高勝濤 馬 露 卜登攀

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學(xué)國家重點實驗室，北京 100193)

熱應(yīng)激(heat stress，HS)影響奶業(yè)生產(chǎn)[1]和奶牛健康[2]。熱應(yīng)激可降低奶牛干物質(zhì)采食量(DMI)、產(chǎn)奶量和乳蛋白產(chǎn)量[3-6]，但DMI下降只能解釋30%～50%的產(chǎn)奶量下降[7]。本團隊前期研究表明，熱應(yīng)激誘導(dǎo)的DMI下降只能解釋65%的乳蛋白產(chǎn)量下降[5]，從而表明熱應(yīng)激對乳腺組織的乳蛋白合成具有直接的影響。

乳腺組織的乳蛋白合成前體物供應(yīng)減少是熱應(yīng)激引起乳蛋白合成減少的重要原因之一[5]。對乳腺組織進行RNA測序(RNAseq)分析發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激可降低乳腺組織中乳蛋白合成相關(guān)編碼基因、轉(zhuǎn)錄翻譯關(guān)鍵調(diào)控基因及氨基酸和葡萄糖轉(zhuǎn)運體相關(guān)基因的表達；對所有差異表達基因進行生物信息學(xué)分析表明，乳腺組織中代謝相關(guān)通路(尤其是碳水化合物及脂代謝相關(guān)通路)均被熱應(yīng)激抑制；而上游調(diào)節(jié)因子分析顯示炎癥反應(yīng)相關(guān)通路被激活，表明炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)驅(qū)動的乳腺組織中整體代謝的抑制，可能也是熱應(yīng)激時乳蛋白合成減少的原因之一[8]。

乳腺組織中miRNA是存在數(shù)量最多的miRNA，可以在轉(zhuǎn)錄后水平通過介導(dǎo)mRNA的翻譯或同源mRNA的降解調(diào)節(jié)靶基因的表達[9-11]。大量研究表明，miRNA在細胞生長與分化、增殖與凋亡的生物過程中發(fā)揮重要的作用[12-13]。此外，miRNA還參與了包括氧化應(yīng)激、低氧應(yīng)激等多種應(yīng)激反應(yīng)[14-15]。Li等[16]在熱應(yīng)激荷斯坦奶牛乳腺組織中鑒定出27個相對于非熱應(yīng)激牛差異表達的miRNA。然而關(guān)于miRNA表達譜的變化在熱應(yīng)激誘導(dǎo)的乳蛋白合成下降中的作用，目前仍未見報道。因此，本研究采用RNAseq分析了熱應(yīng)激對乳腺組織中miRNA表達譜變化的影響，并闡述了差異表達的miRNA在乳蛋白合成調(diào)控中的作用，為進一步驗證熱應(yīng)激條件下miRNA對乳蛋白合成的調(diào)控作用奠定理論科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

本試驗所用奶牛乳腺組織樣品取自前期已發(fā)表試驗[5,8]。選取4頭健康經(jīng)產(chǎn)荷斯坦泌乳奶牛[泌乳日齡：(101±10) d；體重：(574±36) kg；產(chǎn)奶量：(38±2) kg/d；2胎，懷孕1～2個月]，采用2×2交叉試驗設(shè)計。本試驗在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所動物營養(yǎng)學(xué)國家重點實驗室昌平基地4個大家畜人工環(huán)境控制艙(Kooland，北京庫藍科技有限公司；4.0 m×3.0 m×2.5 m；溫度15～40 ℃；相對濕度25%～85%；光照0～800 lx，連續(xù)可調(diào))內(nèi)進行。試驗共分2期，每期包含預(yù)試期和試驗期各9 d，2期間隔30 d。預(yù)試期所有試驗動物飼養(yǎng)于熱中性環(huán)境[溫度：20 ℃；相對濕度：55%；溫熱指數(shù)(THI)：65.5]，且自由采食。試驗期配對限飼組(PFTN組，n=4)奶牛繼續(xù)飼養(yǎng)于熱中性環(huán)境，熱應(yīng)激組(HS組，n=4)奶牛飼養(yǎng)于熱應(yīng)激環(huán)境(06：00—18：00 h：36 ℃，18：00—06：00 h：32 ℃；相對濕度：40%；THI=84.0/79.2)。THI計算參考Buffington等[17]的方法。THI設(shè)置參考熱應(yīng)激閾值[18]。PFTN組奶牛的某天飼喂量(采食量)占該組牛預(yù)試期DMI平均值百分比與熱應(yīng)激組此前1天DMI占該組牛預(yù)試期DMI平均值百分比(26.8%～61.0%)保持一致，即PFTN組相對于HS組錯后1 d開始和結(jié)束試驗以及采集樣品，保證試驗期內(nèi)HS組和PFTN組每天DMI保持一致[5,8]。

1.2 乳腺組織樣品采集

于每期的試驗期第10天采集乳腺組織樣品，詳細采集過程參照Gao等[8]和Bu等[19]所述方法。在樣品采集前，使用2%鹽酸利多卡因?qū)θ橄俳M織的左后區(qū)或右后區(qū)進行皮下局部麻醉。樣品采集完成后使用滅菌紗布進行壓迫止血，直至切口不再有明顯的血液流出，隨后使用米歇爾夾(11 mm；Henry Schein公司，美國)進行皮膚快速封閉。樣品采集后連續(xù)7 d監(jiān)測奶牛直腸溫度，產(chǎn)奶量及采食量。組織樣品采集后立即放液氮中冷凍保存。

1.3 總RNA提取及miRNA測序

1.4 數(shù)據(jù)分析

首先移除原始數(shù)據(jù)中包含poly-N、5′接頭污染、無3′接頭及低質(zhì)量的序列。同時計算原始數(shù)據(jù)的Q20、Q30和GC堿基含量。移除3′端接頭后，使用miRdeep2(2.0.0.5)[21]對長度為18～30 nt的miRNA序列進行提取，并使用默認參數(shù)與miRbase(20.0)參考miRNA進行比對識別已知miRNA及新miRNA。使用Bowtie對測序所得小RNA序列與牛的基因組(Bos taurus Bos_taurus_UMD_3.1.1)比對[22]，識別鑒定并移除miRNA中的tRNAs、rRNAs、snoRNAs。另外，只能映射到基因組重復(fù)位點的miRNA也被移除。使用miRanda[23]、PITA[24]、和RNAhybrid[25]對已知miRNA和新miRNA進行靶基因預(yù)測。并選擇2種或2種以上軟件中都成功預(yù)測的靶基因作為本研究中miRNA的靶基因，并用于下游分析。

使用DESeq2[26]進行miRNA的差異分析。對P值進行Benjamin & Hochberg[27]矯正，并使用矯正后P值(Padj)<0.05作為差異miRNA的閾值。使用DAVID(用于注釋、可視化和集成發(fā)現(xiàn)的數(shù)據(jù)庫，Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery，6.7；http://david.abcc.ncifcrf.gov/)[28]，對差異表達miRNA的靶基因進行基因本體(gene ontology，GO)生物過程和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)的功能注釋。

2 結(jié) 果

2.1 測序數(shù)據(jù)產(chǎn)出情況

本研究中每個組共3個文庫構(gòu)建成功，并平均產(chǎn)出24 847 562個錯誤率低于0.01%的序列。所有文庫的干凈數(shù)據(jù)中，配對堿基質(zhì)量分數(shù)高于20和30(Q20和Q30)的平均比率分別為98.52%和96.83%，平均GC含量為48.72%(表1)。

表1 HS組和PFTN組奶牛乳腺組織miRNA測序產(chǎn)出數(shù)據(jù)質(zhì)量Table 1 miRNA sequencing output data quality of dairy cows’ mammary tissue in HS group and PFTN group

2.2 已知miRNA和新miRNA識別及其靶基因預(yù)測

如表2所示，本研究共鑒定識別出已知miRNA 578個，新miRNA 139個。所有已知miRNA和新miRNA的潛在靶基因如補充材料1(https://doi.org/10.6084/m9.figshare.14315609.v1)中所示。

表2 已知miRNA和新miRNA與參考miRNA比對情況匯總Table 2 Statistics of known miRNA and novel miRNA predicting mapping to reference miRNA

續(xù)表2項目Items樣品Samples映射的成熟體Mapped mature映射的發(fā)夾結(jié)構(gòu)Mapped hairpin映射的單一小RNAMapped unique sRNA映射的所有小RNAMapped total sRNA新miRNANovel miRNA合計 Total1391441 0614 664HS16674138505HS28292166734HS393101217654PFTN17883141629PFTN28192174872PFTN3951042251 270

2.3 差異表達miRNA

如圖1及補充材料2(https://doi.org/10.6084/m9.figshare.14315609.v1)所示，在本研究識別出的578個已知miRNA和139個新miRNA中，共16個miRNA在HS組奶牛乳腺中相對于PFTN組差異表達(Padj<0.05)。其中，12個miRNA在HS組奶牛乳腺組織中相對于PFTN組表達上調(diào)，4個miRNA在HS組奶牛PFTN乳腺組織中相對于奶牛表達下調(diào)(表3)。16個差異表達的miRNA在每個樣品中的表達情況如圖2所示。

紅點代表在HS組奶牛乳腺中相對于PFTN組表達上調(diào)的miRNA，藍點代表HS組奶牛乳腺中相對于PFTN組表達下調(diào)的miRNA，灰點代表HS組和PFTN組之間奶牛乳腺中沒有顯著上調(diào)或下調(diào)的miRNA。差異表達miRNA選擇的閾值是Padj<0.05。Red points represent the up regulated miRNA in dairy cows mammary tissue of HS group compared with PFTN group, blue points represent the down regulated miRNA in dairy cows mammary tissue of HS group compared with PFTN group, grey points represent the not significantly up or down regulated miRNA in dairy cows mammary tissue between HS group and PFTN group. The selected threshold of differently expressed miRNA was Padj<0.05.圖1 HS組和PFTN組奶牛乳腺組織中差異表達miRNA火山圖Fig.1 Volcano plot of differently expressed miRNA in dairy cows’ mammary tissue between HS group and PFTN group

圖2 差異表達miRNA在HS組和PFTN組奶牛乳腺組織中的熱圖Fig.2 Heatmap of differently expressed miRNA in dairy cows’ mammary tissue between HS group and PFTN group

表3 16個HS組奶牛乳腺組織中相對PFTN組差異表達miRNATable 3 Sixteen differently expressed miRNA in dairy cows’ mammary tissue of HS group compared with PFTN group

2.4 差異表達miRNA的靶基因的功能富集

本研究使用DAVID對下調(diào)和上調(diào)miRNA的靶基因分別進行功能分析(圖3，P<0.05)。其中表達下調(diào)的miRNA的靶基因富集的GO生物過程包括：鐵離子轉(zhuǎn)運、典型Wnt信號通路、味覺、細胞內(nèi)鐵離子螯合、細胞增殖、核糖體大亞基組裝、白細胞介素2生成負調(diào)控、蛋白質(zhì)聚合、血小板活化、刺激響應(yīng)、鳥苷三磷酸酶(GTPase)激活和氧化還原過程；KEGG通路主要包括：吞噬體、Ras信號通路、AMP激活的蛋白質(zhì)激酶(AMPK)信號通路、賴氨酸降解、金黃色葡萄球菌感染、核糖體、趨化因子信號通路、醚類脂質(zhì)代謝和氨基糖和核苷酸糖代謝。下調(diào)的miRNA的靶基因富集的GO生物過程包括：細胞遷移的正向調(diào)節(jié)、細胞對腫瘤壞死因子的響應(yīng)、氧自由基響應(yīng)、白細胞介素-1響應(yīng)、呼吸氣體交換、轉(zhuǎn)化生長因子β受體信號通路、mRNA異化正向調(diào)控、干擾素-γ生成正相關(guān)、上皮細胞調(diào)控正向調(diào)控、細胞因子調(diào)控、血管內(nèi)皮生長因子生成的正向調(diào)控、甲狀腺激素刺激的細胞反應(yīng)和三羧酸循環(huán)；KEGG通路主要包括：AMPK信號通路、代謝通路、溶酶體、檸檬酸循環(huán)、胰島素信號通路、鞘脂類信號通路、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路、叉頭轉(zhuǎn)錄因子(FoxO)信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、ErbB信號通路、胰島素拮抗以及脂肪細胞因子信號通路。

GO_BP：基因本體生物過程；KEGG：京都基因與基因組百科全書；miRNA：差異表達miRNA的變化方向，其中“↑”代表表達上調(diào)，“↓”代表表達下調(diào)。綠色區(qū)域為被下調(diào)miRNA的靶基因富集的GO生物過程和KEGG通路，紅色區(qū)域為被上調(diào)miRNA的靶基因富集的GO生物過程和KEGG通路。GO_BP: gene ontology biology process; KEGG: Kyoto encyclopedia of genes and genomes; miRNA: the change direction of the differently expressed miRNA, “↑” represents up regulated, “↓” represents down regulated. The green areas were GO biology process KEGG pathway of enriched target genes of down regulated miRNAs the red areas were GO biology process KEGG pathway of enriched target genes of up regulated miRNA.圖3 HS組和PFTN組奶牛乳腺組織中差異表達miRNA靶基因的GO和KEGG功能富集分析Fig.3 GO and KEGG functional enrichment analysis of target genes of differently expressed miRNA in dairy cows’ mammary tissue between HS group and PFTN group

此外，本研究還對HS組奶牛乳腺組織中每個相對于PFTN組差異表達的miRNA的靶基因分別進行了功能富集分析(圖4)。在16個差異表達的miRNA中，除bta-miR-184、bta-miR-151-3p、bta-miR-3578、bta-miR-451外，其余12個差異表達的miRNA的靶基因均通過DAVID成功富集(P<0.05)。bta-miR-132的靶基因顯著富集的GO生物過程為吞噬的正向調(diào)控和炎癥反應(yīng)的負向調(diào)控。bta-miR-136的靶基因顯著富集的KEGG通路為內(nèi)分泌及其他因子調(diào)節(jié)的鈣離子的重吸收。bta-miR-147的靶基因顯著富集的GO生物過程為饑餓刺激的細胞響應(yīng)，KEGG通路為癌癥中的蛋白聚糖。bta-miR-218的靶基因顯著富集的GO生物過程為細胞質(zhì)鈣離子濃度的正向調(diào)控。bta-miR-885的靶基因顯著富集的GO生物過程為轉(zhuǎn)錄和DNA復(fù)制的調(diào)控，KEGG通路為糖酵解和糖異生。

GO_BP：基因本體生物過程；KEGG：京都基因與基因組百科全書。藍條為下調(diào)的miRNA的靶基因所富集的GO生物過程和KEGG通路，紅條為上調(diào)的miRNA的靶基因富集的GO生物過程和KEGG通路。黑色圓圈代表富集到相應(yīng)生物過程或通路的基因的數(shù)量，圓圈越大，代表富集的基因數(shù)量越多。GO_BP: gene ontology biology process; KEGG: Kyoto encyclopedia of genes and genomes. The blue bars were the GO biology process and KEGG pathway enriched by the target genes of the down regulated miRNA, while the red bars were the GO biology process and KEGG pathway enriched by the target genes of the up regulated miRNA. The black circles represented the number of target genes enriched in the corresponding biological processes or pathways, and the larger the circles, the more genes were enriched.圖4 HS組和PFTN組奶牛乳腺組織中每個差異表達miRNA的靶基因富集的GO生物過程和KEGG通路Fig.4 GO biology process and KEGG pathway of target genes of each differently expressed miRNA in dairy cows’ mammary tissue between HS group and PFTN group

bta-miR-365-5p的靶基因顯著富集的GO生物過程為肽酶活性的負調(diào)節(jié)，KEGG通路為弓形蟲病、胰腺癌、乙型肝炎、FoxO信號通路和慢性髓細胞白血病。bta-miR-382的靶基因顯著富集的GO生物過程為變形生長因子β受體信號通路和糖異生，KEGG通路為胰島素拮抗、胰高血糖素信號通路、糖酵解/糖異生、AMPK信號通路、脂肪細胞因子信號通路。bta-miR-502a的靶基因顯著富集的KEGG通路為破骨細胞分化。bta-miR-493的靶基因顯著富集的GO生物過程為骨骼肌纖維發(fā)育、蛋白水解、組蛋白H3-K9三甲基化負調(diào)控、單核細胞趨化、淋巴細胞趨化、白細胞介素-1的細胞反應(yīng)、干擾素-γ的細胞反應(yīng)、細胞氧化劑解毒，KEGG通路為磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)、代謝通路、抗生素的生物合成、AMPK信號通路。bta-miR-338的靶基因顯著富集的GO生物過程為蛋白質(zhì)四聚化和肽或多糖抗原通過主要組織相容性復(fù)合體(MHC)Ⅱ類抗原的處理和呈遞，KEGG通路為肺結(jié)核、弓形體病、甲型流感、人類T細胞白血病病毒1型(HTLV-1)感染、移植物抗宿主病和哮喘。bta-miR-424-3p的靶基因顯著富集的GO生物過程為跨膜運輸、線粒體轉(zhuǎn)錄啟動子、核糖體rRNA導(dǎo)入線粒體、輻射響應(yīng)、激素響應(yīng)、復(fù)制叉保護、細胞內(nèi)調(diào)節(jié)pH、血管內(nèi)皮生長因子生成的正調(diào)控、聚腺苷酸化依賴的mRNA異化過程、DNA結(jié)合的負調(diào)控和胚胎發(fā)育，KEGG通路為小細胞肺癌和嘧啶代謝。bta-miR-6516的靶基因顯著富集的GO生物過程為感官味覺感知、核糖體大亞基組裝、刺激響應(yīng)、蛋白質(zhì)聚合、血小板激活、氧化還原過程、神經(jīng)嵴細胞的遷移、白細胞介素-2生成的負調(diào)控、細胞生長的負調(diào)控、細胞死亡負調(diào)控、血管生成的負調(diào)控、鐵離子轉(zhuǎn)運、細胞增殖、典型Wnt信號通路和血管生成；KEGG通路為Ⅰ型糖尿病、Ras信號通路、癌癥通路、黑色素生成、賴氨酸降解、HTLV-1感染、乙醚脂質(zhì)代謝、補體和凝血級聯(lián)反應(yīng)和細胞周期。

3 討 論

熱應(yīng)激可以降低乳蛋白的含量和產(chǎn)量在前期研究中已多次報道[3,5,29]。通過設(shè)置PFTN組，發(fā)現(xiàn)DMI下降只能部分解釋熱應(yīng)激誘導(dǎo)的乳蛋白合成的減少[4-5,30]。截至目前，熱應(yīng)激誘導(dǎo)的乳蛋白合成的下降的原因仍不甚清楚，但可能涉及幾個生物系統(tǒng)的變化，包括因營養(yǎng)重分配引起的乳蛋白前體物的供應(yīng)不足[5,7]，由于乳腺組織能量供應(yīng)不足導(dǎo)致的mTOR信號通路激活的抑制[5,31]，以及乳腺細胞內(nèi)代謝的整體抑制和炎癥反應(yīng)激活[8]。

成熟的miRNA可以與靶mRNA結(jié)合，通過mRNA降解或翻譯抑制在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達[32]。單個miRNA甚至可以靶向調(diào)節(jié)多達數(shù)百個在調(diào)節(jié)細胞穩(wěn)態(tài)和對各種刺激的反應(yīng)的過程中起主要作用的基因的表達[9,33-34]。Li等[16]在熱應(yīng)激和非熱應(yīng)激奶牛的乳腺中鑒定出483個牛已知miRNA和139個新miRNA。而本研究在HS組和PFTN組奶牛乳腺中鑒定出578個牛已知miRNA和139個新miRNA。其中bta-miR-451在Li等[16]的研究結(jié)果及本研究中都顯著上調(diào)。Guelfi等[35]和Pasquariello等[36]研究表明，bta-miR-451在卵泡發(fā)育和卵母細胞成熟過程中具有重要的功能作用。但bta-miR-451在乳腺組織中的功能目前還沒有相關(guān)報道。本研究對bta-miR-451的16個靶基因使用DAVID進行功能預(yù)測，但是所有富集的通路均不顯著。然而，值得注意的是，異檸檬酸脫氫酶3催化亞基α(IDH3A)是bta-miR-451的靶基因之一。已知異檸檬酸脫氫酶可以催化異檸檬酸氧化脫羧生成2-氧戊二酸，是檸檬酸循環(huán)中的關(guān)鍵酶。May等[37]研究證實，IDH3A基因的功能缺失可抑制檸檬酸循環(huán)的進行，并抑制氧化磷酸化。有趣的是，本團隊的前期研究發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激可以很大程度上抑制乳腺組織中能量代謝相關(guān)通路的基因表達[8]，其中包括：氧化磷酸化、丙酸代謝和檸檬酸循環(huán)。Bionaz等[38]認為mTOR-胰島素信號通路的激活需要能量，而mTOR信號通路的激活在調(diào)控乳蛋白合成中起著關(guān)鍵作用。因此，在本研究中，bta-miR-451的上調(diào)可能通過參與乳腺能量代謝的調(diào)控，從而參與乳蛋白合成下降的調(diào)控。

此外，bta-miR-885和bta-miR-184在Li等[16]和本研究中均出現(xiàn)差異表達。其中bta-miR-885表達量在本研究中顯著下調(diào)，而在Li等[16]的研究結(jié)果中卻顯著上調(diào)。人類臨床研究表明miR-885在肝癌中起抑癌作用，可調(diào)控肝癌細胞的增殖和從上皮細胞向間質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)化[39]。此外，循環(huán)系統(tǒng)中miR-885在包括肝癌、肝硬化、乙肝、急性肝損傷或藥物毒性等肝臟病理情況中也出現(xiàn)升高[40-41]。Ylioja等[42]的研究發(fā)現(xiàn)，奶牛血液中游離脂肪酸含量升高時，初乳中miR-885含量降低，表明肝臟功能與miR-885之間存在潛在的聯(lián)系。本研究預(yù)測出28個bta-miR-885的靶基因。功能富集分析表明，bta-miR-885的靶基因顯著富集于轉(zhuǎn)錄和DNA復(fù)制的調(diào)控和糖酵解/糖異生。然而，本團隊前期研究表明HS組奶牛乳腺組織中糖酵解/糖異生相對于PFTN組顯著下調(diào)。因此，bta-miR-885在熱應(yīng)激誘導(dǎo)的乳蛋白下降的過程中的作用，仍需要進一步的研究分析。

除bta-miR-885外，本研究中bta-miR-184在HS組奶牛乳腺組織中相對于PFTN組的表達量變化也與Li等[16]的研究結(jié)果不一致，但與Salama等[43]的結(jié)果一致，即熱應(yīng)激增加了bta-miR-184在奶牛乳腺組織中的表達量。本研究共預(yù)測得到7個bta-miR-184的靶基因，但靶基因的功能富集分析均不顯著。Bu等[10]研究分析了奶牛乳腺上皮細胞中的miRNA表達譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)bta-miR-184是體外培養(yǎng)乳腺細胞中表達豐度最高的miRNA。Phua等[44]認為miR-184的激活可以抑制三陰性乳腺癌細胞系的體外增殖和自我更新，以及延緩原發(fā)腫瘤的形成和降低體內(nèi)轉(zhuǎn)移負擔，提示過表達miR-184將導(dǎo)致細胞生長停滯。此外值得注意的是，本研究中另外2個具有癌細胞抑制功能的miRNA(bta-miR-218和bta-miR-493)也在HS組奶牛乳腺組織中相對于PFTN組表達量下調(diào)。其中miR-218被認為可以通過抑制細胞增殖和誘導(dǎo)細胞凋亡來抑制癌細胞的增殖[45-48]，miR-493可以抑制細胞生長和細胞遷移能力來抑制癌細胞[45,49-50]。有趣的是，Salama等[43]研究發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激時促凋亡基因B細胞淋巴瘤/白血病-2相關(guān)X蛋白(Bax)的表達量出現(xiàn)上調(diào)。Tao等[46]也證實了熱應(yīng)激可降低干奶期奶牛乳腺細胞增殖率。綜上所述，本研究中HS組奶牛乳腺組織中bta-miR-184、bta-miR-218和bta-miR-493表達量與PFTN組相比上調(diào)，可能通過影響乳腺細胞的增殖或更新，干擾乳腺組織中乳蛋白的合成。

本研究中bta-miR-6516的表達量在HS組奶牛乳腺組織中下調(diào)，并發(fā)現(xiàn)548個bta-miR-6516的靶基因，高于其他15個差異表達的miRNA。這或許表明bta-miR-6516在HS組奶牛乳腺組織中有更廣泛的影響。目前，還沒有關(guān)于bta-miR-6516或miR-6516的相關(guān)研究報道。本研究中對bta-miR-6516的靶基因的功能預(yù)測顯示，其靶基因主要富集于細胞增殖或細胞生長相關(guān)生物過程或通路，這似乎與bta-miR-184、bta-miR-218和bta-miR-493的功能相反，但考慮到bta-miR-6516在乳腺組織中的表達量遠低于bta-miR-184、bta-miR-218和bta-miR-493，因而熱應(yīng)激對乳腺細胞的增殖的抑制效應(yīng)或許會強于促進效應(yīng)。

在16個差異表達的miRNA中，bta-miR-151-3p在HS組和PFTN組奶牛的乳腺組織中均是表達量最高的miRNA。bta-miR-151-3p共預(yù)測發(fā)現(xiàn)5個潛在的靶基因。Lu等[47]在所有6種腎病亞型兒童腎組織中均發(fā)現(xiàn)miR-151-3p的表達量出現(xiàn)下調(diào)，提示miR-151-3p的異常表達可能參與了兒童腎臟疾病的發(fā)病機制，并與腎小球損傷相關(guān)。Mc Nally等[48]證實miR-151-3p的高表達與膽管癌切除術(shù)后總生存期的改善相關(guān)。然而，對于miR-151-3p在乳腺中的作用，目前尚缺乏研究。

除bta-miR-151-3p外，bta-miR-136和bta-miR-382也是在HS組和PFTN組奶牛乳腺組織中也高表達的miRNA，且在HS組奶牛乳腺組織中與PFTN組相比表達量上調(diào)。bta-miR-136的靶基因主要富集于內(nèi)分泌及其他鈣離子重吸收調(diào)節(jié)因子相關(guān)通路。Jin等[51]研究發(fā)現(xiàn)，添加低氧劑可顯著促進體外培養(yǎng)細胞的凋亡，降低miR-136的表達，而過表達miR-136的細胞則可以緩解缺氧引起的細胞副作用，提示過表達miR-136可保護神經(jīng)細胞不受缺氧應(yīng)激的損傷。然而，本研究中HS組奶牛乳腺組織中bta-miR-136表達量出現(xiàn)上調(diào)的原因仍不清楚。bta-miR-382的靶基因主要富集于一些信號通路，及與糖異生和胰島素拮抗相關(guān)的通路，這與我們之前的結(jié)果是一致的，即熱應(yīng)激抑制了乳腺組織中糖酵解/糖異生、胰高糖素信號通路、胰島素拮抗和脂肪細胞因子信號通路相關(guān)基因的表達[8]。因此，bta-miR-382的上調(diào)可能與mRNA水平的調(diào)控具有協(xié)同作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，HS組奶牛乳腺組織中bta-miR-3578表達量相對于PFTN組下調(diào)，共預(yù)測出bta-miR-3578的靶基因17個。然而，靶基因的富集分析的通路或生物過程均不顯著，且目前沒有關(guān)于bta-miR-3578功能的相關(guān)報道。

HS組奶牛乳腺組織中bta-miR-365-5p表達量相對于PFTN組上調(diào)。功能注釋分析表明，bta-miR-365-5p的靶基因主要富集于癌癥、弓形體病和肝炎相關(guān)的通路或生物過程。Mori等[52]證實，miR-365的表達可能在人胎盤發(fā)育和半異體胚胎的免疫保護中發(fā)揮重要作用。Chen等[53]的結(jié)果表明，miR-365在循環(huán)拉伸應(yīng)變(cyclic tensile strain，CTS)處理的細胞中顯著上調(diào)，并在CTS介導(dǎo)的軟骨形成中發(fā)揮重要作用。但bta-miR-365-5p在HS奶牛乳腺中的潛在功能目前仍不清楚。

bta-miR-338的靶基因富集于與哮喘、肺結(jié)核、弓形體病等疾病相關(guān)的通路或生物過程。Nie等[54]和Zheng等[55]認為miR-338-3p可以靶向肝細胞和紅細胞中糖酵解的關(guān)鍵酶——丙酮酸激酶，然后抑制肝癌細胞的Warburg效應(yīng)。因此，本研究中bta-miR-338表達量的下調(diào)似乎提示HS組奶牛乳腺組織中糖酵解被激活。然而，在本團隊前期研究發(fā)現(xiàn)，與PFTN組相比，HS組奶牛乳腺組織中糖酵解/糖異生通路被抑制，丙酮酸激酶的表達降低[8]。因此，bta-miR-338在熱應(yīng)激誘導(dǎo)的乳蛋白合成下降中的作用仍需進一步研究。此外，靶基因顯著富集于破骨細胞分化相關(guān)通路的bta-miR-502a，目前有關(guān)研究也很有限，其在熱應(yīng)激誘導(dǎo)的乳蛋白合成下降中的作用仍需要進一步研究分析。

本研究中，在HS組奶牛乳腺組織中顯著上調(diào)的bta-miR-132的靶基因顯著富集于吞噬正調(diào)控和炎癥反應(yīng)負調(diào)控相關(guān)通路中。因此，HS組奶牛乳腺組織中bta-miR-132表達量的上調(diào)似乎表明HS組奶牛乳腺組織中炎癥反應(yīng)被激活。與此一致的是，本團隊前期對HS組奶牛乳腺組織中差異表達mRNA的生物信息學(xué)分析表明，熱應(yīng)激誘導(dǎo)了奶牛乳腺組織中炎癥反應(yīng)的發(fā)生[8]。Aten等[56]認為miR-132可能在應(yīng)激反應(yīng)和焦慮的調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Diao等[57]證實miR-132可以通過靶向細胞因子信號抑制因子5在慢性阻塞性肺疾病中促進人單核細胞樣細胞和人支氣管上皮細胞的炎癥反應(yīng)。綜上所述，本研究結(jié)果似乎提示bta-miR-132可能在熱應(yīng)激誘導(dǎo)的乳腺組織的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮了一定作用。

功能注釋分析表明，bta-miR-147的靶基因顯著富集于細胞饑餓反應(yīng)和癌癥中蛋白質(zhì)多糖相關(guān)通路。Liu等[58]研究發(fā)現(xiàn)，miR-147b在脂多糖(LPS)刺激后的肺泡巨噬細胞中過度表達。Xu等[59]研究發(fā)現(xiàn)，miR-147在大鼠牙周炎誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中表達顯著上調(diào)，并證實miR-147對巨噬細胞活化的正向調(diào)控機制。然而，bta-miR-147在HS組奶牛乳腺組織中的作用無法根據(jù)以往的研究進一步推測。

bta-miR-424-3p的靶基因顯著富集于與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細胞反應(yīng)、嘧啶代謝等相關(guān)通路或生物過程。Dastmalchi等[60]證實miR-424-5p作為腫瘤抑制因子可抑制癌細胞增殖。然而，在食管鱗癌細胞中，miR-424被發(fā)現(xiàn)可通過影響細胞周期來促進細胞增殖[61]。因此，miR-424對細胞增殖的調(diào)控作用可能是多種多樣的，且依賴于細胞類型。因而，bta-miR-424-3p對乳腺細胞增殖的影響還不能確定。

綜上所述，在16個差異表達的miRNA中，似乎bta-miR-451、bta-miR-184、bta-miR-218、bta-miR-493、bta-miR-382和bta-miR-132更可能通過上述機制參與熱應(yīng)激下乳腺組織內(nèi)代謝或生理功能的變化，進而影響乳蛋白合成。此外，對下調(diào)和上調(diào)miRNA的全部靶基因進行整體的功能注釋分析，發(fā)現(xiàn)被熱應(yīng)激抑制的能量代謝、mTOR和脂肪細胞信號相關(guān)的通路，也被上調(diào)的miRNA的靶基因所富集。因而表明，miRNA和mRNA在調(diào)節(jié)熱應(yīng)激誘導(dǎo)的乳腺組織中代謝的變化過程中具有協(xié)同效應(yīng)。

4 結(jié) 論

① HS組奶牛乳腺組織中有16個miRNA相對于PFTN組差異表達。

② bta-miR-451可能參與能量代謝變化的調(diào)控，bta-miR-184、bta-miR-218和bta-miR-493可能參與細胞增殖的調(diào)控，bta-miR-132可能參與炎癥反應(yīng)的調(diào)控，bta-miR-382可能與熱應(yīng)激下乳腺mRNA表達的調(diào)節(jié)有協(xié)同作用。

③ miRNA可能參與了熱應(yīng)激條件下乳腺的代謝和生理變化，為進一步驗證miRNA在熱應(yīng)激誘導(dǎo)的乳蛋白合成減少過程中的作用提供了科學(xué)依據(jù)。