易馮梅，謝文博，李 浩，曾 磊，李 文，雷福厚

(廣西民族大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院；林產(chǎn)化學(xué)與工程國家民委重點實驗室；廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程重點實驗室；廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程協(xié)同創(chuàng)新中心，廣西 南寧 530006)

喜樹堿(CPT)是從喜樹中提取得到的一類天然植物抗癌藥物[1-2]。喜樹堿作為一種原料藥具有重要的生產(chǎn)及研究價值，主要提取方法有堿法提取、超聲波提取、索氏回流提取等。這些方法雖然能較好地分離純化喜樹堿，但也存在明顯的不足，如堿性或酸性溶液萃取產(chǎn)生的廢液會污染環(huán)境，從而帶來后處理問題；此外，醇提取會產(chǎn)生副產(chǎn)物，超聲波提取使得喜樹堿結(jié)構(gòu)破壞的機率大大增加，從而降低提取率[3-6]。因此，開發(fā)低毒、高效地分離純化喜樹堿的方法意義重大。制備液相色譜是一種從混合物中純化目標物的高性能技術(shù)[7]，具有分離效率高、產(chǎn)物純度高、產(chǎn)率高和經(jīng)濟環(huán)保等優(yōu)點，被廣泛用于天然產(chǎn)物的分離純化中[8-11]。該方法的關(guān)鍵是通過高負載、高分離度的制備柱來實現(xiàn)的[12]，固定相作為色譜柱的核心，它的選擇尤為重要[13-14]。球形硅膠因具有表面易于修飾、機械強度高、比表面積大等優(yōu)點而被廣泛用作色譜固定相[15-17]，但硅膠表面的硅羥基使得其pH耐受性降低，同時還增加了堿性化合物的拖尾[18]。因此，可在硅膠表面鍵合聚合物來提高其重復(fù)性和耐久性。鍵合在硅膠表面的聚合物應(yīng)具有較高的機械強度和適當(dāng)?shù)慕宦?lián)度，用來保持固定相的色譜性能[19-20]。松香是以松樹分泌物松脂為原料，通過水蒸氣蒸餾得到的一種天然樹脂，具有經(jīng)濟、環(huán)保、可生物降解等優(yōu)點，主要成分為樅酸，結(jié)構(gòu)中的菲環(huán)骨架使其具有較好的分子剛性及藥物相容性[21-23]。松香改性后得到的馬來海松酸丙烯酸乙二醇酯，可與甲基丙烯酸共聚形成松香基高分子聚合物，該聚合物在結(jié)構(gòu)上與生物堿相似，表面的羧基官能團可為生物堿結(jié)構(gòu)中的氮原子提供結(jié)合位點形成酸堿配合物，同時具有優(yōu)異的結(jié)構(gòu)剛性和穩(wěn)定性。因此，該聚合物可用于鍵合二氧化硅用作色譜固定相來分離生物堿。本課題組以松香為原料合成出了松香基高分子微球，以此為液相色譜固定相，成功分離了喜樹堿[24-25]、紫杉醇[26]及多環(huán)芳烴[27]，但仍存在微球粒徑分布較寬的問題?；谇捌诘难芯砍晒狙芯坎捎弥苽湫透咝б合嗌V法，以粒徑均一的烷基化硅球為載體，馬來海松酸丙烯酸乙二醇酯為交聯(lián)劑，甲基丙烯酸為功能單體，通過涂覆-懸浮自由基聚合法制備出核殼型SiO2@松香基高分子高效液相制備柱，并用來分離純化喜樹堿，以期制備原料來源廣泛、綠色環(huán)保的色譜固定相，從而為喜樹堿的分離純化提供新思路。

1 實 驗

1.1 原料、試劑與儀器

喜樹(CamptothecaacuminataDecne.)果，購于廣西南寧；馬來海松酸丙烯酸乙二醇酯，廣西梧州日成林產(chǎn)化工股份有限公司；硅膠，蘇州納微科技公司；石油醚(沸點60～90 ℃)、3-(異丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(γ-MPTMS)、喜樹堿標準品(純度≥98%)、偶氮二異丁腈，阿拉丁試劑公司；甲醇，色譜級，美國Fisher Scientific公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

Nicolet iS10傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)儀，美國Nicolet公司；SUPRA55 Sapphire場發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM)，德國卡爾蔡司公司；JEOL JEM-2100F場發(fā)射透射電子顯微鏡(TEM)，日本JEOL公司；LC-20AR制備型液相色譜(LC)儀、LC-15C高效液相色譜(HPLC)儀，日本島津公司；ASAP 2020M比表面積及微孔物理吸附儀，美國Micromeritics公司；TG209F1熱重(TG)分析儀，德國耐馳公司。

1.2 核殼型SiO2@松香基高分子(SiO2@R)固定相的制備與表征

1.2.1固定相的制備 稱取50 g粒徑10 μm的球形硅膠置于三口燒瓶中，加入500 mL 10%鹽酸，在80 ℃下油浴回流反應(yīng)8 h，反應(yīng)在氮氣保護下進行。反應(yīng)結(jié)束后抽濾，將硅膠洗至中性，真空干燥，得到活化硅膠。稱取50 g活化硅膠置于三口燒瓶中，分別加入20 mL吡啶、500 mL無水甲苯和50 mL 3-(異丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷，在80 ℃下油浴回流反應(yīng)8 h。反應(yīng)結(jié)束后，依次用甲醇、丙酮和正己烷潤洗幾次，抽濾，真空干燥，得到烷基化硅膠。稱取0.56 g馬來海松酸丙烯酸乙二醇酯交聯(lián)劑、0.08 g 甲基丙烯酸、0.004 g偶氮二異丁腈(AIBN)和0.17 g致孔劑異辛烷溶于3 mL氯仿配成油相，稱取硅膠質(zhì)量8%的油相(硅膠質(zhì)量為40 g)溶于300 mL氯仿配成混合溶液，將混合溶液均勻涂覆到40 g烷基化硅膠表面，并置于裝有十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液的三口燒瓶中，在85和95 ℃下各冷凝回流2 h。產(chǎn)物經(jīng)無水乙醇索氏提取24 h后過篩，真空干燥，得到核殼型SiO2@松香基高分子固定相。制備過程如圖1所示。

圖1 核殼型SiO2@松香基高分子固定相合成示意圖Fig.1 Synthesis route of core-shell SiO2@rosin-based polymer stationary phase

1.2.2固定相的表征 將活化硅膠、烷基化硅膠與核殼型SiO2@松香基高分子固定相在80 ℃下真空干燥12 h，將干燥后的樣品與KBr按質(zhì)量比1 ∶200壓成樣品片，使用紅外光譜儀在4000～500 cm-1范圍下掃描32次。取少量樣品置于4 mL PE管內(nèi)，加入甲醇超聲波處理使其分散均勻，使用毛細管將樣品涂到金屬片上，進行噴鉑處理，使用SEM和TEM對樣品進行形貌觀察。將固定相在100 ℃進行脫氣后使用比表面積及微孔物理吸附儀測定比表面積、平均孔徑和孔體積。在N2保護下，使用熱重分析儀測定固定相從30 ℃以10 ℃/min的速率升溫到900 ℃的TG曲線。采用細胞計數(shù)試劑盒8(CCK8)法，按照ISO 10993—12:2007標準制備質(zhì)量濃度為200 mg/L的浸提液，對核殼型SiO2@松香基高分子固定相進行細胞毒性檢測。

1.3 核殼型SiO2@松香基高分子色譜柱的制備與評價

1.3.1色譜柱的制備 稱取固定相130 g左右，用一定量的甲醇超聲波分散均勻，使用裝柱機在41 MPa 下將固定相填充于30 mm×250 mm的不銹鋼色譜空柱，裝柱30 min，待柱壓變?yōu)榱愫?，靜置10 min，卸下色譜柱，裝上柱頭及篩板，得到核殼型SiO2@松香基高分子色譜柱(30 mm×250 mm，10 μm)。

1.3.2色譜柱的評價 以甲醇為流動相，將色譜柱的流速從0升高到20 mL/min，分別觀察并記錄液相色譜A、B泵的壓力。以甲苯為溶質(zhì)，甲醇為流動相，流速為30 mL/min，在室溫條件下測定色譜柱的理論塔板數(shù)[28]。使用尿嘧啶與烷基苯(苯、甲苯、乙苯、丙苯、丁苯)為探針，流速為17 mL/min，進樣量為0.85 mL，流動相為甲醇水溶液(體積分數(shù)40%～65%)，以5%的間隔改變甲醇比例，對色譜柱的保留機制進行考察[29]。在流動相為體積分數(shù)50%的甲醇水溶液，采用紫外吸收檢測器，檢測波長為254 nm，流速為17 mL/min，柱溫為室溫的色譜條件下，將尿嘧啶、苯、甲苯、二甲苯和萘的混合溶液重復(fù)進樣20次，來評價色譜柱的重復(fù)性[30]。

準備4類測試混合物Ⅰ～Ⅳ，通過分離這4類混合物對色譜柱進行Tanaka評價?；旌衔铫癜蜞奏?、丁基苯、戊基苯、鄰三聯(lián)苯和苯并菲，以V(甲醇)∶V(水)=80 ∶20作為流動相；混合物Ⅱ包括尿嘧啶、咖啡因和苯酚，以V(甲醇)∶V(水)=30 ∶70作為流動相；混合物Ⅲ包括尿嘧啶、苯甲胺和苯酚，以V(甲醇)∶V(0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液，pH值7.6)=30 ∶70 作為流動相；混合物Ⅳ的組成與混合物Ⅲ相同，以V(甲醇)∶V(0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液，pH值2.7)=30 ∶70為流動相，以上4種混合物均在流速17 mL/min，檢測波長254 nm的條件下進行測試[30]。

1.4 喜樹堿粗提物的制備

稱取干燥的喜樹果50 g，粉碎至粒徑約0.6 mm，用300 mL無水甲醇回流提取60 min，重復(fù)提取3次，將提取液過濾、合并、減壓濃縮后依次用石油醚和氯仿萃取，收集氯仿層，減壓濃縮得粗提物約10 g。粗提物經(jīng)甲醇溶解配成質(zhì)量濃度為1.44 g/L的溶液，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，備用。

1.5 核殼型SiO2@松香基高分子色譜柱分離純化條件

根據(jù)核殼型SiO2@松香基高分子高效液相色譜柱(4.6 mm×250 mm，10 μm)分離生物堿的最佳條件[24]，使用從分析型色譜柱(分析柱)到制備型色譜柱(制備柱)常用的線性放大公式，其中上樣量放大估算公式見式(1)，流速放大估算公式見式(2)：

V=(R2×L)/(r2×l)×v

(1)

U=(R2×L)/(r2×l)×u

(2)

式中：V—制備柱進樣體積，mL；v—分析柱進樣體積，mL；R—制備柱內(nèi)徑，mm；r—分析柱內(nèi)徑，mm；L—制備柱柱長，mm；l—分析柱柱長，mm；U—制備柱流速，mL/min；u—分析柱流速，mL/min。

色譜柱為核殼型SiO2@松香基高分子制備柱(30 mm×250 mm，10 μm)。在流動相中甲醇體積分數(shù)80%～100%，流速5～13 mL/min，柱溫為室溫，檢測器為紫外吸收檢測器，檢測波長254 nm，上樣量0.6～1.4 mL的條件下，分別考察流動相中甲醇體積分數(shù)(80%～100%)、上樣量(0.6～1.4 mL)和流速(5～13 mL/min)對喜樹堿分離純化效果的影響。

1.6 高效液相色譜分析條件

采用HPLC分析檢測核殼型SiO2@松香基高分子制備柱的純化產(chǎn)物。色譜柱為shim-pack GISS C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相V(甲醇)∶V(水)=60 ∶40，流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃，檢測波長254 nm，上樣量20 μL。

1.7 加標回收率實驗

精密稱取喜樹堿標準品0.005 1 g至100 mL容量瓶中，用甲醇定容，作為儲備液。精密稱取已知純度(2.21%)的喜樹果粗提物0.010 0 g至100 mL容量瓶中，加甲醇定容后，取8 mL溶液至10 mL容量瓶中，制備6份，1～3份依次加入儲備液366 μL，4～6份依次加入儲備液440 μL。甲醇定容，搖勻，得供試品溶液，計算加標回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 核殼型SiO2@R固定相的表征

2.1.1SEM和TEM分析 將馬來海松酸丙烯酸乙二醇酯涂覆在烷基化硅膠表面，發(fā)生自由基聚合后形成一層殼層，核殼型SiO2@松香基高分子固定相的形貌分析如圖2所示。

活化硅膠activated silica gels:a.SEM;b.TEM;核殼型固定相core-shell stationary phase:c.SEM;d.TEM圖2 不同樣品的SEM和TEM圖Fig.2 SEM and TEM images of different samples

由圖2(a)和(c)可以看出，活化硅膠和固定相均具有良好的球形結(jié)構(gòu)，粒徑約10 μm，且分布較均一；與活化硅膠相比，固定相表面粗糙程度增加，存在附著物；比較圖2(b)和(d)可知，固定相的表面附著物清晰可見。上述結(jié)果表明，已成功制備了核殼型SiO2@松香基高分子固定相。

2.1.2孔隙結(jié)構(gòu)分析 活化硅膠與核殼型SiO2@松香基高分子固定相的比表面積和孔結(jié)構(gòu)如表1所示。從表1可以看出，固定相的比表面積、平均孔徑和孔體積均小于活化硅膠。這可能與松香基高分子鍵合到硅膠表面堵住了原有的孔結(jié)構(gòu)而引起數(shù)值的減小。

表1 不同樣品的孔隙結(jié)構(gòu)Table 1 Pore structure of different samples

a.硅膠silica gels;b.烷基化硅膠silanated silica gels;c.核殼型固定相core-shell stationary phase

2.1.4TG分析 對核殼型SiO2@松香基高分子固定相進行熱重分析，結(jié)果見圖4。

a.硅膠silica gels;b.烷基化硅膠silanated silica gels;c.核殼型固定相core-shell stationary phase

由圖4可知，在400 ℃左右，固定相質(zhì)量損失加劇，800 ℃時固定相的質(zhì)量殘留率為86.8%；與烷基化硅膠相比，質(zhì)量損失率增加了4.51個百分點，主要為固定相上鍵合的松香基高分子聚合物熱分解所致。由此可進一步證明核殼型SiO2@松香基高分子固定相已成功制備，同時也說明固定相具有良好的熱穩(wěn)定性。

2.1.5細胞毒性檢測 核殼型SiO2@松香基高分子固定相的細胞毒性檢測結(jié)果見圖5。由圖5可知，在CCK8質(zhì)量濃度為200 mg/L時，固定相的相對細胞存活率為88.72%，而商業(yè)樹脂苯乙烯型樹脂的相對細胞存活率為82.00%。相比商業(yè)樹脂，固定相細胞毒性更低，安全環(huán)保，綠色無害，可用于喜樹堿的分離純化。

紅色red:死細胞dead cells;綠色green:活細胞living cellsa.苯乙烯型樹脂styrene-based anionic resin;b.核殼型固定相core-shell stationary phase圖5 不同樣品的細胞毒性圖Fig.5 The cytotoxicity of different samples

2.2 核殼型SiO2@R制備柱的評價

2.2.1理論塔板數(shù)和流通性分析 根據(jù)1.3.2節(jié)方法測得核殼型SiO2@松香基高分子制備柱的理論塔板數(shù)為59 992。為測定制備柱的流通性，考察不同流速條件下液相色譜泵壓的變化，結(jié)果見圖6。由圖6可知，在0～20 mL/min范圍內(nèi)，壓力隨著流速的增加而增加，呈現(xiàn)較好的相關(guān)性，R2值為0.989 8，結(jié)果表明制備柱具有較好的流通性。

圖6 SiO2@R制備柱的流速與泵壓關(guān)系Fig.6 The relationship between flow rate and pumping pressure of SiO2@R

2.2.2保留機制分析 選取苯、甲苯、乙苯、丙苯和丁苯為代表性測試物，對制備柱進行保留機制考察，結(jié)果見圖7。由圖7可知，保留因子反映了組分在柱中的遷移速率，其值越大，化合物在該分析條件下的保留時間越長。隨著流動相中甲醇體積分數(shù)從40%增加到65%，5種疏水性測試物的保留在制備柱上呈現(xiàn)出逐漸減弱的趨勢，符合反相色譜的保留特征。因此，核殼型SiO2@松香基高分子制備柱具有典型的反相色譜保留機制。

2.2.3重復(fù)使用性能分析 將尿嘧啶、苯、甲苯、二甲苯和萘的混合溶液重復(fù)進樣20次，選取1～20次色譜峰作圖，結(jié)果如圖8所示。由圖可知，20次的色譜圖基本重合，多次進樣后，此制備柱仍能達到較好的分離效果，結(jié)果表明核殼型SiO2@松香基高分子制備柱具有較好的重復(fù)使用性能。

圖8 SiO2@R制備柱重復(fù)分離混合物的色譜圖Fig.8 Chromatograms of repeated separation of mixtures on SiO2@R

2.2.4Tanaka評價 測試4類混合物，得到6個參數(shù)做成雷達圖[30]，結(jié)果見圖9。

從圖9可以看出，核殼型SiO2@松香基高分子制備柱的疏水性小于C18制備柱，這可能與松香基高分子聚合物中的功能基團—COOH有關(guān)；空間選擇性明顯大于C18制備柱，表明該制備柱適合分離結(jié)構(gòu)中含有類似菲環(huán)骨架的天然藥物,可能是SiO2表面聚合的松香基高分子聚合物的菲環(huán)骨架在保留機制中發(fā)揮了作用。

2.3 核殼型SiO2@R制備柱分離喜樹堿

2.3.1分離條件優(yōu)化

2.3.1.1最佳流速的選擇 甲醇作為流動相組分具有價格低廉、易分離的特點，同時喜樹堿溶于甲醇，因此選擇甲醇作為流動相組分。根據(jù)線性放大之后的理論流速應(yīng)為13 mL/min，根據(jù)理論流速考察不同流速(5～13 mL/min)下主成分的分離效果，其他色譜條件為流動相為95%甲醇/水、進樣體積0.85 mL，結(jié)果見圖10(a)。由圖10(a)可知，隨著流速的增加，分離時間逐漸縮短，喜樹堿與其相鄰雜質(zhì)峰之間的分離度先升高后下降。當(dāng)流速為7和9 mL/min時，分離度分別為2.942和2.899；7 mL/min時分離時間更長，更有利于其他雜質(zhì)的分離。綜合考慮分離度、主成分的出峰時間和經(jīng)濟成本，選擇7 mL/min為最佳流速。

2.3.1.2流動相比例的選擇 除了流速，流動相的比例也對樣品的分離效果和分離時間有影響。通過優(yōu)化甲醇水溶液中甲醇體積分數(shù)使樣品達到理想的分離效果。在流動相流速為7 mL/min、進樣體積為0.85 mL條件下，考察了流動相中不同甲醇體積分數(shù)(80%～100%)對分離效果的影響，結(jié)果見圖10(b)。由圖10(b)可知，隨著流動相中甲醇體積分數(shù)的降低，出峰時間延遲；與此同時，喜樹堿與其相鄰雜質(zhì)峰之間的分離度先升高后降低。當(dāng)使用95%甲醇/水為流動相時分離度為3.096，達到最大，且分離時間在30 min以內(nèi)，故選擇甲醇/水體積比95 ∶5為流動相最佳組成比例。

2.3.1.3最佳上樣量的選擇 制備色譜需要在不影響純度的情況下獲得最大制備量來提高工作效率。上樣量是影響樣品分離度和純度的一個重要因素。隨著上樣量的增加，主成分與相鄰雜質(zhì)間的分離度會逐漸減小，雜質(zhì)峰與主成分重疊影響純度。根據(jù)線性放大之后的理論進樣體積為0.85 mL，在樣品質(zhì)量濃度為1.44 g/L的條件下，根據(jù)理論進樣體積考察不同上樣量(以換算后的進樣體積0.6～1.4 mL計)對分離度的影響，結(jié)果見圖10(c)。

a.流速flow rates;b.甲醇體積分數(shù)methanol volume fraction;c.進樣體積sample volume圖10 不同液相條件下SiO2@R制備柱分離喜樹果粗提物的色譜圖Fig.10 Chromatograms of crude extracts of C. acuminata fruit separated by SiO2@R at different liquid conditions

由圖10(c)可知，隨著進樣體積的增加，喜樹堿與相鄰雜質(zhì)峰之間的分離度逐漸減小，由0.6 mL時的1.75減小到1.4 mL時的1.48。當(dāng)上樣量為1.4 mL時，相鄰組分無法實現(xiàn)分離；當(dāng)進樣體積為1.2 mL時，喜樹堿與前后雜質(zhì)峰的分離度均大于1.5。同時考慮產(chǎn)品的純度及分離效率，選擇進樣體積為1.2 mL，經(jīng)換算上樣量約為1.728 mg。綜上所述，使用核殼型SiO2@松香基高分子制備柱分離純化喜樹堿的最佳色譜條件如下：流動相為甲醇/水(體積比95 ∶5)，流速為7 mL/min，進樣體積1.2 mL(上樣量約1.728 mg)，檢測波長為254 nm。在該條件下對喜樹堿粗提物進行分離純化，在24.65～25.41 min處收集餾分，經(jīng)減壓濃縮除去溶劑得到喜樹堿。

2.3.2喜樹堿的純度測定 采用1.6節(jié)的HPLC方法檢測，結(jié)果見圖11。喜樹果粗提物的純度為42.30%，得率約20%。經(jīng)核殼型SiO2@松香基高分子制備柱分離所得的喜樹堿化合物的純度為88.08%。傳統(tǒng)硅膠不能將喜樹堿與相鄰雜質(zhì)峰分開，所得純化產(chǎn)物純度僅為1.26%。與傳統(tǒng)硅膠相比，核殼型SiO2@松香基高分子制備柱的純化效果提高了86.82個百分點。與喜樹果粗提物相比，經(jīng)制備柱分離純化所得喜樹堿目標化合物的雜質(zhì)峰明顯減少，其純度提高了45.78個百分點。

2.3.3加樣回收率測定 采用1.7節(jié)的方法，計算加標回收率，平均加標回收率為96.46%，小于100%，說明固定相對喜樹堿存在一定的不可逆吸附作用。RSD為1.45%，小于3%，說明回收率好，加標回收率<100%。

a.CPT標準品standard;b.喜樹果粗提物 crude extracts from camptotheca;c.目標化合物 target compound圖11 不同樣品的HPLC圖Fig.11 HPLC chromatograms of different samples

3 結(jié) 論

3.1以粒徑均一的烷基化硅球為載體，甲基丙烯酸為功能單體、馬來海松酸丙烯酸乙二醇酯為交聯(lián)劑、偶氮二異丁腈為引發(fā)劑，通過涂覆-聚合法合成了核殼型SiO2@松香基高分子色譜固定相。采用紅外光譜、掃描電鏡、透射電鏡、熱重分析儀、比表面積及微孔吸附分析等方法對固定相進行了表征，結(jié)果表明：核殼型SiO2@松香基高分子固定相已制備成功，且固定相的細胞毒性低于商業(yè)樹脂。

3.2采用濕法裝柱制備了核殼型SiO2@松香基高分子制備柱(30 mm×250 mm，10 μm)，并用于喜樹果粗提物的分離純化。實驗結(jié)果表明：制備柱的理論塔板數(shù)為59 992，具有較好的流通性和重復(fù)使用性。在室溫、甲醇/水(體積比95 ∶5)為流動相、檢測波長254 nm、流速7 mL/min和進樣體積1.2 mL(上樣量約1.728 mg)的優(yōu)化條件下，經(jīng)分離純化可得到純度為88.08%的喜樹堿，比浸膏初品的純度提高了45.78個百分點。該制備柱固定相制備方法簡單，原料綠色環(huán)保，方法高效、快速、可靠，操作簡單，為喜樹堿的分離純化提供了新思路。