齊富友 蹇順華 劉 吟 段麗萍 吳 昭

(1. 武漢黃鶴樓香精香料有限公司，湖北 武漢 430040；2. 武漢黃鶴樓新材料科技開發(fā)有限公司，湖北 武漢 430040)

白蘇(PerillafrutescensL.Britt.)，唇形科紫蘇屬植物。現(xiàn)有研究證明，白蘇葉具有抑菌、升血糖、保護腸胃、鎮(zhèn)靜、抗衰老等作用[1-3]，且對動物油脂、肉類和調味食品等具有較強的抗氧化活性[4]。植物揮發(fā)油一般是從植物不同部位(種子、根、花、葉、果實、樹皮等)加工獲得的揮發(fā)性物質，也是天然香料的重要組成部分[5]。但揮發(fā)油穩(wěn)定性較差，提取效果易受原料來源、品種、加工方法等影響。傳統(tǒng)的提取方法有壓榨法、水蒸氣蒸餾、溶劑萃取等[6-7]，但存在純度低、提取效能差、溶劑殘留的缺點，現(xiàn)在常用超聲、微波、超臨界流體萃取等方法[8-9]，其中超臨界與超聲、微波相比，香氣更天然[10]，還可添加夾帶劑，萃取的揮發(fā)油成分較完整，無殘留，無毒、無污染，符合國家大力倡導的綠色發(fā)展理念，因此仍是天然植物提取應用的主流方向，尤以食品、揮發(fā)油及天然香料的提取分離最為熱門[11-12]。

目前，關于白蘇葉揮發(fā)油的提取多采用水蒸氣蒸餾和超聲提取，但提取時間長和得率不理想[13]。試驗擬以白蘇葉為研究原料，通過響應面試驗優(yōu)化超臨界CO2萃取白蘇葉揮發(fā)油提取工藝條件，通過氣相色譜—質譜(GC-MS)分析白蘇葉揮發(fā)油的化學成分，并以DPPH·和·OH的清除能力來評價白蘇葉揮發(fā)油的抗氧化力，旨在提升白蘇葉的實用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

白蘇葉：恩施自治州農科院；

硫酸亞鐵、水楊酸、30%過氧化氫：AR級，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設備

高速粉碎機：FW-200型，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；

超臨界CO2萃取裝置：HA221-50-06型，江蘇南通華安超臨界萃取有限公司；

旋轉薄膜蒸發(fā)儀：HD-205型，瑞士BUCH公司；

氣相色譜—質譜聯(lián)用儀：Agilent GC 6890-MS5973N型，美國Agilent公司。

1.2 方法

1.2.1 白蘇葉處理 將白蘇葉洗凈放入烘箱內，80～90 ℃下干燥24 h，用刀切成段后粉碎，過50目篩得到粒度分布均勻的粉末，備用。

1.2.2 超臨界CO2萃取 取處理后的白蘇葉250 g，裝入萃取罐內，設定萃取壓力20 MPa，溫度45 ℃，CO2流量30 L/h；其他條件參照文獻[14]，按式(1)計算提取率。

(1)

式中：

R——白蘇葉揮發(fā)油的提取率，%；

m1——白蘇葉揮發(fā)油的質量，g；

m2——白蘇葉原料的質量，g。

1.2.3 水蒸氣蒸餾提取 參照文獻[15]，稱取白蘇葉粉末250 g裝入燒瓶，倒入1/3體積的蒸餾水和10 mL的萃取劑乙酸乙酯，加熱2 h，按式(1)計算提取率。

1.2.4 理化指標測定

(1)色澤：按GB/T 22460—2008執(zhí)行。

(2)透明度、氣滋味：按GB/T 5525—2008執(zhí)行。

(3)過氧化值：按GB/T 5538—2005執(zhí)行。

(4)酸值：按GB/T 5530—2005執(zhí)行。

1.2.5 因素選擇 設定萃取壓力(25 MPa)、溫度(40 ℃)、時間(1.5 h)、CO2流量(25 L/h)為固定值，依次改變萃取壓力(15～35 MPa，每個水平增加5 MPa，共5個水平)、萃取溫度(30～50 ℃，每個水平增加5 ℃，共5個水平)、萃取時間(0.5～2.5 h，每個水平增加0.5 h，共5個水平)和CO2流量(15～35 L/h，每個水平增加5 L/h，共5個水平)，探討提取率受各因素的影響程度。

1.2.6 響應面Box-Behnken設計 根據單因素試驗結果選定影響較顯著的3個因素，設置響應值為白蘇葉揮發(fā)油提取率，借助Box-Behnken工具進行數據分析，并對模型預測的工藝設置進行重復試驗。

1.2.7 白蘇葉揮發(fā)油的GC-MS分析

(1)色譜條件：色譜柱為DB-5MS毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進樣口溫度230 ℃；載氣為高純He；流速l mL/min(恒流)；柱頭壓83 kPa；進樣量1.5 μL；分流比20∶1；程序升溫起始溫度60 ℃，停留l min，以5 ℃/min的升溫速率升至260 ℃保持5 min。

(2)質譜條件：EI離子源；電離能量70 eV；離子源溫度190 ℃；傳輸線溫度250 ℃；掃描范圍50～550；檢索譜庫為NIST譜庫。

1.2.8 抗氧化活性測定 參照文獻[16]。

1.2.9 數據分析 所有試驗樣品重復3次。運用Excel、Origin 2019b和 Design Expert 8.0.6 軟件處理數據。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗

如圖1所示，壓力上升至25 MPa時提取率顯著增加，繼續(xù)加壓提取率反而有所下降，最終壓力選擇20～30 MPa；溫度為40 ℃時提取能力穩(wěn)定，持續(xù)升溫不能提高提取率，可能是較高溫度會降低揮發(fā)油的穩(wěn)定性，故萃取溫度初步定為35～45 ℃；萃取時間在0.5～1.5 h時，揮發(fā)油提取率迅速增加，1.5 h后溶液與溶質充分接觸達到平衡，繼續(xù)延長時間提取率也難以提高，所以選用1.5 h左右為提取時間較合適；當CO2流量由25 L/h變?yōu)?0 L/h時，揮發(fā)油提取率顯著增加，繼續(xù)增加揮發(fā)油提取率反而下降，在白蘇葉揮發(fā)油萃取試驗中，CO2流量為30 L/h左右最佳。

2.2 響應面試驗

2.2.1 響應面試驗設計及結果 比較單因素試驗結果，最終設置CO2流量30 L/h，選擇萃取壓力、萃取溫度和萃取時間為響應變量(表1)，設定響應值為白蘇葉揮發(fā)油提取率進行響應面分析(表2)。

對響應面試驗數據進行回歸分析得各影響因素與響應值的模型回歸方程：

圖1 萃取壓力、萃取溫度、萃取時間和CO2流量對白蘇葉揮發(fā)油提取率的影響Figure 1 Effects of extraction pressure,extraction temperature,extraction time and CO2 flow on the yield of volatile oil from Perilla frutescens leaf

Y=2.45+0.31A-0.26B+0.56C-0.13AB+0.29AC+0.25BC-0.96A2-0.49B2-0.27C2。

(2)

由圖2可知，萃取時間一定時，隨著萃取壓力和萃取溫度的升高，響應值Y(白蘇葉揮發(fā)油提取率)先升高后下降，當萃取壓力提升至25 MPa、萃取溫度至40 ℃附近時，白蘇葉揮發(fā)油提取率存在最大值。萃取溫度和萃取壓力一定時，響應值同樣隨著其他因素水平的提升先增加后降低。其中萃取壓力和萃取時間的影響最顯著，響應曲面較陡，與回歸模型方差分析結果一致。

表1 響應面試驗因素及水平表Table 1 Experiment design of response surface factor

表2 響應面試驗設計方案和結果Table 2 The RSM design and results

表3 回歸模型方差分析?Table 3 Regression coefficient and variance analysis

圖2 各參數交互作用的影響Figure 2 Effects of interaction with different factors

2.2.3 工藝驗證 模型預測的最佳工藝組合為：萃取壓力26.56 MPa、萃取溫度39.76 ℃，萃取時間2.0 h，其預測揮發(fā)油提取率約為2.83%?？紤]生產應用的可行性，以萃取壓力27 MPa、萃取溫度40 ℃、萃取時間2.0 h進行驗證實驗(n=5)。結果表明，白蘇葉揮發(fā)油提取率為(2.71±1.19)%，與預測值(2.83%)非常接近。相同提取時間下，提取率比水蒸氣蒸餾高67%。

2.3 白蘇葉揮發(fā)油品質分析

2.3.1 萃取工藝對白蘇葉揮發(fā)油品質的影響 由表4可知，超臨界CO2萃取與水蒸氣蒸餾相比，揮發(fā)油各指標均有一定程度改善，香氣更接近天然香味，可能是因為超臨界CO2萃取工藝溫度低，較好地保留了熱敏性物質的天然活性。夾帶劑乙醇的加入能一定程度降低過氧化值和酸值，但其機理尚不清楚。

表4 白蘇葉揮發(fā)油的主要質量指標Table 4 The main quality index of Perilla leaf oil

2.3.2 白蘇葉揮發(fā)油GC-MS分析 對白蘇葉揮發(fā)油進行GC-MS分析，其總離子流圖如圖3所示，共分離出55個峰，并采用面積歸一化法計算白蘇葉揮發(fā)油各組分相對含量，結果見表5。共51種成分被鑒定出，鑒定出的物質成分占總峰的98.49%，其主要成分是酯類、醇類和烯類化合物。在鑒定出的化合物中，相對含量在1%以上的有7種，占被檢測物質總量的90.83%，其中乙酸芳樟酯的相對含量達到54.22%，其次是芳樟醇(19.59%)、松油烯(5.06%)、丙酸葉醇酯(4.94%)、β-石竹烯(3.37%)、橙花醇乙酸酯(2.34%)、石竹素(1.31%)等。

圖3 白蘇葉揮發(fā)油的總離子流色譜圖Figure 3 Total ion flow chromatography of volatile oil from Perilla frutescens leaf

2.4 白蘇葉揮發(fā)油的抗氧化活性

2.4.1 清除DPPH·能力 由圖4可知，白蘇葉揮發(fā)油對DPPH·具有很好的清除作用，清除率隨濃度的增加而變強，呈明顯的量效關系。白蘇葉揮發(fā)油濃度為60～80 μL/mL時，對DPPH·的清除率變化平緩。相同濃度下白蘇葉揮發(fā)油對DPPH·清除率低于維生素C。濃度為80 μL/mL時，對DPPH·的清除率為89.21%。

表5 白蘇葉揮發(fā)油成分的GC-MS分析結果Table 5 GC-MS analysis of volatile oil from Perilla frutescens leaf

2.4.2 清除·OH能力 由圖5可知，揮發(fā)油濃度為20～60 μL/mL時，隨著濃度的升高其對·OH的清除率顯著增強；濃度>80 μL/mL時，白蘇葉揮發(fā)油對·OH清除率與維生素C接近，說明白蘇葉揮發(fā)油與維生系C的抗氧化活性相當。

圖4 白蘇葉揮發(fā)油對DPPH·的清除率Figure 4 Scavenging rate of volatile oil to DPPH· from Perilla frutescens leaf

圖5 白蘇葉揮發(fā)油對·OH的清除率Figure 5 Scavenging rate of volatile oil to ·OH from Perilla frutescens leaf

3 結論

超臨界CO2萃取白蘇葉揮發(fā)油的最適參數為萃取壓力27 MPa、萃取溫度40 ℃、萃取時間2.0 h，此條件下白蘇葉揮發(fā)油實際提取率可達(2.71±1.19)%。與水蒸氣蒸餾法對比提取率高67%，且白蘇葉揮發(fā)油各理化指標均有一定程度改善，香氣更接近天然香味，加入夾帶劑能一定程度降低揮發(fā)油過氧化值和酸值。通過GC-MS分析，白蘇葉揮發(fā)油中含有51種化學成分，主要是酯類、醇類和烯類化合物?？寡趸囼灡砻靼滋K葉揮發(fā)油對DPPH·自由基和·OH自由基清除能力與白蘇葉揮發(fā)油濃度呈正相關，具有一定的抗氧化能力，可作為一種天然抗氧化劑原料。

白蘇葉作為一種常見中藥和日常調味品，在人們的生活中占據重要地位。但由于白蘇葉揮發(fā)油的組成成分豐富，其抗氧化機理及清除自由基活性成分分析仍需進一步研究。下一步，擬開展不同夾帶劑對揮發(fā)油提取率及對品質的影響，并對揮發(fā)油中主要的活性成分進一步分離純化，探討其體內體外抗氧化機理。