余水紅 錢 燕 王曉梅 龔 莉

1 安慶醫(yī)藥高等?？茖W?？蒲兄行?安徽 安慶 246052；2 深圳大學醫(yī)學院 廣東 深圳 518061；3 安慶師范大學生命科學學院 安徽 安慶 246502

胃癌(gastric cancer，GC)是世界范圍內發(fā)病率排名第五、死亡率排名第三的癌癥，中國2018年約有39萬GC新發(fā)病例和37萬死亡病例[1]，5年生存率僅為15%～20%，轉移性患者的中位生存期只有1年左右[1]。早期手術可以作為一種有效治療GC的手段，但很多患者是在晚期才被確診。因此，提高GC患者的診斷、治療和預后，需要尋找新的治療靶點和預后標志物。

γ-谷氨?；h(huán)轉移酶(γ-Glutamylcyclotransferase，GGCT)是參與谷胱甘肽代謝的主要酶之一，是一個由188個氨基酸組成的小分子蛋白質，GGCT參與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展過程。GGCT在人腦膠質瘤組織及細胞中表達均升高，其通過促進Notch受體表達，激活Akt信號通路，促進膠質瘤細胞的增殖[2]。GGCT在侵襲性食管鱗癌和高級別上皮內瘤變中的異常表達(分別為87.5%和85.0%)相對在低級別上皮內瘤變中表達(17.5%)更加明顯，其可作為診斷高級別上皮內瘤變到上皮下浸潤的食管癌的生物標志物[3]。敲除GGCT基因抑制了卵巢癌細胞的增殖、克隆形成、遷移和侵襲，可作為患者治療的預后標志物和潛在靶點[4]。GGCT與乳腺癌、骨肉瘤患者生存率相關，可作為癌癥診斷或預后的生物標志物[5-6]。

本研究借助多個在線腫瘤數(shù)據(jù)庫分析GGCT基因的表達及其與患者預后的關聯(lián)，同時多方位評估了其相關的基因網(wǎng)絡，并探討其在腫瘤免疫中的作用，為GGCT作為GC診斷、治療靶點及預后的基因標志物提供參考。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫 本研究應用數(shù)據(jù)庫分別為UALCAN數(shù)據(jù)庫(http://ualcan.path.uab.edu)，Oncomine數(shù)據(jù)庫(https://www. oncomine.org/)，Kaplan-Meier plotter 數(shù)據(jù)庫(http://kmplot.com/analysis)，LinkedOmics 數(shù)據(jù)庫(http://www.linkedomics.org/login.php)，webgestalt數(shù)據(jù)庫(http://www.webgestalt.org/)，TIMER數(shù)據(jù)庫(https://cistrome.shinyapps. io/ timer/)。

1.2 方法

1.2.1 UALCAN數(shù)據(jù)庫分析GGCT基因mRNA表達水平 UALCAN數(shù)據(jù)庫基于TCGA數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)提供癌組織與癌旁組織中基因表達、生存分析、相關性分析和DNA啟動子區(qū)甲基化數(shù)據(jù)分析[7]。本研究應用該數(shù)據(jù)庫分析GGCT基因在GC組織與癌旁組織中mRNA的表達差異。

1.2.2 Oncomine數(shù)據(jù)庫分析GGCT基因DNA拷貝數(shù)水平 Oncomine數(shù)據(jù)庫是一個分析19種癌組織與癌旁組織中差異性表達癌基因、共表達基因以及基因表達與患者預后關系等的癌癥微陣列數(shù)據(jù)庫和整合數(shù)據(jù)挖掘平臺[7]。本研究應用該數(shù)據(jù)庫分析GGCT基因在GC組織與癌旁組織中DNA拷貝數(shù)差異。

1.2.3 Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫分析GGCT基因與患者預后的關系 Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫可以將CEO、EGA、TCGA數(shù)據(jù)庫中常見癌癥的mRNA的表達和預后數(shù)據(jù)進行整合。本研究依據(jù)GGCT基因不同分位數(shù)表達將患者分為高表達組及低表達組，并進行生存分析。

1.2.4 Linked Omics數(shù)據(jù)庫分析GGCT基因及共表達基因網(wǎng)絡 Linked Omics數(shù)據(jù)庫可用于分析32個TCGA癌癥相關的多維數(shù)據(jù)集。本研究通過該數(shù)據(jù)庫用Pearson相關系數(shù)對GGCT基因的共表達基因進行分析，并在火山圖和熱圖中顯示結果。

1.2.5 webgestalt數(shù)據(jù)庫對GGCT基因正負相關基因進行功能注釋及KEGG通路分析 webgestalt是一個專注于基因功能富集，蛋白質相互作用，miRNA靶基因及藥物靶點等各種注釋信息的在線網(wǎng)站。本研究應用該數(shù)據(jù)庫對與GGCT基因成正負相關的100個基因進行功能注釋及KEGG通路分析，初步了解其在GC中的作用機制。

1.2.6 TIMER數(shù)據(jù)庫分析GGCT基因與免疫細胞的關系 TIMER數(shù)據(jù)庫可用于分析來自TCGA數(shù)據(jù)庫中的32種癌癥類型的免疫細胞浸潤。本研究應用該數(shù)據(jù)庫分析GGCT基因在GC中的表達與免疫細胞(包括B細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、中性粒細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞)浸潤的相關性。

1.2.7 統(tǒng)計學方法 實驗數(shù)據(jù)來自以上數(shù)據(jù)庫，采用系統(tǒng)默認的統(tǒng)計學方法，計算危險比(hazard radio，HR)及其95%置信區(qū)間(confidence interval，CI)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 GGCT基因在GC組織中的表達 異常表達的基因是診斷腫瘤發(fā)病的潛在重要分子指標。本研究借助Oncomine和UALCAN數(shù)據(jù)庫初步評估了GGCT在GC組織及癌旁組織中的轉錄水平。Oncomine數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)顯示GGCT mRNA表達量排在前1%以內，與癌旁組織相比，GGCT的mRNA表達量和DNA拷貝數(shù)譜在腫瘤組織中顯著升高，P<0.05(圖1)。UALCAN數(shù)據(jù)庫分析了多種臨床病理特征中GGCT的轉錄水平，如樣本類型、性別、年齡、患者、種族、癌癥分期、腫瘤分級、幽門螺桿菌感染和組織學亞型，結果表明，GGCT mRNA表達水平均高于正常對照組，P<0.05(圖2)。因此，GGCT可作為診斷GC的潛在指標。

圖1 GGCT在GC組織和癌旁組織中的轉錄水平(Oncomine數(shù)據(jù)庫)

A.樣本類型；B.性別；C.年齡；D.患者；E.種族；F.個體癌癥分期；G.腫瘤分級；H.幽門螺桿菌感染狀態(tài)；I.組織學亞組。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

2.2 GGCT與GC患者預后的相關性 腫瘤患者預后是評估基因重要性的指標之一。本研究利用Kaplan-Meier plotter 數(shù)據(jù)庫評估GGCT基因表達與GC患者預后的相關性，結果表明，GGCT高表達組的總生存期(overall survival，OS)、首次進展期(first progression，F(xiàn)P)及進展期(post progression survival，PPS)均明顯長于低表達組(HR<1，P<0.01)(圖3)。因此，GGCT可作為判斷腫瘤患者預后的候選基因。

注：OS.總生存期；FP.首次進展期；PPS.進展期。

2.3 GGCT與不同臨床病理特征GC患者預后的相關性 本研究借助Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫進一步挖掘GGCT基因與多種臨床病理特征GC患者預后的相關性，如不同的治療方法、人表皮生長因子受體2(HER2)的狀態(tài)、分化、Lauren分型及臨床分期。結果表明，GGCT的高表達提高了單純手術治療患者，HER2陰性和HER2陽性患者，II/ III/IV期患者的生存總期(HR<1，P<0.01)，而在5-FU為基礎的輔助治療及低分化患者的生存總期較差(HR>1，P<0.01)，同時GGCT表達與其他輔助治療，中分化和高分化，GCI期患者的總生存率無顯著相關性(表1～3，圖4)。

表1 GGCT表達與GC患者治療的關系

表2 GGCT表達與GC人表皮生長因子受體2的關系

表3 GGCT表達與GC分化的關系

A. I期；B. II期；C. III期；D. IV期。

2.4 GGCT基因在GC中的共表達網(wǎng)絡 GGCT基因潛在功能的發(fā)揮可能是與多種基因共同作用的結果。本研究利用Linked Omics功能模塊檢測GGCT基因在GC中的共表達模塊，火山圖顯示有5 020個基因(紅點)與GGCT表達呈顯著正相關(FDR<0.01)，如基因LSM5(r=0.745，P<0.001)，CBX3r=0.702，P<0.001)，CYCS(r=0.672，P<0.001)； 6 458個基因(黑點)與GGCT表達呈顯著負相關(FDR<0.01)，如基因ZFYVE1(r=-0.629，P<0.001)，ZBTB4(r=-0.608，P<0.001)，MEF2D(r=-0.605，P<0.001)(圖5A)。正負相關的前50個關鍵基因熱圖見圖5B～C。本研究利用MetaScape 數(shù)據(jù)庫對這100個基因進行功能注釋及KEGG通路分析，結果表明，這些正相關基因參與的生物學過程包括生物調節(jié)、刺激反應、代謝過程等13類過程，細胞組分主要集中在細胞膜、細胞核、膜封閉腔等19類，而分子功能包括蛋白結合、核酸結、離子束縛合等13類(圖6)。負相關基因參與的生物學過程包括代謝過程、細胞骨架組成、生物調節(jié)等13類過程，細胞組分主要集中在膜封閉腔、蛋白質復合物、細胞核等15類，而分子功能包括蛋白結合、核酸結、離子束縛合等13類(圖7)。通路分析結果表明，GGCT基因正相關基因參與了cGMP-PKG信號通路、肌肉收縮、Apelin信號通路和一氧化氮激活鳥苷酸環(huán)化酶等過程(表4)，而負相關基因參與了DNA復制、染色體維護、細胞周期和DNA合成等過程(表5)。富集分析有助于了解GGCT及其相互作用基因在GC中的作用機理。

A. 火山圖；B. 正相關的前50個關鍵基因熱圖；C. 負相關的前50個關鍵基因熱圖。

圖6 GGCT基因和負相關基因的GO功能注釋(MetaScape數(shù)據(jù)庫)

圖7 GGCT基因和負相關基因的GO功能注釋(MetaScape數(shù)據(jù)庫)

表4 GGCT基因及正相關基因KEGG通路富集(MetaScape數(shù)據(jù)庫)

表5 GGCT基因及負相關基因KEGG通路富集(MetaScape數(shù)據(jù)庫)

2.5 GGCT基因在GC組織中與免疫細胞的關系 腫瘤發(fā)展與免疫細胞相關，本研究利用TIMER數(shù)據(jù)庫分析GGCT基因在GC免疫微環(huán)境中的表達，結果顯示，GGCT 在GC免疫微環(huán)境中與不同發(fā)育階段的CD8+T細胞呈負相關，與CD4+T細胞呈負相關，與CD4+記憶性T細胞及T效應細胞呈正相關，與B細胞呈負相關，與處于不同發(fā)育階段的巨噬細胞有正負不同關系，與樹突狀細胞主要呈負相關，與中性粒細胞主要無相關性(圖8)。

圖8 GGCT基因與腫瘤免疫細胞間的相關性(TIMER數(shù)據(jù)庫)

3 討論

GGCT是一種參與細胞形態(tài)變異、衰老、自噬、上皮-間充質轉化和細胞內信號通路的重要酶。敲除GGCT基因可顯著誘導膠質母細胞瘤、乳腺癌、宮頸癌和前列腺癌細胞衰老[8]。在乳腺癌和前列腺癌中，自噬在GGCT缺失所產(chǎn)生的生長抑制中發(fā)揮了重要作用[9]。有兩組神經(jīng)膠質瘤細胞系在GGCT敲除后改變了細胞內信號通路[8]。GGCT可能在癌癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著多重作用，其有望成為GC治療潛在的分子靶點來源。為能夠詳細了解GGCT在GC中的潛在功能及其基因調控網(wǎng)絡，本研究利用多個成熟的在線公共數(shù)據(jù)庫對其進行生物信息學分析，以期為GGCT基因在GC治療中的進一步研究提供參考。

轉錄分析表明GGCT mRNA水平及DNA 拷貝數(shù)明顯高于正常的GC組織[10]，研究表明GGCT在GC組織中轉錄水平與本文研究一致，然而GGCT高表達組GC患者OS、 FP及 PPS均明顯長于低表達組患者，同時GGCT高表達利于II/ III/IV期GC患者生存總期?；蛟S隨著GC發(fā)生過程GGCT表達量升高，而隨著腫瘤進展表達量逐漸降低，因此GGCT作為GC診斷基因和預后標記基因值得進一步基礎及臨床研究。

GGCT與不同臨床病理特征GC患者預后的相關性分析表明，GGCT高表達提高單純手術治療GC患者生存期，而降低5-FU為基礎的輔助治療患者生存期。谷胱甘肽S轉移酶P1(GSTP1)催化Ⅰ相酶代謝的親電子基團(包括多種化療藥物)與谷胱甘肽結合，使其成為水溶性物質而排出體外，消除5-FU化療藥物的細胞毒性[10]，而GGCT基因介導谷胱甘肽的合成與分解，從而影響5-FU的療效。推測患者生存期縮短與化療藥物5-FU個體化治療有關，因此GGCT表達是否可以作為個體化治療基因標志物預測5-FU治療GC患者效果需進一步研究。

對GGCT基因共表達網(wǎng)絡分析表明，GGCT及共表達網(wǎng)絡基因參與了細胞周期階段、cGMP-PKG信號通路、肌肉收縮、跨膜損傷運輸、Apelin信號通路和一氧化氮刺激鳥苷酸環(huán)化酶等過程，這些發(fā)現(xiàn)部分與GC治療基礎研究的分子途徑基本一致[11]，但cGMP-PKG及Apelin信號通路是如何影響GC發(fā)生發(fā)展需要基礎研究深入探索。

腫瘤微環(huán)境是非癌細胞存在于腫瘤內部或腫瘤周圍外部環(huán)境，免疫細胞是腫瘤微環(huán)境重要組成部分，對基因的變異或選擇性表達具有重要的影響作用[12]，本研究表明GGCT與不同發(fā)育階段的CD8+T細胞、CD4+T細胞、B細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞及中性粒細胞的浸潤相關性有所不同，可能在抗腫瘤免疫或免疫逃逸過程中起著不同作用，GGCT是否可以介導細胞免疫治療還需進一步探討。

綜上所述，本研究通過生物信息分析從多個層次探討GGCT的重要性及其作為GC預后潛在標志物。分析結果表明GGCT在GC中的上調可能在轉錄合成、代謝過程、生物調控、跨膜損傷運輸和細胞周期的多個步驟中具有較大的影響。此外，GGCT基因在免疫調節(jié)和免疫治療中也具有重要作用，這些發(fā)現(xiàn)需要更多的GC基因組學研究和后續(xù)的功能研究。