和cELISA 3 種血清學(xué)方法判定為陽(yáng)性。在牛奶樣品檢測(cè)中，膠體金試紙條檢測(cè)出10 份陽(yáng)性樣品，與同方法的血清學(xué)結(jié)果基本一致。對(duì)于所有經(jīng)虎紅平板凝集、試管凝集試驗(yàn)檢測(cè)為強(qiáng)陽(yáng)性的樣品以及經(jīng)瓊擴(kuò)法判定為野毒感染的試驗(yàn)牛，其奶樣經(jīng)膠體金試紙條檢測(cè)也均呈陽(yáng)性。

2.3 瓊擴(kuò)法檢測(cè)

瓊擴(kuò)法檢測(cè)結(jié)果顯示，有12 份陽(yáng)性血清，其中7 份是免疫陽(yáng)性，5 份為野毒感染。沒(méi)有出現(xiàn)瓊擴(kuò)法單一檢測(cè)為陽(yáng)性的血清樣品。瓊擴(kuò)法檢測(cè)為野毒陽(yáng)性的樣品中，除1 份樣品為iELISA 陰性外，其他均被所有血清學(xué)方法證實(shí)。當(dāng)瓊擴(kuò)法檢測(cè)出現(xiàn)野毒抗體沉淀線(xiàn)時(shí)，可認(rèn)為該樣品存在野毒感染。但瓊擴(kuò)法在具有高度特異性的同時(shí)，也損失了一定的敏感性，尤其是在讀取結(jié)果時(shí)，經(jīng)常發(fā)現(xiàn)沉淀線(xiàn)不夠清晰或者培養(yǎng)48 h 后才能夠勉強(qiáng)觀(guān)察到沉淀現(xiàn)象。在本次檢測(cè)中，有3 份瓊擴(kuò)法檢測(cè)為陰性的樣品（樣品6、8、9 號(hào)）被其他多種方法卻認(rèn)定為陽(yáng)性。

2.4 病原學(xué)檢測(cè)

2.4.1 BSSP qPCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)建立 目標(biāo)基因插入pUC57 質(zhì)粒。以3.47×108拷貝/μL 進(jìn)行10 倍梯度稀釋?zhuān)@得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程Y=-3.12X+45.5，R2=0.991 2（圖1），具有良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.4.2 BA qPCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)建立 目標(biāo)基因插入pUC57 質(zhì)粒。以6.34×108拷貝/μL 進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)@得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程Y=-3.43X+32.4，R2=0.997 3（圖2），具有良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.4.3 qPCR 檢測(cè) 對(duì)采集奶樣進(jìn)行qPCR 檢測(cè)，結(jié)果只有1 份呈現(xiàn)BSSP 和BA 陽(yáng)性。

2.5 未免疫牛血清檢測(cè)

未免疫牛共采集血清4 份（樣品15、21、35、36 號(hào)），在瓊擴(kuò)法、iELISA 和cELISA 檢測(cè)中，有2 份樣品（樣品15、21 號(hào)）分別被2 種方法檢測(cè)為陽(yáng)性。

3 討論

在本研究中，不同方法表現(xiàn)出了不同特點(diǎn)。試管凝集試驗(yàn)比虎紅平板凝集試驗(yàn)顯示出更高的特異性，這也正是虎紅平板凝集試驗(yàn)作為初篩，試管凝集試驗(yàn)用以確診的原因。本研究中，試管凝集和虎紅平板凝集試驗(yàn)均顯示為強(qiáng)陽(yáng)性的樣品（樣品1～4 號(hào)），其他血清學(xué)方法也顯示為陽(yáng)性，且瓊擴(kuò)法顯示存在野毒感染。但是試管凝集試驗(yàn)操作繁瑣，等待時(shí)間長(zhǎng)，而且需要符合要求的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境?；⒓t平板凝集試驗(yàn)雖然操作簡(jiǎn)便，但是對(duì)檢測(cè)人員的經(jīng)驗(yàn)有一定要求，實(shí)際檢測(cè)工作中，對(duì)同樣的結(jié)果經(jīng)常出現(xiàn)不同的判讀標(biāo)準(zhǔn)。雖然沒(méi)有采用細(xì)菌分離鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)，但是根據(jù)多種方法的檢測(cè)結(jié)果，可以確定本牛場(chǎng)存在野毒感染。通常情況下，奶牛的免疫抗體在6 個(gè)月后就無(wú)法檢出[11]。然而，本場(chǎng)奶牛免疫時(shí)間均超過(guò)一年，很多血清樣品仍可以檢出抗體陽(yáng)性。這可能是由于本場(chǎng)存在野毒感染且排菌的動(dòng)物，持續(xù)刺激其他免疫奶牛保持抗體存在。為了最大程度且成本可控的降低風(fēng)險(xiǎn)，一種簡(jiǎn)便可信的鑒別野毒感染方法就顯得尤為重要。

瓊擴(kuò)法雖然能夠直接指明免疫動(dòng)物中是否存在野毒感染，但是其檢測(cè)成本較高，敏感性有限，對(duì)檢測(cè)人員的操作經(jīng)驗(yàn)也有一定要求，難以在牛場(chǎng)普及[12]。iELISA 和cELISA 的敏感性過(guò)高，疫苗免疫抗體會(huì)嚴(yán)重影響檢測(cè)結(jié)果。本研究中，有7 份血清樣品僅在兩種ELISA 方法中顯示為陽(yáng)性（樣品21～27 號(hào)），另有6 份（樣品28～33 號(hào)）僅在cELISA 中顯示為陽(yáng)性。ELISA 方法可以敏感地發(fā)現(xiàn)疫苗抗體，但在免疫場(chǎng)判斷是否存在野毒感染時(shí)，幾乎不具有參考性[13]。qPCR 有很好的特異性，但是對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境、操作、設(shè)備都有較高要求，而且樣品中的病原含量可能很低，在不分菌培養(yǎng)的情況下，往往很難直接捕捉到病原核酸。在本研究中，僅有1 份奶樣在qPCR 方法檢測(cè)中顯示為陽(yáng)性。

間接法膠體金試紙條在本次試驗(yàn)中展示出了較好的參考價(jià)值，其所有血清檢測(cè)陽(yáng)性的樣品被至少3 種其他方法所支持，而且對(duì)奶樣檢測(cè)時(shí)，也表現(xiàn)出了與血清學(xué)方法良好的符合度，在生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)具有很好的應(yīng)用價(jià)值。這是因?yàn)閷?duì)于產(chǎn)奶期的奶牛無(wú)需采血，減少了對(duì)動(dòng)物的刺激，擠奶時(shí)可以當(dāng)場(chǎng)檢測(cè)，操作簡(jiǎn)單、結(jié)果清晰。

針對(duì)免疫過(guò)的奶牛，目前沒(méi)有一種簡(jiǎn)便有效鑒別野毒感染的方法。但是通過(guò)對(duì)幾種檢測(cè)方法的比較分析，間接法膠體金試紙條顯示出了較好的參考意義和方便的操作性。對(duì)于布病免疫奶牛場(chǎng)，可以在不采血的情況下，通過(guò)奶樣快速篩查出存在布魯氏菌感染風(fēng)險(xiǎn)的牛，然后及時(shí)對(duì)其隔離觀(guān)察，送樣品到當(dāng)?shù)貏?dòng)物疫控部門(mén)檢測(cè)，做好人員防護(hù)和無(wú)害化處理工作。