1 適用范圍

1.1 本指南規(guī)定了直接飼喂微生物和發(fā)酵制品生產(chǎn)菌株鑒定及其安全性評價的基本原則、基本要求、評價方法以及結(jié)果判定。

1.2 本指南適用于新飼料添加劑評審和已經(jīng)批準(zhǔn)使用的飼料添加劑再評價時，對直接飼喂微生物和發(fā)酵制品生產(chǎn)菌株開展的鑒定及其安全性評價，包括發(fā)酵制品中與生產(chǎn)菌株直接相關(guān)的安全性評價。

1.3 本指南僅涵蓋直接飼喂微生物和發(fā)酵制品與生產(chǎn)菌株相關(guān)的鑒定及其安全性評價，產(chǎn)品的其他安全性評價按照相關(guān)規(guī)定和指南開展。

1.4 本指南所稱微生物包括細(xì)菌、酵母和絲狀真菌。其他如古菌、微藻等微生物的相關(guān)評價可參照本指南要求，采取個案分析評價。

1.5 本指南適用于通過農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價、獲得農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全證書的轉(zhuǎn)基因微生物生產(chǎn)菌株及其發(fā)酵制品的相關(guān)內(nèi)容評價。

1.6 飼料或飼料原料發(fā)酵生產(chǎn)所用微生物菌株的鑒定及其安全性相關(guān)內(nèi)容評價參照本指南進(jìn)行。

2 術(shù)語和定義

以下術(shù)語和定義適用于本指南。

2.1 直接飼喂微生物（Direct-Fed microorganisms）

在飼料中添加或直接飼喂給動物的活的微生物飼料添加劑。

2.2 發(fā)酵制品（Fermentation products）

微生物在受控制條件下，通過生命活動生產(chǎn)的特定代謝產(chǎn)物經(jīng)分離、提取、純化、精制和干燥等工藝制成的飼料添加劑，如氨基酸、維生素、酶制劑等。

2.3 抗微生物藥物（Antimicrobial）

合成或天然存在的能殺死微生物或抑制其在動物或人體內(nèi)生長或繁殖的活性物質(zhì)，在本指南中特指抗菌藥物。

注：本指南中抗菌藥物包括用于人體或動物的世界衛(wèi)生組織（WHO）定義的極為重要抗菌藥物（CIAs）或高度重要抗菌藥物（HIAs）。

2.4 獲得性耐藥（Acquired antimicrobial resistance）

在對特定抗菌藥物典型敏感的菌種中，由于獲取外源基因或基因突變引起某一菌株對該抗菌藥物產(chǎn)生的耐藥。

2.5 關(guān)注基因（Gene of concern）

已知毒力因子的編碼基因、耐藥基因，以及與已知毒性化合物產(chǎn)生等有關(guān)的基因。

2.6 臨界值（Cut-off value）

根據(jù)抗菌藥物對特定微生物類群（種或?qū)伲┑淖畹鸵志鷿舛龋∕IC）分布而設(shè)定的，用于耐藥判定的值。

2.7 轉(zhuǎn)基因微生物（Genetically modified microorganisms）

利用基因工程技術(shù)改變基因組構(gòu)成的重組微生物。

2.8 危害（Hazard）

飼料中對人和動物健康有潛在不良影響的生物、化學(xué)或物理性因素或條件。

2.9 風(fēng)險（Risk）

飼料中危害產(chǎn)生某種不良健康影響的可能性或嚴(yán)重性。

習(xí)近平總書記強(qiáng)調(diào)“打好扶貧攻堅(jiān)戰(zhàn)，要采取穩(wěn)定脫貧措施，建立長效扶貧機(jī)制，把扶貧工作鍥而不舍抓下去”［9］。在精準(zhǔn)推進(jìn)脫貧攻堅(jiān)戰(zhàn)中，社區(qū)教育應(yīng)根據(jù)實(shí)際，因地制宜地采取更加靈活的教學(xué)或培訓(xùn)形式，開展扶貧培訓(xùn)與扶貧教育。這更加符合貧困群眾脫貧的實(shí)際需求，能夠讓貧困群眾感受到培訓(xùn)內(nèi)容并非只停留于理論，也可以運(yùn)用培訓(xùn)所學(xué)投入到生產(chǎn)實(shí)際中，早日擺脫貧困。這樣，社區(qū)教育在精準(zhǔn)扶貧中才能做到“扶真貧”“真扶貧”。

2.10 產(chǎn)毒能力（Toxigenicity）

微生物產(chǎn)生對人和動物有毒作用的活性代謝產(chǎn)物的能力。

2.11 致病性（Pathogenicity）

微生物感染宿主造成健康損害引起疾病的能力。

2.12 毒性（Toxicity）

微生物有毒代謝產(chǎn)物引起的宿主健康損傷。

3 基本原則

3.1 直接飼喂微生物和發(fā)酵制品生產(chǎn)菌株鑒定及其安全性評價應(yīng)基于當(dāng)前的科學(xué)認(rèn)知開展，具體的評價試驗(yàn)應(yīng)遵循本指南規(guī)定的一般原則，并結(jié)合直接飼喂微生物和發(fā)酵制品特征屬性進(jìn)行方案設(shè)計和試驗(yàn)實(shí)施。

3.2 直接飼喂微生物和發(fā)酵制品生產(chǎn)菌株鑒定及其安全性評價試驗(yàn)應(yīng)按照國家、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)或參照國際組織標(biāo)準(zhǔn)檢測方法、技術(shù)規(guī)范等進(jìn)行，若無相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)檢測方法、技術(shù)規(guī)范則按照行業(yè)公認(rèn)的檢測方法進(jìn)行。

3.3 直接飼喂微生物和發(fā)酵制品生產(chǎn)菌株鑒定及其安全性評價試驗(yàn)（包括檢測）應(yīng)由具備微生物相關(guān)專業(yè)知識和試驗(yàn)技能的專業(yè)人員在具備相應(yīng)設(shè)施設(shè)備的試驗(yàn)場所，按照規(guī)范的操作程序進(jìn)行。試驗(yàn)應(yīng)在有效的質(zhì)量控制下開展，并且由試驗(yàn)機(jī)構(gòu)指定的負(fù)責(zé)人負(fù)責(zé)。用于新飼料添加劑申報的，微生物鑒定及其安全性評價試驗(yàn)應(yīng)由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部指定的評價試驗(yàn)機(jī)構(gòu)開展。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部尚未指定評價試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的，應(yīng)由具有相應(yīng)條件和能力的檢測評價機(jī)構(gòu)開展。

3.4 直接飼喂微生物或發(fā)酵制品生產(chǎn)中使用復(fù)合菌株時，應(yīng)分別針對每個菌株開展相關(guān)評價。

3.5 本指南中涉及的用于菌株安全性分析、比對、評價的相關(guān)數(shù)據(jù)庫、藥物名單等，應(yīng)采用最新版本。

3.6 鑒于菌株在使用過程中可能產(chǎn)生變異或衰退，開展安全性評價時應(yīng)充分考慮菌株鑒定報告及安全性評價相關(guān)檢測報告的時效性。

4 基本要求

通過形態(tài)觀察、生理生化檢測和分子生物學(xué)分析等技術(shù)方法對直接飼喂微生物和發(fā)酵制品生產(chǎn)菌株進(jìn)行鑒定。通過表型試驗(yàn)、分子生物學(xué)試驗(yàn)、全基因組序列（WGS）分析、相關(guān)文獻(xiàn)資料綜述等，對微生物產(chǎn)毒能力和致病性、抗菌藥物敏感性、抗菌藥物產(chǎn)生等特性進(jìn)行評價，對直接飼喂微生物和發(fā)酵制品生產(chǎn)菌株安全性進(jìn)行綜合評估。不同微生物及生產(chǎn)菌株評價基本要求見表1。

5 評價方法

5.1 微生物鑒定

5.1.1 基本信息

明確直接飼喂微生物和發(fā)酵制品生產(chǎn)菌株的來源、屬名、種名（包括中文學(xué)名、拉丁學(xué)名等）和菌株名稱或編號。細(xì)菌的命名應(yīng)遵循原核生物系統(tǒng)學(xué)國際委員會（ICSP）的規(guī)定，并符合原核生物國際命名法規(guī)（ICNP）要求。酵母和絲狀真菌的命名應(yīng)符合國際藻類、真菌和植物命名法規(guī)（ICN）的要求。明確菌株的改良史，包括實(shí)施的誘變步驟和遺傳修飾。轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)菌株的遺傳修飾按照5.6的要求進(jìn)行描述。

5.1.2 鑒定

直接飼喂微生物和發(fā)酵制品生產(chǎn)菌株應(yīng)明確鑒定至少到種或亞種水平。若根據(jù)最新方法和當(dāng)前知識菌株無法明確鑒定至已有物種，應(yīng)進(jìn)行菌株及其近緣種的系統(tǒng)發(fā)育分析。

5.1.2.1 細(xì)菌鑒定

綜合形態(tài)觀察、生理生化檢測、分子生物學(xué)分析對細(xì)菌進(jìn)行鑒定。

——形態(tài)觀察：包括菌落顏色、形狀、邊緣、透明度等宏觀形態(tài)觀察，以及菌體大小、形狀、革蘭氏染色反應(yīng)、是否有芽胞、芽胞的著生位置等微觀形態(tài)觀察。

——生理生化檢測：包括碳源利用、氮源利用、氧化酶反應(yīng)、過氧化氫酶反應(yīng)等關(guān)鍵生理生化特征檢測。

——分子生物學(xué)分析：如16S rDNA序列、持家基因序列或WGS等分析。用于新飼料添加劑申報的，應(yīng)利用WGS數(shù)據(jù)進(jìn)行分析鑒定。

表1 菌株鑒定及其安全性評價基本要求

5.1.2.2 酵母菌鑒定

綜合形態(tài)觀察、生理生化檢測、分子生物學(xué)分析對酵母菌進(jìn)行鑒定。

——形態(tài)觀察：包括菌落質(zhì)地、顏色、邊緣等宏觀形態(tài)觀察，以及菌體大小、形狀、是否有真假菌絲、生殖方式等微觀形態(tài)觀察。

——生理生化檢測：包括碳源利用、糖類發(fā)酵、氮源利用等關(guān)鍵生理生化特征檢測。

——分子生物學(xué)分析：如26S rDNA、ITS rDNA等特征序列或WGS分析。

5.1.2.3 絲狀真菌鑒定

綜合形態(tài)觀察、分子生物學(xué)分析對絲狀真菌進(jìn)行鑒定。

——形態(tài)觀察：包括菌落的質(zhì)地、顏色、生長速度、色素的產(chǎn)生等宏觀形態(tài)觀察，以及菌絲的顏色、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)的大小及發(fā)生方式、孢子顏色、形狀、是否具有有性生殖結(jié)構(gòu)等微觀形態(tài)觀察。

——分子生物學(xué)分析：如18S rDNA序列、ITS rDNA序列及其他特征基因（如微管蛋白基因、鈣調(diào)蛋白基因、翻譯延伸因子等）序列或WGS分析。

5.2 WGS測序

采用二代和三代測序技術(shù)對直接飼喂微生物和發(fā)酵制品生產(chǎn)菌株進(jìn)行全基因組測序，獲得其基因組完成圖，測序報告至少應(yīng)包括以下信息：

DNA提取方法；測序方案和儀器；序列組裝方法，如生物信息學(xué)方法、從頭測序或重測序等；序列質(zhì)量評價，如平均Phred得分、reads數(shù)目、覆蓋度、N50和K-mer等；WGS的FASTA電子文件；相對于預(yù)期基因組大小的contigs總長度；基因注釋方法；對于酵母和絲狀真菌，還需提供從相關(guān)數(shù)據(jù)庫（如BUSCO數(shù)據(jù)庫）獲得的注釋質(zhì)量信息。

5.3 產(chǎn)毒能力和致病性

應(yīng)通過國內(nèi)外安全性評價資料綜述、動物致病性試驗(yàn)和WGS分析對直接飼喂微生物和發(fā)酵制品生產(chǎn)菌株的產(chǎn)毒能力和致病性進(jìn)行綜合評價，其中絲狀真菌還應(yīng)開展產(chǎn)毒試驗(yàn)。

鑒于屎腸球菌（Enterococcus faecium）和芽胞桿菌（Bacillusspp.）已有成熟的致病性評價方法，可分別按附錄A和附錄B開展評價。

5.3.1 國內(nèi)外文獻(xiàn)資料綜述

通過國內(nèi)外文獻(xiàn)數(shù)據(jù)檢索（具體要求見附錄C），收集整理菌株的國內(nèi)外使用歷史、安全性評價資料，包括對人和靶動物的產(chǎn)毒能力和致病性的相關(guān)信息；若無該評價菌株的上述資料，應(yīng)收集整理同種內(nèi)其他菌株或與其相近種屬的相關(guān)信息。若對菌株進(jìn)行了任何降低毒性和致病性的選育（包括誘變和/或遺傳修飾），應(yīng)予以說明。

5.3.2 動物致病性試驗(yàn)

制備直接飼喂微生物或發(fā)酵制品生產(chǎn)菌株的菌懸液，將其作為受試物，通過腹腔注射和經(jīng)口灌胃等途徑給予實(shí)驗(yàn)動物，評價不同暴露途徑下受試物對實(shí)驗(yàn)動物的致病性。動物致病性試驗(yàn)按照國家、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法開展。

5.3.3 WGS分析

5.3.3.1 細(xì)菌

將菌株WGS與最新數(shù)據(jù)庫（包括但不限于VFDB、PAI DB、CGE等）中存儲的序列進(jìn)行比對，分析菌株遺傳物質(zhì)中是否存在已知毒力因子的編碼基因。分析結(jié)果重點(diǎn)關(guān)注該種或近緣種中已知毒力因子（如毒素、入侵與粘附因子）的完整編碼基因。結(jié)果至少應(yīng)包括如下信息：基因名稱、定位（染色體或質(zhì)粒）、編碼蛋白的功能、覆蓋度（序列長度覆蓋度≥70%）、相似性百分比（輸入序列與數(shù)據(jù)庫中序列的匹配度≥80%）和e值（＜10-5）等。

5.3.3.2 酵母和絲狀真菌

若菌株有WGS數(shù)據(jù)，則通過定向搜索確定菌株是否存在與產(chǎn)毒相關(guān)的已知代謝途徑。

5.3.4 產(chǎn)毒試驗(yàn)

對于絲狀真菌，應(yīng)在多種基質(zhì)和條件下（單品種固體、多品種固體復(fù)合、不同成分液體組合等）進(jìn)行產(chǎn)毒試驗(yàn)，并按照國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法或國際組織規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法進(jìn)行已知毒性化合物含量檢測。

對于發(fā)酵制品生產(chǎn)菌株，若產(chǎn)毒試驗(yàn)檢測到已知毒性化合物，還應(yīng)通過檢測分析證明發(fā)酵制品中不含該化合物或該含量下風(fēng)險無需關(guān)注。

5.3.5 結(jié)果分析

5.3.5.1 動物致病性試驗(yàn)顯示受試物組動物在試驗(yàn)期間出現(xiàn)中毒癥狀或死亡，或試驗(yàn)期間體重等指標(biāo)與對照組相比有顯著性差異時，則判定菌株具有致病性。

5.3.5.2 產(chǎn)毒試驗(yàn)檢測到已知毒性化合物時，則判定絲狀真菌菌株具有產(chǎn)毒能力。

5.3.5.3 動物致病性試驗(yàn)顯示無致病性的微生物，但WGS分析存在以下情況的，需結(jié)合國內(nèi)外文獻(xiàn)資料綜述、毒力因子編碼基因或產(chǎn)毒代謝相關(guān)基因發(fā)揮作用的機(jī)制、相關(guān)基因變?yōu)榛钚曰虻目赡苄缘惹闆r進(jìn)行綜合判斷。對于發(fā)酵制品生產(chǎn)菌株，還應(yīng)結(jié)合生產(chǎn)工藝、終產(chǎn)品中生產(chǎn)菌株和已知毒性化合物的存在情況等進(jìn)行綜合判斷。

——WGS分析顯示存在已知毒力因子的編碼基因（或產(chǎn)毒代謝相關(guān)基因）的細(xì)菌或酵母；

——產(chǎn)毒試驗(yàn)未檢測到已知毒性化合物，但WGS分析顯示存在產(chǎn)毒代謝相關(guān)基因的絲狀真菌。

5.4 抗菌藥物敏感性

直接飼喂微生物和發(fā)酵制品生產(chǎn)菌株為細(xì)菌的，應(yīng)開展抗菌藥物敏感性評價。通過開展測定抗菌藥物MIC值的表型試驗(yàn)和WGS分析，評價菌株是否具有獲得性耐藥。

5.4.1 表型試驗(yàn)

至少對菌株進(jìn)行附錄D所列抗菌藥物MIC值的測定。對于附錄D中未列出的細(xì)菌，革蘭氏陽性菌應(yīng)選擇附錄D中“棒狀桿菌和其他革蘭氏陽性菌”規(guī)定的抗菌藥物，革蘭氏陰性菌應(yīng)選擇附錄D中“腸桿菌科”規(guī)定的抗菌藥物。

MIC值測定應(yīng)采用瓊脂或肉湯二倍梯度稀釋法進(jìn)行定量測定，采用國際或國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)方法，如EUCAST、CLSI、ISO、WS等標(biāo)準(zhǔn)方法。除非抗菌藥物不適用定量方法進(jìn)行測定，否則不得采用定性或半定量方法（如擴(kuò)散法）間接測定MIC值。

MIC測定通常應(yīng)選擇藥物敏感性試驗(yàn)專用培養(yǎng)基，如Muelle-Hinton或IsoSensitest培養(yǎng)基。對于某些特定菌種或菌株，可以根據(jù)微生物特性選擇其他針對性培養(yǎng)基，如某些乳酸菌和雙歧桿菌的乳酸菌藥物敏感性試驗(yàn)培養(yǎng)基（LSM）。試驗(yàn)過程中應(yīng)同時關(guān)注培養(yǎng)基組分（如對氨基苯甲酸、胸苷、甘氨酸、二價陽離子等）、試驗(yàn)類型（肉湯微量稀釋或瓊脂稀釋）和培養(yǎng)條件（如pH、溫度、培養(yǎng)時間）等因素對某些抗菌藥物敏感水平的潛在影響。

通過將測定的MIC值與附錄D中給出的各抗菌藥物的臨界值進(jìn)行比較，以區(qū)分耐藥菌株和敏感菌株。

——MIC值≤臨界值時，認(rèn)為菌株對該抗菌藥物敏感；

——MIC值＞臨界值時，認(rèn)為菌株對該抗菌藥物耐藥。

對于附錄D中未列出的細(xì)菌，測定的MIC值應(yīng)與該種或相關(guān)種的已發(fā)表文獻(xiàn)值進(jìn)行比較。

5.4.2 WGS耐藥基因分析

對菌株WGS進(jìn)行分析，檢測對用于人或動物的抗菌藥物（WHO發(fā)布的CIAs或HIAs）耐藥的編碼基因或起促進(jìn)作用的基因。對菌株WGS進(jìn)行分析時，應(yīng)將其與最新耐藥基因分析數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，如CARD和ResFinder等。分析結(jié)果重點(diǎn)關(guān)注抗菌藥物耐藥性完整編碼基因，至少應(yīng)包括如下信息：基因名稱、定位（染色體或質(zhì)粒）、編碼蛋白的功能、覆蓋度（序列長度覆蓋度≥70%）、相似性百分比（輸入序列與數(shù)據(jù)庫中序列的匹配度≥80%）和e值（＜10-5）等。

5.4.3 結(jié)果分析

5.4.3.1 當(dāng)測定的MIC值≤臨界值（附錄D），若通過WGS分析未發(fā)現(xiàn)選定抗菌藥物的耐藥基因，則認(rèn)為菌株不具有獲得性耐藥；若通過WGS分析檢測到選定抗菌藥物的耐藥基因時，應(yīng)評估耐藥基因變?yōu)榛钚曰虻目赡苄裕ㄈ缗c活性基因序列進(jìn)行比較等），并進(jìn)行綜合判斷菌株是否具有獲得性耐藥。

5.4.3.2 當(dāng)測定的MIC值＞臨界值（附錄D），若通過WGS分析未發(fā)現(xiàn)與選定抗菌藥物表型相關(guān)的已知耐藥基因，則認(rèn)為菌株不具有獲得性耐藥；若通過WGS分析檢測到與抗菌藥物表型直接相關(guān)的已知耐藥基因，則認(rèn)為菌株具有獲得性耐藥。

5.4.3.3 對所有菌株，若通過WGS分析，發(fā)現(xiàn)存在除附錄D中選定抗菌藥物以外的其他CIAs或HIAs的耐藥基因，則應(yīng)分別測定對應(yīng)抗菌藥物的MIC值，并與文獻(xiàn)值進(jìn)行比較：

——當(dāng)MIC值≤文獻(xiàn)值，應(yīng)評估耐藥基因變?yōu)榛钚曰虻目赡苄裕ㄈ缗c活性基因序列進(jìn)行比較等），并進(jìn)行綜合判斷菌株是否具有獲得性耐藥；

——當(dāng)MIC值＞文獻(xiàn)值，則認(rèn)為菌株具有獲得性耐藥。

5.5 抗菌藥物產(chǎn)生

應(yīng)對直接飼喂微生物和發(fā)酵制品生產(chǎn)菌株是否產(chǎn)生人或動物用抗菌藥物（WHO發(fā)布的CIAs或HIAs）進(jìn)行評價，已知不產(chǎn)生人或動物用抗菌藥物的微生物菌種除外。產(chǎn)品生產(chǎn)過程中若使用任何抗菌藥物，應(yīng)予以說明。

應(yīng)評價培養(yǎng)物上清液對抗菌藥物敏感的參考菌株的抑菌活性。推薦EUCAST、CLSI等相關(guān)方法中的參考菌株，也可使用國家級菌種保藏中心的等效菌株，也可根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)情況增加參考菌株。若檢測結(jié)果顯示擬評價菌株培養(yǎng)物上清液對一種或一種以上參考菌株出現(xiàn)抑菌活性，應(yīng)對抑菌物質(zhì)進(jìn)行鑒定，確定其是否為人或動物用抗菌藥物。

若用于發(fā)酵制品的生產(chǎn)菌株能產(chǎn)生人或動物用抗菌藥物，應(yīng)證明發(fā)酵制品中無抗菌藥物殘留。應(yīng)明確說明用于抗菌藥物殘留檢測樣品的具體采樣階段。樣品應(yīng)來自工業(yè)化生產(chǎn)線，若尚無工業(yè)化產(chǎn)品，可采用中試產(chǎn)品。

5.6 生產(chǎn)菌株的遺傳修飾

若發(fā)酵制品生產(chǎn)菌株為轉(zhuǎn)基因微生物，應(yīng)對菌株遺傳修飾信息進(jìn)行如下描述。

5.6.1 遺傳修飾目的

說明遺傳修飾的目的，以及遺傳修飾后微生物表型和代謝相關(guān)的特性及其變化。

5.6.2 遺傳修飾的序列特征

詳細(xì)描述插入、缺失、堿基對置換或移碼突變等遺傳修飾的序列特征。

5.6.2.1 插入序列

轉(zhuǎn)基因微生物的插入序列可來自于特定生物體，也可以通過設(shè)計獲得。當(dāng)插入的DNA是由不同來源的序列組合而成時，應(yīng)分別提供每條序列的相關(guān)信息。

（1）來源于特定供體的DNA

提供供體生物屬和種水平的分類學(xué)信息。若序列來自環(huán)境樣品，應(yīng)提供與其最近的直系同源基因。對插入序列的描述應(yīng)包括以下內(nèi)容：

——所有插入元件的核苷酸序列，包括功能注釋以及所有功能元件的物理圖譜；

——插入元件的結(jié)構(gòu)和功能，包括編碼和非編碼區(qū)；

——編碼蛋白質(zhì)的名稱，推導(dǎo)的氨基酸序列和功能，提供編碼酶的EC編號（如有）。

（2）設(shè)計序列

設(shè)計序列是非自然存在的基因序列，如密碼子優(yōu)化基因、合理設(shè)計嵌合/合成基因或包含嵌合序列的基因等。描述應(yīng)包括以下內(nèi)容：

——設(shè)計原理和策略；

——DNA序列和功能元件的物理圖譜；

——推導(dǎo)氨基酸序列和編碼蛋白質(zhì)的功能；

——應(yīng)通過與最新數(shù)據(jù)庫（如ENA、NCBI、UniProt等）比對，確定重組蛋白的功能結(jié)構(gòu)域，并描述數(shù)據(jù)庫中與插入序列相似性最高的蛋白信息。

5.6.2.2 缺失序列

對有意缺失的序列進(jìn)行描述，并說明預(yù)期效果。

5.6.2.3 堿基對替換和移碼突變

應(yīng)對引入的堿基對替換和/或移碼突變進(jìn)行說明，并說明其預(yù)期效果。

5.6.3 遺傳修飾結(jié)構(gòu)分析

推薦采用WGS進(jìn)行生產(chǎn)菌株遺傳修飾結(jié)構(gòu)的特征分析。

5.6.3.1 細(xì)菌遺傳修飾結(jié)構(gòu)分析

用于新飼料添加劑申報的，應(yīng)利用WGS分析菌株遺傳修飾的結(jié)構(gòu)特征。應(yīng)提供包括遺傳修飾的所有基因組區(qū)域（染色體、重疊群或質(zhì)粒）圖譜或圖示的詳細(xì)說明，包括：

——插入、修飾或缺失的開放閱讀框（ORF）。應(yīng)詳細(xì)描述每個ORF的基因產(chǎn)物信息，至少包括氨基酸序列、功能和代謝作用。重點(diǎn)描述引入的關(guān)注基因，包括毒力/產(chǎn)毒、產(chǎn)臨床相關(guān)抗菌藥物、耐藥性等相關(guān)基因。

——插入、缺失、修飾的非編碼序列。對序列（如啟動子、終止子等）的作用和功能進(jìn)行描述。

可通過比較轉(zhuǎn)基因微生物與未經(jīng)修飾的受體菌株的WGS完成上述分析。應(yīng)對用于分析和比較的序列/數(shù)據(jù)庫及方法進(jìn)行詳細(xì)說明。

5.6.3.2 酵母或絲狀真菌遺傳修飾結(jié)構(gòu)分析

對于可獲得WGS的酵母或絲狀真菌，按照5.6.3.1進(jìn)行遺傳修飾結(jié)構(gòu)分析。

對于無法獲得WGS的酵母或絲狀真菌，應(yīng)對遺傳修飾的所有步驟進(jìn)行描述。所提供的信息應(yīng)能識別所有可能引入受體微生物中的遺傳物質(zhì)。主要包括載體特征、遺傳修飾過程、殘留的載體或供體DNA結(jié)構(gòu)及關(guān)注基因。

（1）載體特征

描述載體的來源和類型（質(zhì)粒、噬菌體、病毒、轉(zhuǎn)座子），若使用了輔助質(zhì)粒，也應(yīng)予以描述；提供所有功能元件和其他載體元件位置圖譜，并對該圖譜進(jìn)行詳細(xì)闡述，用以標(biāo)識每個元件，包括編碼和非編碼序列、復(fù)制和轉(zhuǎn)移的位點(diǎn)、調(diào)控元件、耐藥基因及其大小、來源和作用等信息。

（2）遺傳修飾過程信息

應(yīng)對遺傳修飾過程進(jìn)行詳細(xì)描述，包括DNA插入、缺失、替換或改造至受體的方法，以及篩選轉(zhuǎn)基因微生物的方法；說明引入的DNA在微生物中的存在位置，明確插入基因是否在載體上，或是插入到染色體和/或真核微生物的細(xì)胞器（如線粒體）中。

（3）轉(zhuǎn)基因微生物中殘留的載體和/或供體核酸結(jié)構(gòu)

詳細(xì)說明實(shí)際插入、替換或修飾序列的位置圖譜；對于序列缺失的情況，必須提供缺失區(qū)域的大小和功能。

（4）關(guān)注基因

對插入到轉(zhuǎn)基因微生物中的任何關(guān)注基因進(jìn)行明確說明。

若在遺傳修飾過程中可能引入關(guān)注基因（包括遺傳修飾過程中使用的載體、輔助質(zhì)粒以及用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒/復(fù)制子序列中的關(guān)注基因），應(yīng)通過檢測證明轉(zhuǎn)基因微生物中不存在該關(guān)注基因。

檢測應(yīng)采用適宜的方法，如Southern雜交或PCR。

——Southern雜交應(yīng)設(shè)置適宜的陽性和陰性對照。應(yīng)說明所使用探針的長度、位置，瓊脂糖凝膠中DNA的上樣量及印跡前的凝膠圖像。陽性對照的濃度應(yīng)為生產(chǎn)菌株每個基因組中靶片段的1～10個拷貝。若使用多個探針，則應(yīng)采用獨(dú)立的試驗(yàn)分別進(jìn)行測定。

——PCR擴(kuò)增應(yīng)設(shè)置陽性對照和陰性對照。陽性對照應(yīng)包括兩種：含有遺傳修飾過程中引入的關(guān)注基因的對照；用于排除PCR抑制的對照。

5.7 發(fā)酵制品中無生產(chǎn)菌株活細(xì)胞評價

發(fā)酵制品中應(yīng)不含有生產(chǎn)菌株活細(xì)胞。應(yīng)詳細(xì)描述生產(chǎn)過程中去除或滅活微生物的處理工藝步驟，并通過檢測證明發(fā)酵制品中無生產(chǎn)菌株活細(xì)胞。

采用可培養(yǎng)方法檢測產(chǎn)品中是否存在生產(chǎn)菌株活細(xì)胞。具體的樣品采集、樣品前處理、培養(yǎng)條件、質(zhì)控試驗(yàn)和鑒定確認(rèn)要求見附錄E。

對于由相同上游發(fā)酵工藝（包括發(fā)酵、提取等）生產(chǎn)的中間產(chǎn)品，經(jīng)不同后處理工藝（如與載體或稀釋劑混合、包被等）獲得的不同配方添加劑產(chǎn)品，應(yīng)至少對發(fā)酵中間產(chǎn)品進(jìn)行評價。若為不同發(fā)酵生產(chǎn)體系生產(chǎn)的產(chǎn)品，應(yīng)對每個產(chǎn)品分別評價。

5.8 發(fā)酵制品中生產(chǎn)菌株DNA檢測

以下兩類發(fā)酵制品應(yīng)開展生產(chǎn)菌株DNA殘留檢測：

（1）生產(chǎn)菌株為非轉(zhuǎn)基因微生物，但攜帶獲得性耐藥基因的；

（2）生產(chǎn)菌株為轉(zhuǎn)基因微生物。

采用特異PCR方法對生產(chǎn)菌株特定DNA片段（如獲得性耐藥基因、遺傳修飾目的基因）進(jìn)行檢測。特異PCR方法涉及的樣品采集、DNA提取、PCR擴(kuò)增和質(zhì)控要求見附錄F。

6 結(jié)果判定

本部分僅涉及微生物（直接飼喂微生物和發(fā)酵制品生產(chǎn)菌株）相關(guān)安全性評價結(jié)果。

6.1 直接飼喂微生物

6.1.1 細(xì)菌

——不具有獲得性耐藥、不產(chǎn)生臨床相關(guān)抗菌藥物、無致病性/產(chǎn)毒能力的菌株判定為無危害。

——具有獲得性耐藥的菌株判定為具有危害，對靶動物和添加劑暴露物種具有風(fēng)險，不建議用于直接飼喂微生物的生產(chǎn)。

——具有致病性/產(chǎn)毒能力，或產(chǎn)生人或動物用抗菌藥物的菌株判定為具有危害，對敏感靶動物和添加劑暴露物種具有風(fēng)險，不建議用于直接飼喂微生物的生產(chǎn)。

6.1.2 酵母和絲狀真菌

——無致病性/產(chǎn)毒能力且不產(chǎn)生臨床相關(guān)抗菌藥物的菌株判定為無危害。

——具有致病性/產(chǎn)毒能力，或產(chǎn)生人或動物用抗菌藥物的菌株判定為具有危害，對敏感靶動物和添加劑暴露物種具有風(fēng)險，不建議用于直接飼喂微生物的生產(chǎn)。

6.2 非轉(zhuǎn)基因發(fā)酵制品生產(chǎn)菌株

6.2.1 細(xì)菌

——不具有獲得性耐藥、不產(chǎn)生臨床相關(guān)抗菌藥物、無致病性/產(chǎn)毒能力的生產(chǎn)菌株判定為無危害，發(fā)酵制品無生產(chǎn)菌株引起的風(fēng)險。

——具有獲得性耐藥的生產(chǎn)菌株判定為具有危害。若生產(chǎn)菌株攜帶獲得性耐藥基因，并且在發(fā)酵制品中檢測到長度足以覆蓋耐藥基因的完整DNA片段，則發(fā)酵制品對靶動物和暴露物種具有風(fēng)險，不建議該菌株用于發(fā)酵制品的生產(chǎn)；若發(fā)酵制品中未檢出生產(chǎn)菌株相關(guān)耐藥基因DNA片段，則認(rèn)為不具有風(fēng)險。

——具有產(chǎn)毒能力，或產(chǎn)生臨床相關(guān)抗菌藥物的生產(chǎn)菌株判定為具有危害，發(fā)酵制品對敏感靶動物和暴露物種具有風(fēng)險，不建議該菌株用于發(fā)酵制品的生產(chǎn)，除非證明發(fā)酵制品中不存在相關(guān)毒素或抗菌藥物。

6.2.2 酵母和絲狀真菌

——不產(chǎn)生臨床相關(guān)抗菌藥物且無致病性/產(chǎn)毒能力的生產(chǎn)菌株判定為無危害，發(fā)酵制品無生產(chǎn)菌株引起的風(fēng)險。

——具有產(chǎn)毒能力，或產(chǎn)生臨床相關(guān)抗菌藥物的生產(chǎn)菌株判定為具有危害，發(fā)酵制品對敏感靶動物和暴露物種具有風(fēng)險，不建議該菌株用于發(fā)酵制品的生產(chǎn)，除非證明發(fā)酵制品中不存在相關(guān)毒素或抗菌藥物。

6.3 轉(zhuǎn)基因發(fā)酵制品生產(chǎn)菌株

6.3.1 細(xì)菌

——不具有獲得性耐藥、不產(chǎn)生臨床相關(guān)抗菌藥物、無致病性/產(chǎn)毒能力、遺傳修飾未引入/改變關(guān)注基因，且按照5.8所述方法，在發(fā)酵制品中未檢出生產(chǎn)菌株重組DNA的生產(chǎn)菌株判定為無危害，發(fā)酵制品無生產(chǎn)菌株引起的風(fēng)險。

——具有獲得性耐藥的生產(chǎn)菌株判定為具有危害。若發(fā)酵制品生產(chǎn)菌株攜帶獲得性耐藥基因，并在發(fā)酵制品中檢測到耐藥基因的完整DNA片段，則發(fā)酵制品對靶動物和暴露物種具有風(fēng)險，不建議該菌株用于發(fā)酵制品的生產(chǎn)；若發(fā)酵制品中未檢出生產(chǎn)菌株相關(guān)耐藥基因DNA片段，則認(rèn)為不具有風(fēng)險。

——若生產(chǎn)菌株具有產(chǎn)毒能力，或產(chǎn)生臨床相關(guān)抗菌藥物，則菌株判定為具有危害，發(fā)酵制品對敏感靶動物和暴露物種具有風(fēng)險，不建議該菌株用于發(fā)酵制品的生產(chǎn)，除非證明發(fā)酵制品中不存在相關(guān)毒素或抗菌藥物。

6.3.2 酵母和絲狀真菌

——無致病性/無產(chǎn)毒能力、不產(chǎn)生臨床相關(guān)抗菌藥物、遺傳修飾未引入/改變關(guān)注基因，且按照5.8所述方法，在發(fā)酵制品中未檢出生產(chǎn)菌株重組DNA的菌株判定為無危害，發(fā)酵制品無生產(chǎn)菌株引起的風(fēng)險。

——具有產(chǎn)毒能力，或產(chǎn)生臨床相關(guān)抗菌藥物的生產(chǎn)菌株判定為具有危害，發(fā)酵制品對敏感靶動物和暴露物種具有風(fēng)險，不建議該菌株用于發(fā)酵制品的生產(chǎn)，除非證明發(fā)酵制品中不存在相關(guān)毒素或抗菌藥物。

附錄A屎腸球菌致病性評價方法

屎腸球菌（E.faecium）包括兩個類群。其中一個類群主要為分離自健康個體糞便的菌株，其特征是對氨芐西林敏感。另一個類群主要為臨床分離株，其特征是對氨芐西林耐藥。屎腸球菌致病性評價中，除對氨芐西林耐藥性進(jìn)行評價外，致病島標(biāo)記基因esp、類糖基水解酶基因hylEfm和標(biāo)記物IS16也是屎腸球菌評價的關(guān)注點(diǎn)。

按照5.4.1的方法測定氨芐西林對屎腸球菌的MIC值。

——若MIC值＞2毫克/升，則認(rèn)為該菌株對氨芐西林耐藥，判定菌株具有致病性。

——若MIC值≤2毫克/升，則認(rèn)為該菌株對氨芐西林敏感，還應(yīng)利用WGS分析是否含有遺傳元件esp、hylEfm和IS16。若未檢測到上述三種遺傳元件，則判定該菌株不具有致病性危害。若檢測到上述三種遺傳元件中的一種或多種，則判定該菌株具有致病性。

附錄B芽胞桿菌致病性評價方法

蠟樣芽胞桿菌群（Bacillus cereusgroup）菌種普遍存在產(chǎn)毒能力，不建議將其用于直接飼喂微生物和發(fā)酵制品生產(chǎn)。如確需使用，應(yīng)對菌株進(jìn)行動物致病性試驗(yàn)和WGS分析。若動物致病性試驗(yàn)顯示受試物組動物在試驗(yàn)期間出現(xiàn)中毒癥狀或死亡，或試驗(yàn)期間體重等指標(biāo)與對照組相比有顯著性差異時，則判定菌株具有致病性。若無動物致病性，但WGS分析發(fā)現(xiàn)菌株具有腸毒素的編碼基因（如非溶血性腸毒素基因nhe、溶血素BL基因hbl和細(xì)胞毒素K基因cytK）及嘔吐素合成酶基因ces或相似基因，則判定菌株具有致病性，除非能證明該基因不具有功能性。

對于蠟樣芽胞桿菌群（B.cereusgroup）以外的其他芽胞桿菌（Bacillusspp.），應(yīng)通過開展動物致病性試驗(yàn)或細(xì)胞毒性試驗(yàn)評價菌株致病性。細(xì)胞毒性試驗(yàn)方法如下：

B.1 供試品制備

將菌株接種于腦心浸液肉湯（BHI）培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)6小時至細(xì)胞濃度達(dá)到108CFU/毫升以上，15000轉(zhuǎn)/分鐘室溫離心5分鐘，吸取上清液作為供試品備用。

B.2 Vero細(xì)胞檢測

將Vero細(xì)胞接種至添加5%胎牛血清的最小必需培養(yǎng)液（MEM），于24孔板中培養(yǎng)2～3天，確認(rèn)Vero細(xì)胞融合后去除培養(yǎng)液，用1毫升預(yù)熱（37℃）的MEM培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞1次。按如下步驟開始檢測：

——每孔中依次加入1毫升預(yù)熱（37℃）的低亮氨酸培養(yǎng)液和100微升供試品，37℃孵育2小時。

低亮氨酸培養(yǎng)液配制：在400毫升MEM培養(yǎng)液中分別添加200毫摩爾/升的L-谷氨酰胺10毫升和500毫摩爾/升的N-（2-羥乙基）哌嗪-N’-2-乙烷磺酸（HEPES）緩沖液（pH 7.7）40毫升，加水定容至1升，過濾除菌并分裝備用。

——去除含有供試品的低亮氨酸培養(yǎng)液，每孔加入1毫升預(yù)熱（37℃）的低亮氨酸培養(yǎng)液，洗滌1次。

——將8毫升預(yù)熱（37℃）的低亮氨酸與16微升14C-亮氨酸（比活度＞300毫居里/毫摩爾/升）混合，每孔中加入300微升上述混合物（每孔含25～100 nCi14C-亮氨酸），37℃孵育1小時。

——去除放射性培養(yǎng)液，每孔中加入5%三氯乙酸1毫升，室溫放置10分鐘。去除三氯乙酸，每孔加入1毫升5%三氯乙酸，洗滌2次。

——去除三氯乙酸，每孔加入100毫摩爾/升氫氧化鉀300微升，室溫放置10分鐘。將每孔中的混合物轉(zhuǎn)移至含有2毫升閃爍液的閃爍管中，渦旋混勻，使用閃爍計數(shù)器計數(shù)1分鐘放射性。

——未添加供試品的Vero細(xì)胞作為陰性對照?？墒褂镁哂幸阎?xì)胞毒性的蠟樣芽胞桿菌菌株的表面活性素（或培養(yǎng)物上清液）作為陽性對照。

按以下公式進(jìn)行蛋白質(zhì)合成抑制率計算：

若蛋白質(zhì)合成抑制率高于20%，則判定菌株具有細(xì)胞毒性。

也可使用熒光分光光度計測量Vero細(xì)胞懸浮液的碘化丙啶染色法進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)。該方法使用培養(yǎng)2天的單層融合Vero細(xì)胞。用含碘化丙啶（5微克/毫升）的2毫升 EC緩沖液（含135毫摩爾/升氯化鈉、15毫摩爾/升 HEPES、1毫摩爾/升氯化鎂、1毫摩爾/升氯化鈣和10毫摩爾/升葡萄糖，用Tris調(diào)節(jié)至pH 7.0～7.1）將細(xì)胞調(diào)節(jié)至終濃度106個/毫升的懸液，置于1厘米石英比色皿中，37℃恒溫保存。向上述細(xì)胞懸液中加入100微升供試品，使用磁力攪拌器和攪拌子連續(xù)混合細(xì)胞，在575/615納米的激發(fā)/發(fā)射波長和5納米狹縫條件下，每隔30秒進(jìn)行熒光連續(xù)檢測。若檢測結(jié)果超過陽性對照（通常為使用清洗劑處理的細(xì)胞）熒光/吸光度20%以上，則認(rèn)為菌株具有細(xì)胞毒性。通常情況下，結(jié)果無需去除背景熒光。

附錄C數(shù)據(jù)檢索要求

文獻(xiàn)數(shù)據(jù)應(yīng)以結(jié)構(gòu)化方式進(jìn)行檢索。申請人應(yīng)盡可能檢索所有相關(guān)信息源，并說明采用該信息源的理由。應(yīng)對文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫（至少包括農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)庫）中以期刊、報告、會議記錄和書籍等形式記錄的文獻(xiàn)進(jìn)行全面檢索。此外，還應(yīng)考慮文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫以外的信息源，如全文期刊的參考文獻(xiàn)列表、會議或組織機(jī)構(gòu)網(wǎng)站等。

文獻(xiàn)檢索至少應(yīng)涵蓋最近20年的相關(guān)信息源。相關(guān)文獻(xiàn)列表應(yīng)通過參考文獻(xiàn)管理軟件進(jìn)行編輯并提交。對重要文獻(xiàn)應(yīng)提供復(fù)印件。用于新飼料添加劑申報的，申請者必須確保提交的出版物或信息滿足其版權(quán)所有者規(guī)定的條款。

應(yīng)詳細(xì)記錄并提交檢索方法，相關(guān)內(nèi)容如下：

（1）對于數(shù)據(jù)庫檢索，至少應(yīng)包括：

——數(shù)據(jù)庫名稱和服務(wù)提供者；

——檢索日期和檢索時間范圍；

——檢索中使用的任何限制條件，如語言或出版狀態(tài)；

——完整的檢索策略（所有項(xiàng)目和設(shè)置條件組合）和檢索得到的記錄數(shù)量。

（2）文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫以外的檢索，至少應(yīng)包括：

a）網(wǎng)站和期刊目錄檢索

——信息源名稱（即網(wǎng)站名稱。若檢索特定目錄，提供期刊名稱）；

——網(wǎng)址；

——檢索日期和檢索時間范圍。若檢索目錄，提供檢索日期、卷號和期號；

——檢索方法，如瀏覽、使用搜索引擎或掃描表；

——檢索中使用的任何限制條件（如出版物類型）；

——檢索項(xiàng)目和檢索到的相關(guān)摘要或全文數(shù)量。

b）參考文獻(xiàn)列表檢索

——已掃描參考文獻(xiàn)列表文件的書目詳情；

——檢索到的參考文獻(xiàn)數(shù)量。

附錄D細(xì)菌不同抗菌藥物的臨界值（Cut-off value）

附錄E發(fā)酵制品中無生產(chǎn)菌株活細(xì)胞評價方法

E.1 樣品采集

每個發(fā)酵制品產(chǎn)品至少取3個批次，每個批次至少取3個樣品進(jìn)行檢測。樣品應(yīng)從工業(yè)化生產(chǎn)線采集，記錄采樣點(diǎn)所處的具體生產(chǎn)階段。若尚無工業(yè)化產(chǎn)品，可采用中試產(chǎn)品，但應(yīng)明確中試生產(chǎn)工藝（發(fā)酵及后處理工藝）具有工業(yè)化生產(chǎn)工藝的代表性。

E.2 樣品前處理

每個樣品至少取10克（毫升）進(jìn)行前處理后制備檢液。如固體樣品：稱取10克，加入90毫升滅菌生理鹽水，充分振蕩混 勻，使其分散混懸，靜置后，取上清液作為1∶10稀釋的檢液。水溶性液體樣品：用滅菌吸管吸取10毫升樣品，加入90毫升滅菌生理鹽水，混勻后制成1∶10稀釋的檢液。至少取10毫升上述檢液進(jìn)行生產(chǎn)菌株活細(xì)胞培養(yǎng)檢測。用于培養(yǎng)檢測的檢液中至少含有1克（毫升）樣品。

E.3 培養(yǎng)條件

采用可培養(yǎng)的方法分析發(fā)酵制品中生產(chǎn)菌株活細(xì)胞存在情況。選擇適宜的培養(yǎng)條件（包括培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和時間等），確保生產(chǎn)菌株活細(xì)胞生長。應(yīng)使用最小選擇壓力的培養(yǎng)基（如常用于培養(yǎng)革蘭氏陰性細(xì)菌和芽胞桿菌的胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基、常用于培養(yǎng)酵母的麥芽浸粉瓊脂培養(yǎng)基、常用于培養(yǎng)絲狀真菌的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基等），延長培養(yǎng)時間（至少長于兩倍常規(guī)培養(yǎng)時間）使受損細(xì)胞恢復(fù)。若菌株能形成芽胞，應(yīng)采用適宜的萌發(fā)程序（如細(xì)菌熱處理），使其萌發(fā)后進(jìn)行后續(xù)培養(yǎng)。

E.4 質(zhì)控試驗(yàn)

培養(yǎng)檢測時，每批次樣品應(yīng)設(shè)置陽性對照，即在每批次其中1個樣品中接種較低數(shù)量的生產(chǎn)菌株活細(xì)胞（如每個平板10～1000個菌落），以證明所用培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件適合于產(chǎn)品中生產(chǎn)菌株活細(xì)胞的生長。

應(yīng)考慮檢測方法的特異性，以避免樣品中污染菌的干擾。

E.5 鑒定確認(rèn)

樣品經(jīng)培養(yǎng)后，若平板上長出與陽性對照形態(tài)相似的菌落，應(yīng)通過鑒定確認(rèn)其是否為生產(chǎn)菌株。

附錄F發(fā)酵制品中生產(chǎn)菌株DNA檢測方法

F.1 樣品采集

每個發(fā)酵制品產(chǎn)品至少取3個批次，每個批次至少取3個樣品進(jìn)行檢測。樣品應(yīng)從工業(yè)化生產(chǎn)線采集，記錄采樣點(diǎn)所處的具體生產(chǎn)階段。若尚無工業(yè)化產(chǎn)品，可采用中試產(chǎn)品，但應(yīng)明確中試生產(chǎn)工藝（發(fā)酵及后處理工藝）具有工業(yè)化生產(chǎn)工藝的代表性。

F.2 DNA提取

至少從1克（毫升）樣品中提取DNA。若上游發(fā)酵中間產(chǎn)品濃度高于終產(chǎn)品濃度，可使用上游發(fā)酵中間產(chǎn)品提取DNA。對于相同上游發(fā)酵工藝生產(chǎn)的中間產(chǎn)品，經(jīng)不同后處理工藝獲得的不同配方添加劑產(chǎn)品，應(yīng)對濃度最高的產(chǎn)品進(jìn)行檢測。若為不同發(fā)酵生產(chǎn)體系生產(chǎn)的產(chǎn)品，應(yīng)對每個添加劑產(chǎn)品分別進(jìn)行檢測。

應(yīng)采用適合于生產(chǎn)菌株各類細(xì)胞形式（如營養(yǎng)細(xì)胞、芽胞）的DNA提取方法，確保能從產(chǎn)品中提取到可能殘留的DNA。

F.3 特異PCR擴(kuò)增

針對生產(chǎn)菌株的特定DNA片段設(shè)計特異性引物，通過PCR檢測生產(chǎn)菌株DNA是否存在。應(yīng)詳細(xì)描述生產(chǎn)菌株的特定DNA片段、特異性引物、聚合酶以及擴(kuò)增條件等信息。

若生產(chǎn)菌株含有耐藥基因（無論其是否為轉(zhuǎn)基因微生物），所設(shè)計引物的擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)覆蓋耐藥基因的完整DNA片段。

若生產(chǎn)菌株為不含耐藥基因的轉(zhuǎn)基因微生物，所設(shè)計引物應(yīng)針對遺傳修飾目的基因，其擴(kuò)增產(chǎn)物不超過1Kb。

F.4 質(zhì)控

PCR檢測時應(yīng)當(dāng)包括以下對照和靈敏度測試：

——將直接從生產(chǎn)菌株中提取的總DNA作為PCR擴(kuò)增的陽性對照；

——將直接從生產(chǎn)菌株提取的總DNA梯度稀釋后，分別添加至樣品中，提取DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，計算檢測限；

——將直接從生產(chǎn)菌株提取的總DNA作為排除PCR抑制的陽性對照，即將直接從生產(chǎn)菌株提取的總DNA添加至從樣品中提取的DNA中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以檢查樣品DNA中是否存在導(dǎo)致PCR失敗的因素，如存在PCR抑制劑、核酸酶等；

——不含樣品DNA的陰性對照；

——檢測閾值應(yīng)不高于10納克 DNA/克（毫升）樣品。

附錄G縮略詞

BHI Brain Heart Infusion Broth，腦心浸液肉湯

cescereulidesynthetase gene，嘔吐素合成酶基因

CFU Colony Forming Unit，菌落形成單位

CIA Critically Important Antimicrobial，極為重要抗菌藥物

CLSI Clinical and Laboratory Standard Institute，美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會

cytKcytotoxin K gene，細(xì)胞毒素K基因

espenterococcal surface protein gene，腸球菌表面蛋白基因

EUCAST European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing，歐洲抗微生物藥敏感試驗(yàn)委員會

DNA Deoxyribonucleic Acid，脫氧核糖核酸

hblhemolysin BL gene，溶血素BL基因

HEPES 4-（2-Hydroxyethyl）piperazine-1-ethanesulfonic acid，N-（2-羥乙基）哌嗪-N’-2-乙烷磺酸

HIA Highly Important Antimicrobial，高度重要抗菌藥物

hylEfm Putative glycosyl hydrolases gene of Enterococcus faecium，屎腸球菌類糖基水解酶基因

ICSP International Committee on Systematics of Prokaryotes，原核生物系統(tǒng)學(xué)國際委員會

ICNP International Code of Nomenclature of Prokaryotes，原核生物國際命名法規(guī)

ICN International Code of Nomenclature for algae,fungi,and plants，國際藻類、真菌和植物命名法規(guī)

IS16Insertion sequence 16，插入序列16

ISO International Organization for Standardization，國際標(biāo)準(zhǔn)化組織

ITS Internal Transcribed Spacer，核糖體rDNA翻譯間隔序列

LSM LAB susceptibility test medium，乳酸菌藥物敏感性試驗(yàn)培養(yǎng)基

MEM Minimum Essential Medium，最低必需培養(yǎng)基

MIC Minimum Inhibitory Concentration，最低抑菌濃度

nhenon-hemolytic enterotoxin gene，非溶血性腸毒素基因

ORF Open Reading Frames，開放閱讀框

PCR Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

WGS Whole Genome Sequence，全基因組序列

WHO World Health Organization，世界衛(wèi)生組織

附錄H相關(guān)網(wǎng)址

BUSCO http://busco.ezlab.org

CARD https://card.mcmaster.ca

CGE http://www.genomicepidemiology.org

ENA http://www.ebi.ac.uk/ena

NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov

CLSI http://www.clsi.org

PAI DB http://www.paidb.re.kr/about_paidb.php

ResFinder https://cge.cbs.dtu.dk/services/ResFinder

UniProt http://www.uniprot.org

VFDB http://www.mgc.ac.cn/VFs/main.htm