苗 春，李 偉，楊思成，邵軍軍，?；菔|

（中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學國家重點實驗室，OIE/國家口蹄疫參考實驗室，甘肅蘭州 730046）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）感染引起的一種急性、高度接觸性、高致病性傳染病。ASFV 是非洲豬瘟病毒科的唯一成員，也是目前已知的唯一DNA 蟲媒病毒。ASFV 基因組是一個大型線狀雙鏈DNA 分子，主要在單核巨噬細胞及網(wǎng)狀內皮細胞中復制，長度為170～190 kbp，編碼150 多種蛋白，包含中間保守區(qū)和兩端可變區(qū)[1]。根據(jù)p72 蛋白編碼基因（B646L）末端約500 bp 核苷酸的差異，已鑒定出24 種ASFV 基因型[2]。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將ASF 列入須通報動物疫病名錄，我國將其列為一類動物疫病[3]。目前暫無有效疫苗來預防該病。感染ASFV 會產(chǎn)生各種綜合癥，從最急性、急性到慢性，以及無癥狀的病毒攜帶，最主要臨床特征表現(xiàn)為高熱、出血和全身皮膚發(fā)紺壞死，尸體剖檢可見脾臟充血、腫大，淋巴結、肝臟和腎臟出血等。這些臨床特征及病理變化與豬瘟（CSF）、豬皮炎和腎病綜合征（PDNS）以及豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）尤為相似，難以鑒別，所以需要借助實驗室診斷來確診[4]。

本文綜述了目前應用的ASFV 檢測技術，并對各種方法優(yōu)缺點進行比較分析，同時探討了未來診斷技術發(fā)展趨勢，以期為我國ASF 防控提供技術參考。

1 ASF 病原學檢測

1.1 病原檢測

1.1.1 病毒分離鑒定 ASFV 感染動物后，主要在單核巨噬細胞系統(tǒng)（單核細胞和巨噬細胞）中復制，并通過淋巴系統(tǒng)和血液循環(huán)系統(tǒng)擴散到肝、腎等器官?！禣IE 陸生動物診斷試驗與疫苗手冊》要求，ASFV 分離必須在BSL-3 及以上生物安全實驗室進行，且需要從血液、脾臟、肝臟、淋巴結和扁桃體等組織樣本中分離病毒，用于下一步的實驗室診斷。

1.1.2 紅細胞吸附試驗（haemadsorption test，HAD） 紅細胞吸附性是在1960 年由Malmquist和Hay 首次發(fā)現(xiàn)的。ASFV 會粘附于豬的單核細胞或巨噬細胞表面，產(chǎn)生特征性的“玫瑰花環(huán)”現(xiàn)象。采集發(fā)病豬的血液或組織懸液接種到豬原代骨髓細胞（PBM）、原代白細胞或肺泡巨噬細胞中進行培養(yǎng)，6 d 后確定結果。通常，如果樣本呈強烈陽性，則會在培養(yǎng)后24～48 h 出現(xiàn)血液吸附而形成特征性的“玫瑰花環(huán)”現(xiàn)象。為防止非特異性的紅細胞吸附，培養(yǎng)基中需添加豬血清或血漿[5]。雖然該方法敏感性高、成本低，但需要進行原代細胞培養(yǎng)，時間周期長，而且現(xiàn)已分離出少量“非血吸附”的ASFV，其中大多數(shù)是低毒性的，不產(chǎn)生紅細胞吸附現(xiàn)象，所以HAD 不再是檢測ASFV 的首選方法，一般將HAD 與病毒分離鑒定作為ELISA、PCR 或FAT 陽性結果確認的參考試驗[6]。

1.2 核酸檢測

1.2.1 PCR PCR 全稱為聚合酶鏈式反應，由變性、退火、延伸3 個基本反應步驟構成，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR用于檢測血液、血清或器官樣本中的ASFV 基因組，在ASFV 感染早期就可通過PCR 檢測到ASFV。病毒脫氧核糖核酸的小片段可通過PCR 擴增到可檢測的數(shù)量。該方法快速、敏感性高、特異性強。所有已知基因型的病毒分離株，包括非血液吸附毒株和低毒力分離毒株，都可以用PCR 檢測，甚至滅活或降解的樣品都可以檢測。Agüero 等[7]發(fā)現(xiàn)，ASFV 引物集可以與CSFV 的特定引物集相結合，采用多重反轉錄PCR（RT-PCR）方法，可以在一次反應中同時區(qū)分并檢測兩種病毒基因組。然而，PCR 敏感性高，樣品稍有交叉污染，就會導致假陽性結果。為此，Luo 等[8]基于GenBank 中所有ASFV 毒株VP72基因序列的高度保守區(qū)，設計了ASFV 特異性引物，建立了PCR 檢測方法，并與兩個OIE 驗證的PCR 檢測進行了比較，結果表明靈敏性和特異性都高于OIE 推薦的PCR 方法。

1.2.2 實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR） qPCR 是通過對體系中加入的熒光基團產(chǎn)生的信號進行實時收集積累，最后用標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。與基于凝膠的常規(guī)PCR 方法相比，qPCR 方法具有快速、靈敏度高、不易交叉污染，以及可以定量分析的優(yōu)點，現(xiàn)已成為病原學診斷中應用最廣泛的方法。King等[9]首次根據(jù)ASFV 的VP72基因設計特異性引物和探針，建立了一種TaqMan qPCR 來快速檢測ASFV DNA，靈敏度在10～100 個分子之間，并針對不同地區(qū)25 株代表9 個基因型（I、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X）的ASFV 分離株和16個非洲、歐洲蜱分離株進行了驗證，結果沒有發(fā)現(xiàn)與相關的豬病毒發(fā)生交叉反應。Zsak 等[10]也基于VP72基因建立了一種實時TaqMan PCR 方法，可以通過使用便攜式檢測儀器實時獲得檢測結果，從而簡化聚合酶鏈反應操作程序。該方法比OIE 推薦的常規(guī)PCR 和qPCR 具有更高的靈敏度?，F(xiàn)已成為病原學診斷中應用最廣泛的方法。

1.2.3 多重PCR（multiplex polymerase chain reaction，mPCR） 多重PCR 是在常規(guī)PCR 的基礎上進行改進的，在本身體系結構中增添更多的引物來進行擴增，因目標片段之間有著較大的差異性，所以通過凝膠成像能直接進行分析，是一種應用范圍更廣、更加有效的PCR 新技術[11]。Giammarioli 等[12]基于豬瘟病毒（CSFV）、ASFV、豬圓環(huán)病毒2 型（PCV2）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）和豬細小病毒（PPV）基因組設計特異性引物，開發(fā)了一種新的熱啟動mPCR 方法，可同時檢測豬的多種病毒感染。

1.2.4 微滴數(shù)字PCR（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR） ddPCR是第三代PCR技術，可以在不使用標準樣品的情況下絕對定量核酸。它先對樣品進行微滴化處理，然后經(jīng)PCR 擴增，再對每個微滴進行檢測，最后根據(jù)泊松分布原理及陽性微滴的個數(shù)與比例得出靶分子的起始拷貝數(shù)或濃度。該方法更精確、更數(shù)字化，靈敏度更高。Wu 等[13]基于ASFVK205R基因的高度保守區(qū)域設計特異性引物和TaqMan 探針，建立了一種準確、靈敏的ASFV ddPCR 檢測方法。ddPCR 的最小檢測限約為10 拷貝/反應，而qPCR 的檢測限為102拷貝/反應，因此ddPCR 的檢測靈敏度是qPCR 的10 倍。

1.2.5 巢氏PCR（nested-PCR） 巢式PCR 涉及兩組引物，用于連續(xù)兩次的聚合酶鏈反應，第二組引物用于擴增第一批產(chǎn)物中的第二個靶標，一般適用于一些有必要增加靈敏度和/或特異性的PCR反應。Basto 等[14]首次建立了一種帶有內部對照的巢式PCR 檢測方法，用于檢測不同蜱種中的ASFV DNA。檢測蜱類中的ASFV 感染狀態(tài)，有助于確定該地區(qū)有無ASFV 感染。

1.2.6 環(huán)介導等溫擴增技術（loop mediated isothermal amplification，LAMP） LAMP 是 用于DNA 擴增的單管技術，使用兩套或三套引物和一種具有復制活性、高鏈置換活性的聚合酶，可在15～60 min，60～65 ℃的恒定溫度下擴增靶序列，是一種更簡便、快速、精確，且成本低的擴增方法。Wang 等[15]設計了針對ASFVP10基因的LAMP 引物，并用偽狂犬病病毒（PRV）、PCV2、CSFV、PRRSV、PPV 和ASFV 的DNA 或cDNA 驗證實時LAMP 和可視化檢測的特異性，證實LAMP 可以準確和特異性檢測ASFV。Zhu 等[16]通過將Hive-Chip 和LAMP 相結合，設計針對5 個ASFV 基 因（B646L、B962L、C717R、D1133L 和G1340L）的LAMP 引物，并將其預固定在Hive-Chip 中，結果發(fā)現(xiàn)靶基因之間沒有交叉反應。該方法無需核酸提取，不依賴精密儀器，可避免因病毒的單個基因突變引起的假陰性問題，且靈敏度高、特異性強，檢測結果可視化。Wang 等[17]根據(jù)ASFVP72基因高度保守區(qū)域設計引物，建立以中性紅為顯色指示劑的視覺LAMP 檢測方法，其特異性高，不與其他豬病毒出現(xiàn)交叉反應，與OIE推薦的qPCR 方法敏感度相當。

1.2.7 重組酶聚合酶擴增技術（recombinase polymerase amplification，RPA） RPA 技 術是由Piepenburg 等[18]在2006 年建立的一種等溫核酸擴增技術。該技術不需要模板的熱變性，反應溫度為37～42 ℃，擴增反應時間一般為10～20 min。Miao等[19]開發(fā)了一種將ASFVP72基因的 RPA 與側流檢測（LFD）相結合的快速檢測方法。RPALFD 法對ASFV 具有高度靈敏性和特異性，并且與CSFV 等其他豬病毒沒有交叉反應。哈登楚日亞等[20]建立了ASFV 實時熒光RPA 檢測方法。該方法在39 ℃，20 min 內可檢測10 個拷貝的DNA 分子，并且與CSFV、PCV2、PPV、PRV 都無交叉反應，可用于ASFV 的定性檢測。Wang 等[21]也將RPA 與LFD 相結合，開發(fā)了一種用于ASFV 現(xiàn)場診斷的金納米顆粒試紙條，稱為側向流動基因檢測（lateral flow gene assay，LFGA）。該方法使用尾部引物來產(chǎn)生一端具有單鏈尾部的雙鏈體。該雙鏈體與金納米粒子（AuNP）標記的探針雜交，使標記在檢測探針上的金納米粒子在試紙條的測試線上顯示紅色帶，即為陽性。在較低的反應溫度和較短的反應時間下，LFGA 可以特異性區(qū)分ASFV 和CSFV，檢測限為102拷貝/μL，靈敏度與瓊脂糖凝膠電泳相當，整個操作過程不需要任何昂貴的儀器，并且快速、特異、操作簡單，對ASFV 的早期診斷非常有幫助。目前，隨著CRISPR/Cas 技術的不斷發(fā)展，已經(jīng)有研究[22]將RPA 和CRISPR/Cas12a相結合來實現(xiàn)更高的靈敏度，并提供了對條帶的高靈敏度熒光檢測。這在實現(xiàn)多基因檢測的同時，為更靈敏、更快速的ASFV 診斷提供了啟示。

1.2.8 交叉引物擴增技術（cross priming amplification，CPA） CPA 是一類等溫核酸擴增反應，利用交叉引物和探針，能夠在1 h 內擴增出至少4 個拷貝的基因組DNA，具有高度特異性。CPA 方法依賴于具有鏈置換活性的DNA 聚合酶，通過鏈置換進行核酸擴增。該技術是我國首個具有自主知識產(chǎn)權的核酸擴增技術[23]。Fr?czyk 等[24]基于P72基因，設計了一組CPA 引物，可以特異性檢測豬和野豬血液、血清樣本中的ASFV DNA以及CSFV DNA，無需提取DNA，無交叉反應性，檢測靈敏度與qPCR 一致。CPA 高度敏感，可在水浴中進行，無需使用熱循環(huán)器。這種快速檢測技術為儲存、運輸和銷毀懷疑感染ASFV 病毒的材料提供了更好的生物安全措施[24]。

1.2.9 原位雜交技術（in situ hybridization，ISH） ISH 就是將標記的核酸探針與細胞或組織中的核酸進行雜交，目前已發(fā)展出熒光原位雜交技術（FISH）以及多彩色熒光原位雜交技術（mFISH）。FISH 克服了放射性探針檢測周期長且危害人體健康的缺點，被廣泛應用于基因定位、染色體識別等研究中。Bentolila 等[25]進行了小鼠的量子點熒光原位雜交（QD-FISH），發(fā)現(xiàn)QD-FISH 探針可穿透完整的間期細胞核和中期染色體，并顯示出對致密染色質結構域的良好靶向，且空間位阻最小，表明QD-FISH 探針在QD-FISH 應用中十分有效。Ballester[26]開發(fā)了一種新ISH 法，使用地高辛標記探針，來鑒定用福爾馬林固定、石蠟包埋組織中的ASFV 基因組，檢測效果良好。

1.2.10 生物傳感器技術 該方法通過生物識別元件識別分析物，然后換能器將生物識別元件捕獲目標分析物后發(fā)生的反應轉換成等效信號，最后由檢測器系統(tǒng)將信號進行處理和分析，從而得到分析結果[27]。Biagetti 等[28]利用DNA/LNA 探針作為ASFVVP72基因保守區(qū)的互補識別元件，建立了一種基于生物傳感器的方法來檢測豬血液中的ASFV。其檢測限（LOD）和定量限（LOQ）分別為178 拷貝/μL 和245 拷貝/μL，該結果和OIE推薦的qPCR 敏感性相當。該方法可用于ASF 的初步診斷及篩檢，具有快速、簡便、成本低的優(yōu)點。Wu 等[29]將PCR、Cas12a 和側流生物傳感器（LFB）結合起來，基于Cas12a 的生物傳感器靶向不同ASFV 菌株中VP73基因的保守區(qū)域，同時檢測7 種不同基因型的ASFV 病毒。該方法具有極高特異性和靈敏性，而且操作簡便、價格低，可以普遍用于檢測ASFV 和其他病毒。

2 血清學檢測

2.1 抗體檢測

2.1.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA） ELISA 是目前血清檢測最常用的方法，也是OIE 指定的ASF 首選血清學診斷方法。ELISA 的敏感性、特異性都較高，操作方便快速，適用于檢測多頭豬樣本，能夠快速檢測群體中的ASFV 抗體。但是，當檢測樣品發(fā)生降解或在-20 ℃放置太長時間時，ELISA 檢測的靈敏度就會降低。目前，常用作檢測ASFV 抗原的蛋白有p30、p54、p72、pp62 等。Gallardo 等[30]通過使用桿狀病毒表達p30、p54 和pp62 重組蛋白建立的重組ELISA 檢測方法，不僅顯示出比OIE 推薦方法（ELISA）更高的靈敏度，而且還減少了檢測出假陽性的概率，極大程度提高了檢測的準確性。Giménez-lirola[31]等基于多重熒光微珠的免疫測定法（FMIA）對ASFV 的3 種重組多肽（p30、p54、p72）感染豬后產(chǎn)生的早期血清抗體進行比較，以選擇最佳候選抗原，結果發(fā)現(xiàn)p30 是早期診斷的最佳抗原；通過表達ASFV p30蛋白，開發(fā)了一種能夠檢測血清或口腔液標本中ASFV 抗體的間接酶聯(lián)免疫吸附試驗（I-ELISA），其對兩種樣本類型都具有高度特異性，而且在8 DPI 時，就可以檢測到口腔液抗體，與OIE 推薦的I-ELISA 敏感度相當。

2.1.2 間接熒光抗體試驗（indirect fluorescent anti-body test，IFA） IFA 是一種免疫標記技術，應用熒光標記的二抗，通過與抗原抗體復合物中的抗體結合而檢測未知抗原。Heimerman 等[32]通過對ASFV 感染的Vero 細胞進行免疫熒光抗體（IFA）染色，共回收了29 種單克隆抗體（mAb），并對其中的IFA 陽性抗體進行進一步表征，發(fā)現(xiàn)這些抗體均位于p72 的高度保守區(qū)域內，這為開發(fā)新的ASFV 抗體和抗原檢測方法提供了機會。Wu 等[33]開發(fā)了一組針對ASFV p30 的mAb，并對其中的14 種進行檢測，通過IFA 等方法檢測發(fā)現(xiàn)，這些抗原區(qū)域3 和4 在宿主抗體反應中高度保守并具有免疫優(yōu)勢，從而為ASF 血清學檢測的開發(fā)和改進提供了有價值的工具。

2.1.3 膠體金快速免疫層析法（gold immunochromatography assay，GICA） GICA 是一種以膠體金標記的抗原或抗體作為示蹤標志物，以纖維素膜用作載體的免疫標記技術。吳海濤等[34]以硝酸纖維素（NC）膜上分別包被的ASFV p72多克隆抗體和SPA 作為檢測線和質控線，制備了用于檢測ASFV 的膠體金免疫試紙條。該試紙條在10 min 內就可以檢測出陽性抗原，敏感性和特異性良好，而且具有高度穩(wěn)定性，在ASFV 臨床檢測中有良好的應用前景。

2.1.4 免疫印跡法（immunoblotting test，IBT） IBT 通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳區(qū)分待測樣品不同組分，在電流作用下，使蛋白質從凝膠轉移至固相載體（膜）上，通過特異性抗體作為探針，對靶抗原蛋白質進行檢測分析。Alcaraz 等[35]在大腸桿菌中表達重組蛋白p54，首次建立了ASFV 重組蛋白的IBT 法。該法對檢測感染豬的ASFV 具有高度的特異性和敏感性，而且消除了因抗原中含有細胞蛋白從而產(chǎn)生的假陽性，并避免了在抗原生產(chǎn)中使用活病毒。

2.2 抗原檢測

2.2.1 熒光抗體試驗（fluorescent antibody test，F(xiàn)AT） FAT 是檢測抗原的一種輔助方法，具有快速、方便、敏感、特異等特點，而且可以鑒別“非紅細胞吸附”的毒株，也能區(qū)分由ASFV 引起的CPE 和由其他病毒、接種物細胞毒性產(chǎn)生的CPE，可作為HAD 試驗的補充試驗進行進一步檢測[2]。FAT 需用熒光素對抗原進行標記，但對熒光素的特異性要求較高，非特異性的熒光素染色會造成假陽性結果；對于急性ASF 檢出率較高，對于亞急性和慢性ASF 的檢出率僅為40%；對人員要求較高，需要熒光顯微鏡，不適用于現(xiàn)場檢測[6]。

2.2.2 抗原ELISA ELISA檢測的原理為抗體（抗原）被吸附在固相載體表面，樣品中的抗體或抗原與其結合形成復合物，酶標抗體再與該復合物結合，根據(jù)加入底物后顏色反應判定結果。Vidal 等[36]基于抗vp73 單克隆抗體建立了一種用單克隆抗體檢測豬樣品中ASFV 蛋白的改良固相ELISA，檢測到vp73 的最低抗原質量濃度為0.05 μg/mL，低于普通ELISA 試驗檢測最極限（0.5 μg/mL）。

2.2.3 側向流動免疫色譜分析（lateral flow assay，LFA） LFA 又稱“試紙條”測定方法，是近幾年來發(fā)展比較迅速的試紙條快速檢測技術，其以條狀纖維層析材料為固相，借助毛細管的吸附作用使樣品在層析材料上移動，樣品中的待測物與層析材料上一定區(qū)域的配體發(fā)生特異性的免疫結合反應，可通過目測標記物的顯色反應短時間獲得直觀的測試結果[37-38]。Sastre 等[39]基于ASFV vp72 蛋白的單克隆抗體建立的一種用于抗原檢測的LFA，其靈敏度與市售抗原ELISA 試驗相當。該法具有快速、特異、經(jīng)濟且易于使用的優(yōu)點。此外，該法可直接用于檢測血液，非常適合現(xiàn)場檢測，及實驗基礎設施不足甚至缺乏的場所。

2.3 常用檢測技術比較

目前ASFV 常用檢測方法主要表現(xiàn)在病原、核酸、抗原與抗體4 個方面，其中病原檢測主要有紅細胞吸附和病毒分離方法，核酸檢測主要通過普通PCR、qPCR 與RPA 等方法，抗原檢測常用抗原ELISA 與LFA 等，而抗體可通過GICA、ELISA、IFA 與IBT 等方法檢測（表1）。每種診斷技術都有其特點，可為不同情況下的ASFV 診斷提供多種選擇。qPCR 敏感性高、特異性強，可以快速對ASFV 進行定量分析，是診斷ASFV 感染最可靠的“金標準”[5]，但是需要專業(yè)人員操作而且對設備要求高。mPCR 可以同時檢測及區(qū)分ASFV 及多種病毒感染，節(jié)約了大量時間，但操作步驟繁瑣。LAMP 技術是一種特異、靈敏、快速、簡單易用且經(jīng)濟高效的ASFV 核酸檢測手段，可在現(xiàn)場檢測，檢測結果可以立即用肉眼觀察到，但是操作過程中易造成氣溶膠污染，形成假陽性?？乖璄LISA 可用作檢測豬群體ASFV 抗體，操作簡便快速，但敏感性低于PCR。LFA 是近年來發(fā)展迅速的新檢測方法，具有快速、特異性強、靈敏度高、成本低的優(yōu)點，適用于現(xiàn)場檢測及一些缺乏基礎實驗設施的場所，具有很好的應用前景，但該方法不能對抗原絕對定量而且需要兩個抗原表位。

表1 ASFV 常用檢測方法及其優(yōu)缺點

3 展望

ASF 給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了沉重打擊，而且2021 年以來，在我國又出現(xiàn)了變異毒株，使ASFV防控愈加困難。目前，OIE 批準的診斷方法主要包括病毒分離、FAT、ELISA、IFA、PCR 和IBT。這些方法往往需要昂貴的實驗室設備和熟練的技術人員，并且在現(xiàn)有的診斷技術中，缺乏能鑒別ASFV病理變化的病原學診斷方法。而快速、簡便、可靠的ASF 診斷和監(jiān)測方法對于控制ASF 格外重要。CRISPR 技術[40-45]與RPA 結合是目前發(fā)展較快的檢測技術，具有良好的發(fā)展?jié)摿?，能將檢測靈敏度提高10 倍，但卻增加了更多的反應時間，因此縮短反應時間是今后新的研究方向。在今后的發(fā)展中，不同診斷技術的聯(lián)合應用也將成為未來診斷技術發(fā)展的趨勢。