●張祖珍 李 疑 阮金華 王安東 盧 兵

（1.云南新興職業(yè)學(xué)院 云南 昆明 650501；2.昆明海盛園藝有限公司 云南 昆明 651700；3.楚雄仙草園生物科技有限公司 云南 昆明 675000）

麗江山慈姑（Iphigenia indicaKunth et Benth）是百合科（Liliaceae）麗江山慈姑屬（Iphigenia）的干燥鱗莖，又叫益辟堅、草貝母、山慈姑等，主要分布于我國云南西北至中部（鶴慶、麗江、昆明）、四川、西藏等地，多生于海拔1950～2100 m 的松林下、草地或田野[1]。1974年，麗江山慈姑以山慈姑為藥材名收入《云南省藥品標(biāo)準(zhǔn)》，藥用部位為其鱗莖[2-3]。麗江山慈姑中含有秋水仙堿等多種生物堿，可作為提取秋水仙堿的原料藥材，研究表明，秋水仙堿在臨床上可用于癌癥和痛風(fēng)的治療，對炎癥、疼痛、肝硬化、急性痛風(fēng)、急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎等疾病也有很好的治療 效果[4-5]。

麗江山慈姑在植物形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為生長發(fā)育緩慢、根系不發(fā)達(dá)、抗逆性差、種子休眠期長、種殼堅硬、通透性差等特點，由于在自然條件下難以打破其休眠狀態(tài)，導(dǎo)致其萌發(fā)率極低，近年來過度采挖更加劇了其瀕?，F(xiàn)狀[6]。另外，由于麗江山慈姑種子萌發(fā)時間過長，因而不利于大面積推廣。對于麗江山慈姑的組培擴繁，Mukhopadhyay等[7-8]研究表明，可以采用麗江山慈姑的鱗莖作為外植體來啟動組培，但此方法獲取麗江山慈姑種苗成本較高。為縮短麗江山慈姑的種苗獲取時間并節(jié)約成本，本試驗通過對麗江山慈姑種子無菌萌發(fā)，進(jìn)而獲得小鱗莖并擴繁，以期滿足市場對麗江山慈姑的需求，并為野生資源和瀕危品種保育提供理論參考。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 種子及試劑 種子選自麗江山慈姑成熟蒴果，慈姑蒴果為2019年11月采集于云南省麗江市玉龍縣石鼓鎮(zhèn)仁義村。由大理大學(xué)段寶忠副教授鑒定標(biāo)本，種子置于4℃條件下 保存。

試劑有3%過氧化氫、2% NaClO溶液、BAP、 Kinetin、MS培養(yǎng)基組成試劑、蔗糖、瓊脂、 1 mol/L HCl溶液、1 mol/L NaOH溶液及其他植物組培常用試劑。

1.1.2 培養(yǎng)基準(zhǔn)備 按表1配方配制不同的培養(yǎng)基，即全量MS、MS（1/2 NH4NO3）和1/2MS的培養(yǎng)基，分別命名為G1、G2及G3。

表1 培養(yǎng)基基礎(chǔ)配方 單位：mg/L

1.2 試驗步驟

試驗步驟如圖1所示。

圖1 麗江山慈姑種子無菌萌發(fā)和組培快繁技術(shù)試驗步驟

1.3 試驗方法

1.3.1 種子脫毒和接種 將采集的種子蒴果經(jīng)脫水干燥后，在解剖顯微鏡下檢查果皮破損情況并篩選出20顆均勻飽滿的蒴果，根據(jù)圖2操作流程進(jìn)行分組。

圖2 蒴果消毒處理及接種操作流程

脫毒操作后每顆蒴果分別接種于萌發(fā)培養(yǎng)基G1、G2和G3組7～8瓶，后置于溫度20℃、光照強度2100 lx、光照時長 12 h/d的條件下培養(yǎng)。

污染率從接種后第3天開始統(tǒng)計，到第3周周末結(jié)束，計算公式如下：

污染率（%）=污染接種瓶瓶數(shù)/總接種瓶瓶數(shù)×100。

1.3.2 萌發(fā)試驗 每組分別取適量培養(yǎng)基加入濃度分別為0，0.1，0.3，0.6 mg/L的BAP，每升培養(yǎng)基加入蔗糖30 g并攪拌溶解，利用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH將pH調(diào)至5.8，每升培養(yǎng)基加入6 g瓊脂粉后煮沸，后將培養(yǎng)基分裝于組培瓶中，每瓶各50 mL，并標(biāo)記時間和培養(yǎng)基名稱，并在120℃、0.15 MPa條件下滅菌22 min，冷卻備用。

將未感染細(xì)菌或真菌的培養(yǎng)瓶按BAP濃度梯度隨機各選取6瓶，分別于接種后的第10周和第15周在超凈工作臺內(nèi)的解剖鏡下進(jìn)行觀測，以能明顯辨認(rèn)出種子吸脹后根部出現(xiàn)小鱗莖及真葉為標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計萌發(fā)種子數(shù)。種子萌發(fā)率公式：種子萌發(fā)率（%）=萌發(fā)種子數(shù)量/總接種數(shù)×100。

1.3.3 增殖培養(yǎng)和溫室移栽 選取最適萌發(fā)培養(yǎng)基在不同濃度BAP和Kinetin（簡稱KT）單一或結(jié)合條件下使用，將其命名為增殖培養(yǎng)基組M1、M2及M3，通過增殖培養(yǎng)和溫室移栽，篩選BAP及KT的最適濃度。種子萌發(fā)后經(jīng)過4個月的培養(yǎng)，長出直徑5 mm小鱗莖的幼苗。在20℃、光照2100 lx 14 h/d培養(yǎng)條件下，探索以小鱗莖為外植體的最適宜增殖的植物激素水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 2% NaClO溶液不同浸泡時間對種子萌發(fā)污染率的影響

使用2% NaClO溶液對麗江山慈姑種子進(jìn)行不同時間的浸泡，種子萌發(fā)污染率，見表2。麗江山慈姑蒴果在D1和重復(fù)D2兩組處理中結(jié)果均表明被真菌和細(xì)菌的污染概率隨2% NaClO溶液浸泡時間的延長而降低，處理時間為2 min時，在接種后的第4天有超過50%的種子開始出現(xiàn)明顯真菌污染；最佳處理時間為10 min，污染率在7%以下。

表2 2% NaClO溶液不同浸泡時間對種子萌發(fā)污染率的影響

2.2 不同培養(yǎng)基對種子萌發(fā)率的影響

根據(jù)種子萌發(fā)率篩選最適萌發(fā)培養(yǎng)基及BAP濃度。結(jié)果表明，種子萌發(fā)率隨培養(yǎng)時間延長逐漸升高，隨著BAP濃度的升高而降低，這說明BAP會抑制種子萌發(fā)（表3）。在BAP濃度和培養(yǎng)時間一致的情況下，對比萌發(fā)培養(yǎng)基組G1、G2和G3可知，培養(yǎng)基內(nèi)大量元素的濃度對種子萌發(fā)也有較大影響，大量元素如硝酸銨減半，對萌發(fā)率影響較小，而當(dāng)大量元素均減半時，萌發(fā)率有所提高，說明低濃度的無機鹽對麗江山慈姑種子萌發(fā)具有促進(jìn)作用。結(jié)果表明，最適宜萌發(fā)條件為不含BAP的1/2MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)15周，萌發(fā)率70.52%。種子萌發(fā)過程及生長情況如圖3所示。

圖3 顯微鏡下觀察麗江山慈姑種子萌發(fā)及生長情況

表3 第10周和第15周種子萌發(fā)率統(tǒng)計結(jié)果

2.3 增殖培養(yǎng)和溫室移栽結(jié)果與分析

通過萌發(fā)試驗可知，當(dāng)培養(yǎng)基以1/2MS為基礎(chǔ)時有助于小鱗莖和葉子成長，通過3個周期的繼代培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)增殖率隨著BAP濃度升高而升高；隨著KT的濃度升高而升高，但當(dāng)KT濃度為0.5 mg/L時出現(xiàn)玻璃化。當(dāng)BAP和KT同時使用，在兩者濃度均為0.1mg /L時得到最高的增殖倍數(shù)，為1.85（表4）。將第二、三周期繼代分別得到289株和447株小鱗莖直徑＞5 mm且具有兩片葉子的小苗（圖4）分別進(jìn)行了溫室移栽煉苗測試。

圖4 增殖階段和待移栽苗

表4 不同植物激素濃度對麗江山慈姑鱗莖增殖倍數(shù)的影響

通過將直徑＞5 mm的小鱗莖分別移栽入細(xì)河沙和木屑、細(xì)河沙和椰糠珍珠巖兩組基質(zhì)內(nèi)，經(jīng)過3個月的煉苗馴化成活率，發(fā)現(xiàn)小苗成活率均在70%以上；在椰糠與珍珠巖比例為2∶1的基質(zhì)中成活率最高，為87.27%（表5）。說明通過上述組培技術(shù)手段獲得的幼苗可以保證移栽成活率。

表5 溫室移栽基質(zhì)及成活率

3 結(jié)論與討論

麗江山慈姑無菌萌發(fā)可以解決其種子自然萌發(fā)率低的問題。本試驗通過對麗江山慈姑蒴果的脫毒、萌發(fā)、增殖擴繁以及移栽馴化可知，在組培技術(shù)條件下可以在1年的時間內(nèi)獲得大量直徑為3～5 mm小球莖，帶葉子的無菌幼苗；最佳萌發(fā)條件為不添加BAP的1/2MS培養(yǎng)基，經(jīng)過15周的培養(yǎng)萌發(fā)率最高可達(dá)70.25%；最佳增殖條件為BAP和KT相結(jié)合使用，在兩者濃度均為 0.1 mg/L時得到最高的增殖倍數(shù)，為1.85；溫室移栽成活率是其鱗莖規(guī)?；a(chǎn)的關(guān)鍵，本試驗結(jié)果表明煉苗移栽時，在透氣性較好的椰糠和珍珠巖以2∶1配比條件下成活率較高， 為87.27%。

植物組培技術(shù)的優(yōu)勢在于短期內(nèi)可以得到大量無菌完整植株，在本研究的基礎(chǔ)上仍有許多可以優(yōu)化的地方，如不同植物激素配比、不同光溫培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基成分調(diào)整、培養(yǎng)周期及繼代數(shù)對增殖率和植株生長的影響等有待研究，并且通過調(diào)整馴化環(huán)境，如不同栽培基質(zhì)、穴盤移栽、光溫水肥調(diào)控等提高成活率和快速 生長。