畢鄭妍， 劉艷嵐,2

(1.湖南大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院, 長沙 410082; 2.湖南大學(xué) 分子科學(xué)與生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室化學(xué)/生物傳感與化學(xué)計(jì)量學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 湖南省適配體工程中心, 長沙410082)

0 引 言

1956年，Harman提出衰老的自由基學(xué)說，認(rèn)為衰老過程中的退行性變化是由細(xì)胞正常代謝過程中產(chǎn)生的有害自由基導(dǎo)致的。自由基主要是機(jī)體內(nèi)氧化還原反應(yīng)過程的中間產(chǎn)物，也可由外界紫外線照射和電離輻射等因素誘發(fā)產(chǎn)生。其反應(yīng)活性高，可使細(xì)胞中的多種物質(zhì)發(fā)生氧化，損害生物膜，還能夠使蛋白質(zhì)和核酸等大分子交聯(lián)或變性，甚至引起DNA損傷導(dǎo)致突變，從而誘發(fā)癌癥的發(fā)生和發(fā)展。

在正常生理情況下，體內(nèi)自由基不斷產(chǎn)生，同時(shí)也受人體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)(如氧化物歧化酶和維生素等)的嚴(yán)格調(diào)控，從而維持自由基代謝平衡，保持人體各種機(jī)能的正常運(yùn)行。然而，內(nèi)防御機(jī)制失衡或者外界的一些有害刺激常引起自由基平衡失調(diào)，導(dǎo)致自由基的過度積累，對各種生物分子(如DNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì))造成損害，以及招募許多炎癥介質(zhì)，進(jìn)而引發(fā)衰老、自身免疫性疾病、心血管和神經(jīng)退行性疾病等許多氧化應(yīng)激相關(guān)疾病。此外，自由基的過度增加與癌癥的發(fā)生和惡化也密切相關(guān)。因此，從自由基穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)方向入手治療相關(guān)疾病是一種行之有效的策略。

本文首先概述了自由基在體內(nèi)的產(chǎn)生和代謝，隨后對自由基的兩種調(diào)控機(jī)理及本課題組在相關(guān)疾病治療方面的工作進(jìn)行介紹，最后展望了該領(lǐng)域發(fā)展的方向和可能面臨的挑戰(zhàn)。

1 自由基簡介

1.1 自由基的產(chǎn)生和代謝

1.1.1 反應(yīng)活性氧(Reactive oxygen species, ROS)

1.1.2 反應(yīng)活性氮(Reactive nitrogen species, RNS)

1.2 自由基級聯(lián)信號調(diào)控與疾病治療

自由基是把雙刃劍，體內(nèi)自由基穩(wěn)態(tài)失調(diào)會導(dǎo)致細(xì)胞損傷和機(jī)體病變，因此，利用抗氧化劑清除自由基維持氧化還原穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要；此外，有效利用自由基也可以殺害癌細(xì)胞進(jìn)行癌癥治療。盡管癌細(xì)胞微環(huán)境自由基水平較高，獨(dú)特的自防御機(jī)制也導(dǎo)致其具有較高的耐受能力，但當(dāng)產(chǎn)生的自由基水平超過細(xì)胞承受能力時(shí)，仍然可以有效殺死癌細(xì)胞，基于此原理的化學(xué)動力療法在癌癥治療領(lǐng)域備受矚目。

1.2.1 自由基與氧化應(yīng)激

ROS和RNS都是體內(nèi)重要的自由基，在生物體內(nèi)作為代謝產(chǎn)物和信號分子，在正常的細(xì)胞代謝和受到環(huán)境刺激時(shí)產(chǎn)生[13-14]。這些物質(zhì)通常含有孤對電子，容易與其他分子發(fā)生氧化還原反應(yīng)[15]，參與調(diào)節(jié)人體內(nèi)各種生理過程[16-17]，也有助于對抗病原體及其誘導(dǎo)的感染[18]。通常，由于過量ROS/RNS具有顯著的細(xì)胞毒性，這種氧化過程受到細(xì)胞抗氧化防御機(jī)制的嚴(yán)格控制。當(dāng)ROS、RNS和抗氧化防御之間的平衡被破壞時(shí)，就會產(chǎn)生氧化應(yīng)激，導(dǎo)致氧化還原穩(wěn)態(tài)失調(diào)，可通過急性ROS/RNS生產(chǎn)過?；蚵訰OS/RNS積累表現(xiàn)出來。由于ROS和RNS受到不同信號的調(diào)控，其過量產(chǎn)生將導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)信號的級聯(lián)改變，引起多種細(xì)胞功能障礙，如能量代謝功能失調(diào)、細(xì)胞信號和細(xì)胞周期控制的改變、細(xì)胞運(yùn)輸機(jī)制受損、免疫激活或抑制以及炎癥[19]，甚至誘發(fā)細(xì)胞死亡等對機(jī)體造成損害的連鎖反應(yīng)，因此，與許多疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[10]。

目前，氧化應(yīng)激相關(guān)疾病治療和自由基調(diào)控主要分為兩個方面：一方面，過量的自由基引起氧化損傷，導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病和多種代謝性疾病等，因而利用抗氧化劑增加自由基清除能力，可以消除自由基信號異常并抑制疾病發(fā)展，這被稱為抗氧化治療；另一方面，自由基的產(chǎn)生與癌癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，癌細(xì)胞微環(huán)境相比正常細(xì)胞通常具有更高的自由基水平，這種不同的氧化還原調(diào)節(jié)機(jī)制引導(dǎo)了一個新的治療方向，即產(chǎn)生更多的自由基使其超過癌細(xì)胞耐受水平而殺死癌細(xì)胞，稱為促氧化治療。

1.2.2 抗氧化治療

近年來，抗氧化納米材料由于具有諸多優(yōu)勢引起了廣泛關(guān)注[2]，包括:(1)可以顯著提高天然抗氧化劑的抗氧化穩(wěn)定性及其藥物動力學(xué)，保護(hù)這些試劑免受環(huán)境氧化/還原和酸的侵蝕；(2)許多納米材料本身具有酶活性，相比于天然酶和小分子來說具有更高的催化效率和更強(qiáng)的環(huán)境耐受性；(3)對多種自由基，特別是次級ROS/RNS，具有強(qiáng)大的清除能力，可提供更廣泛有效的抗氧化防御；(4)可以通過功能集成，合成多功能、診療一體化抗氧化納米藥物，有望實(shí)現(xiàn)個性化治療。大量研究證明，納米材料在體內(nèi)和體外都具有強(qiáng)大的抗氧化和抗炎活性，但抗氧化納米材料的臨床開發(fā)仍處于早期階段。在未來的臨床應(yīng)用研究中，仍需從給藥途徑、體內(nèi)生物相容性、藥代動力學(xué)、生物分布與代謝以及最終病理后遺癥的表達(dá)等方面深入評估現(xiàn)有和新興的大量抗氧化納米材料。

1.2.3 促氧化治療

癌癥的一大重要特征是，癌細(xì)胞含有更多的ROS和RNS等自由基，并且對自由基水平升高更為敏感，這引起了人們的廣泛關(guān)注[21]。傳統(tǒng)化療藥物如阿霉素(DOX)和As2O3，其促氧化治療機(jī)制是在癌細(xì)胞中特異地產(chǎn)生ROS殺死癌細(xì)胞。然而，目前大多數(shù)化療藥物和放療都具有不可避免的副作用。精確和特異性調(diào)節(jié)癌細(xì)胞中ROS及其他自由基水平順理成章地成為提高治療效果同時(shí)減少副作用的關(guān)鍵。因此，腫瘤微環(huán)境(Tumor microenvironment, TME)這一與靶向策略密切相關(guān)的重要因素得到了深入研究。TME的主要特征是弱酸性、缺氧、血管異常、過氧化氫和谷胱甘肽生產(chǎn)過剩、消耗大量營養(yǎng)物質(zhì)等[22-23]。基于此，復(fù)旦大學(xué)步文博課題組提出了一種將TME和Fenton反應(yīng)相結(jié)合的新的治療方法——化學(xué)動力治療(Chemodynamic therapy, CDT)[24]，通過Fenton反應(yīng)可以生成?OH特異性靶向癌細(xì)胞，反應(yīng)機(jī)理如式(1)和式(2)所示。實(shí)現(xiàn)高效的Fenton反應(yīng)需要兩個關(guān)鍵條件，即大量的H2O2和最適的pH(2～4)。

Fe2++ H2O2→Fe3++?OH + OH-

(1)

Fe3++ H2O2→Fe2++ HO2+ H+

(2)

與其他癌癥治療策略如化療、放療、光熱治療(PTT)、光動力療法(PDT)和聲動力療法(SDT)相比，CDT的優(yōu)勢包括：特異性更高、不受外場穿透深度的限制、對正常組織副作用較低、生成更高水平的ROS以及無設(shè)備限制、非多藥耐藥，在臨床上顯示出良好的發(fā)展前景[25]。然而，TME的pH(6.5～6.8)和H2O2濃度等難以滿足Fenton反應(yīng)的需要。為了克服這一障礙，目前的研究主要集中在設(shè)計(jì)不同的納米材料[26-28]、原位降低反應(yīng)的pH[29-30]、原位生成H2O2[31]或消耗GSH[32]，以及引入物理場和化學(xué)場等方面，以期顯著提高Fenon反應(yīng)效率，進(jìn)而增強(qiáng)CDT療法的功效。

針對抗氧化和促氧化方法調(diào)控自由基級聯(lián)信號的機(jī)理和現(xiàn)狀，本課題組研究開發(fā)了新的材料和方法以促進(jìn)相關(guān)疾病治療的發(fā)展，包括將抗氧化黑色素納米材料用于缺血性腦損傷和人工DNA編碼器用于特定治療肥胖疾??；以及利用非晶態(tài)氧化鐵RNA干擾納米平臺和適體-前藥偶聯(lián)物解決了化學(xué)動力療法面臨的部分問題并成功應(yīng)用于促氧化癌癥治療。

2 自由基清除與抗氧化治療

2.1 抗氧化黑色素納米顆粒的抗氧化機(jī)制及其在缺血性腦中風(fēng)方面的防御研究

缺血性腦損傷的機(jī)制眾說紛紜，近年來廣受關(guān)注的自由基學(xué)說認(rèn)為自由基通過攻擊細(xì)胞膜上的多聚不飽和脂肪酸(PUFA)引發(fā)一系列反應(yīng)，造成細(xì)胞損害和死亡。在正常生理狀態(tài)下，人體內(nèi)存在自由基代謝酶等內(nèi)源性抗氧化劑，使自由基處于穩(wěn)態(tài)，不易引起損傷。但是腦部缺血后增多的自由基會大量消耗抗氧化劑，導(dǎo)致抗氧化防御系統(tǒng)不能及時(shí)清除自由基，引起氧化應(yīng)激損傷。因此，清除腦部由于栓塞過程導(dǎo)致的過量自由基被認(rèn)為是保護(hù)腦損傷的一個重要手段。

人體內(nèi)的天然抗氧化劑具有一定的局限性，如無法及時(shí)響應(yīng)突然升高的自由基水平、不存在特定靶向次級ROS/RNS的內(nèi)源性酶等，一系列抗氧化納米材料由于其抗氧化穩(wěn)定性以及對次級ROS/RNS(如?OH和ONOO-)強(qiáng)大的清除能力等諸多優(yōu)勢引起了研究人員廣泛的興趣，但其對人體健康具有潛在的不良影響，如對免疫細(xì)胞的激活和存在基因毒性；大多數(shù)抗氧化納米材料具有較差的生物相容性，這對其應(yīng)用于治療腦部損傷造成了阻礙，目前并沒有抗氧化劑通過臨床驗(yàn)證能夠安全有效地保護(hù)缺血腦免受氧化損傷。

圖1 (a)PEG-MeNPs的TEM圖像；(b) 有/無PEG-MeNPs時(shí)100 μmol·L-1 KO2溶液中O2生成量，插圖是加入KO2 前后的PEG-MeNPs溶液；(c) RONS代謝示意圖及PEG-MeNPs清除?OH, ?NO, ONOO-的作用；(d)不同組 (Saline：生理鹽水組，NP-treated：PEG-MeNPs處理組，Sham：假手術(shù)組)對應(yīng)2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染 色腦切片的代表圖；(e、f)三組相應(yīng)的梗死面積和腦組織中水平(與生理鹽水對照組相比，*p < 0.05, **p < 0.01)。引自參考文獻(xiàn)[35]Fig.1 (a) TEM image of PEG-MeNPs; (b) O2 production from the KO2 solution (100 μmol·L-1) with vs. without PEG-MeNPs, the inset is the digital picture of the PEG-MeNPs solution before vs. after addition of KO2; (c) Schematic illustration of RONS metabolism and ?OH, ?NO, ONOO- scavenging effect of PEG-MeNPs; (d) Representative images of TTC-stained brain slices from different groups. The corresponding (e) infarct areas and (f) levels in brain tissues of the three groups (*p < 0.05 and **p < 0.01 vs. saline control). Reprinted with permission from reference [35]

2.2 人工DNA編碼器的構(gòu)建用于調(diào)控自由基級聯(lián)反應(yīng)和肥胖治療

肥胖是一種多因素的慢性代謝性疾病，可增加糖尿病、高血壓、非酒精性脂肪肝、癌癥以及心血管和神經(jīng)系統(tǒng)疾病等多種疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)，被認(rèn)為是世界范圍內(nèi)最嚴(yán)重的公共健康問題之一。肥胖病理學(xué)的最新進(jìn)展表明，由代謝組織中各種活性氧和活性氮(RONS)的產(chǎn)生和積累引起的氧化應(yīng)激是肥胖發(fā)病和進(jìn)展的共同特征和核心機(jī)制之一。這種不平衡的氧化還原穩(wěn)態(tài)協(xié)調(diào)級聯(lián)適應(yīng)性免疫反應(yīng)，包括活化常駐白細(xì)胞和招募炎癥細(xì)胞，釋放炎性因子和更多的自由基，從而導(dǎo)致氧化損傷和炎性反應(yīng)加劇的惡性循環(huán)，進(jìn)一步促進(jìn)脂肪形成并誘發(fā)許多并發(fā)癥[36]。顯而易見，選擇性調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激有望成為治療肥胖相關(guān)疾病的一個通用方法。

在正常生理狀態(tài)下，人體內(nèi)存在的抗氧化網(wǎng)絡(luò)能夠嚴(yán)格控制自由基級聯(lián)反應(yīng)(FRC)，通過復(fù)制-轉(zhuǎn)錄-翻譯(對應(yīng)信息的發(fā)射、傳播和接收)等分子通訊過程表達(dá)抗氧化劑，維持細(xì)胞氧化還原平衡，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷[37-38]。然而，這種由基因組介導(dǎo)的分子通訊受到耗時(shí)、信息傳遞不充分、無法解碼一些高活性自由基(?OH)等限制，不能有效和及時(shí)地解碼肥胖疾病發(fā)生時(shí)復(fù)雜的FRC，因此，開發(fā)新的實(shí)時(shí)自由基解碼器至關(guān)重要。然而到目前為止，臨床上還沒有抗氧化劑被用于治療與肥胖相關(guān)的疾病。

針對基因組介導(dǎo)的分子通訊過程面臨的問題，本課題組提出了一種基于DNA框架結(jié)構(gòu)的人工DNA編碼器，用于調(diào)控脂肪化過程中自由基級聯(lián)反應(yīng)，如圖2(a)所示。考慮到對肥胖疾病特定和靶向治療的有效性和必要性，選擇一個能特異性識別脂肪細(xì)胞的適配體序列作為接收器，單寧酸(TA)作為效應(yīng)器。TA是一種天然的小分子，具有廣泛的生物學(xué)功能，包括抗氧化和抗炎癥。利用滾動循環(huán)復(fù)制(RCR)和密集包裝驅(qū)動的DNA組裝方法，合成了能夠解碼多種復(fù)雜自由基級聯(lián)信號的人工DNA編碼器TADN[39]。在RCR過程中，通過適配體介導(dǎo)的分子識別，收發(fā)器模塊使編碼器能夠主動感知環(huán)境壓力下FRC失調(diào)的目標(biāo)細(xì)胞。一旦被識別，內(nèi)部即時(shí)可用的效應(yīng)器直接作用于失調(diào)的FRC以清除過量的自由基，而不需要耗時(shí)的復(fù)制-轉(zhuǎn)錄-翻譯過程來產(chǎn)生抗氧化酶。另外，相比基因組DNA編碼產(chǎn)生的酶，該人工DNA編碼器對各種自由基具有更廣泛的清除活性如圖2(b)所示，而且基于DNA框架的通道可以有效防止惡劣環(huán)境對效應(yīng)器活性的負(fù)面影響，從而保障通信的穩(wěn)定。此外，驗(yàn)證了人工DNA編碼器在體內(nèi)的主動傳感和驅(qū)動作用。結(jié)果表明，該編碼器可以通過重組由脂肪生成驅(qū)動的失調(diào)FRC和代謝，同時(shí)阻礙自由基與炎癥網(wǎng)絡(luò)之間的有害通訊，協(xié)同抗肥胖治療，如圖2(c)～圖2(e)所示。

圖2 (a) 基于DNA框架的人工DNA編碼器的結(jié)構(gòu)示意圖、基于自然基因組DNA系統(tǒng)和人工DNA編碼器介導(dǎo)自由 基級聯(lián)(FRC)的潛在分子通訊機(jī)制；(b)TADN對H2O2、1O2和ONOO-清除作用的熒光分析；(c) 靜脈注射 TADN或非靶向NTADN人工DNA編碼器后，正常飲食(ND)或HFD(高脂飲食)小鼠的時(shí)間依賴性全身熒光 成像和(d)不同器官的熒光成像；(e)靜脈注射PBS、TADN、非靶向NTADN或游離TA的典型ND/HFD小鼠的 圖片。引自參考文獻(xiàn)[39]Fig.2 (a) Schematic illustration of the structure of the DNA framework-based artificial DNA encoder and the underlying molecular communication mechanisms mediated by natural genome DNA-based system and the artificial DNA encoder towards the free radical cascade (FRC); (b) Fluorescence analysis of the scavenging efficacy of TADN towards H2O2, 1O2, and ONOO-; (c) Time-dependent whole-body fluorescence imaging of normal diet (ND) or HFD-fed mice after intravenous injection of TADN or NTADN artificial DNA encoder; (d) Fluorescence imaging of different organs harvested from these three groups in panel (b); (e) Digital picture of representative ND/HFD-fed mice that received iv injection of PBS, TADN, NTADN, or free TA. Reprinted with permission from reference [39]

3 放大自由基級聯(lián)信號用于癌癥治療

與上述自由基調(diào)控機(jī)理相反，基于Fenton反應(yīng)機(jī)理的化學(xué)動力療法，通過產(chǎn)生高毒性自由基來殺死惡性細(xì)胞，這種促氧化療法在癌癥治療上也備受關(guān)注。越來越多的證據(jù)表明，與正常細(xì)胞相比，許多類型的癌細(xì)胞都表現(xiàn)出ROS水平的升高[21]。由于細(xì)胞內(nèi)自由基的產(chǎn)生增加或?qū)ψ杂苫那宄芰ο陆?，會?dǎo)致氧化還原穩(wěn)態(tài)被破壞，這種內(nèi)在的氧化應(yīng)激常常被視為惡性事件，癌細(xì)胞的異常生長也與活性氧及其他自由基的增加有關(guān)。然而，由于過度水平的自由基應(yīng)激對細(xì)胞有毒，外源性藥物誘導(dǎo)產(chǎn)生自由基時(shí)，氧化應(yīng)激增加的癌細(xì)胞可能更容易受到傷害。因此，通過氧化還原調(diào)節(jié)自由基水平可能是一種選擇性殺死癌細(xì)胞而不會對正常細(xì)胞造成顯著毒性的方法。

3.1 RNA干擾策略用于放大自由基反應(yīng)及癌癥靶向治療

在特異性調(diào)節(jié)癌細(xì)胞自由基穩(wěn)態(tài)上，CDT展現(xiàn)了良好的前景。目前，CDT方法主要依賴于內(nèi)源性過氧化氫(H2O2)通過經(jīng)典的Fenton或Haber-Weiss化學(xué)轉(zhuǎn)化為高毒性羥基自由基[7]。然而，由于有效的化學(xué)反應(yīng)需要強(qiáng)酸性，以及腫瘤H2O2不足和上調(diào)抗氧化防御以對抗自由基引起的氧化損傷，CDT的抗癌效果受到極大的限制。因此，研究人員開發(fā)了很多策略，對pH和H2O2等腫瘤微環(huán)境進(jìn)行調(diào)節(jié)以滿足CDT反應(yīng)的需要。

腫瘤微環(huán)境的重要特征之一是缺氧，在缺氧狀態(tài)下，癌細(xì)胞的代謝途徑可能會重塑，通過平衡生物合成過程和快速生產(chǎn)大量的ATP以支持細(xì)胞增殖，因而在原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤中會觀察到有氧糖酵解或“瓦伯格效應(yīng)”[40]。糖酵解的高速率引起乳酸的過量生成，這導(dǎo)致單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(MCTs)的上調(diào)[41]，與該過程相關(guān)的主要是MCT4，其控制乳酸/H+的流出，維持穩(wěn)定的細(xì)胞內(nèi)pH并誘導(dǎo)細(xì)胞外環(huán)境的微酸化(pH 6.5～6.8)。MCT4表達(dá)升高與許多癌癥的轉(zhuǎn)移、血管生成、預(yù)后不良和復(fù)發(fā)有關(guān)[42]。因此，假設(shè)沉默MCT4基因可以阻止癌細(xì)胞內(nèi)乳酸的外排，使細(xì)胞內(nèi)pH降低，從而增強(qiáng)Fenton反應(yīng)效率。

結(jié)合RNAi策略，開發(fā)了一個非晶態(tài)氧化鐵納米顆粒(AIO NPs)平臺(圖3(a)和圖3(b))有效遞送靶向MCT4的小干擾RNA(siRNA)，用于沉默MCT4的表達(dá)[29]。AIO NPs對siRNA的有效封裝避免其與酶接觸而被降解，同時(shí)利用AIO NPs酸性響應(yīng)特點(diǎn)釋放鐵離子，與癌細(xì)胞內(nèi)的H2O2通過類Fenton反應(yīng)產(chǎn)生高反應(yīng)性和毒性的?OH，促進(jìn)內(nèi)涵體逃逸并顯著加劇腫瘤細(xì)胞的氧化應(yīng)激，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。更重要的是，MCT4基因沉默后可以誘導(dǎo)癌細(xì)胞內(nèi)的H2O2含量上升，結(jié)合細(xì)胞內(nèi)由于MCT4沉默導(dǎo)致的乳酸積累，F(xiàn)enton反應(yīng)的效率大幅度提高，從而高效地殺傷癌細(xì)胞。

在荷瘤小鼠模型中，通過將NPs靜脈注射到PC3荷瘤小鼠中，檢測了AIO RNAi NPs的體內(nèi)基因沉默效果。圖3(c)～圖3(e)表明，與NP(siControl)處理組相比，NP(siMCT4)處理小鼠的MCT4表達(dá)得到顯著抑制。此外，類Fenton反應(yīng)引起氧化損傷對腫瘤抑制起到了協(xié)同作用，從而顯著抑制了腫瘤的生長。同時(shí)，氧化鐵NPs還具有MRI造影的功能，從而實(shí)現(xiàn)了對AIO RNAi NPs腫瘤積聚的無創(chuàng)可視化如圖3(f)所示?？傮w來說，該AIO RNAi NPs具有體積小、基因沉默高效、腫瘤積累高、腫瘤組織穿透深、生物相容性好以及MRI介導(dǎo)的腫瘤積累跟蹤等特點(diǎn)，有望為各種惡性腫瘤的治療提供有價(jià)值的工具。

圖3 (a)AIO RNAi NPs的形成和(b)多重功能的示意圖；(c) Western blot分析NP(siControl)與NP(siMCT4)對PC3荷瘤小鼠MCT4表達(dá)的影響；(d) PBS、NP(siControl)或NP(siMCT4)治療后PC3異種移植小鼠腫瘤生長(*p<0.05和**p<0.01 vs. PBS對照)；(e) 三組荷瘤小鼠和腫瘤組織的代表性圖片；(f) 靜脈注射AIO RNAi NPs后PC3荷瘤小鼠全身T1、T2加權(quán)MRI圖像。引自參考文獻(xiàn)[29]

3.2 生物正交適體-前藥結(jié)合膠束用于非H2O2和pH依賴性癌癥化學(xué)動力治療

如上所述，傳統(tǒng)的Fenton反應(yīng)由于受到反應(yīng)速率的限制，通常需要大量的H2O2和較低的pH (2～4)[44]，而腫瘤內(nèi)環(huán)境自身達(dá)不到如此高的要求。除了在上述工作中通過增加H2O2含量及降低細(xì)胞內(nèi)pH來提高Fenton反應(yīng)效率外，設(shè)計(jì)一個H2O2和pH非依賴的化學(xué)動力學(xué)療法也是提高其抗腫瘤效果的另一個重要途徑。因此，本課題小組設(shè)計(jì)了一種自由基前藥和核酸適體偶聯(lián)物(ApPdC)，首次將生物正交反應(yīng)引入化學(xué)動力療法，實(shí)現(xiàn)了Fe2+可激活的有毒碳自由基的原位釋放和放大，靶向殺死腫瘤細(xì)胞且不依賴腫瘤的酸性或H2O2[32]。

如圖4(a)所示，在ApPdC中利用適配體AS1411特異性識別癌癥中過表達(dá)的核仁素，并引入正交化學(xué)和前藥設(shè)計(jì)，首先合成人工前藥堿基——金剛烷穩(wěn)定的四氧六烷單體(“T”)作為疏水尾部，適配體作為親水端，通過自組裝作用成功制備了一個剛性的、多組分的ApPdC納米膠束。所得到的ApPdC納米膠束在生理?xiàng)l件下是不活躍的，然而它們在癌細(xì)胞受體介導(dǎo)的攝取后，引起級聯(lián)的生物正交反應(yīng)。本設(shè)計(jì)引入與人工前藥堿基選擇性共給藥的血紅素hemin，從而實(shí)現(xiàn)Fe2+的自供應(yīng)并能有效地激活前藥。在癌細(xì)胞中，hemin中的配位Fe3+可以被細(xì)胞內(nèi)還原劑(如GSH)還原為Fe2+-配位血紅素，而后前藥堿基T被亞鐵血紅素(Fe2+)/游離Fe2+激活，通過單電子轉(zhuǎn)移釋放毒性自由基。在活化過程中，過氧化物被裂解后通過生物正交化學(xué)觸發(fā)氧自由基的產(chǎn)生，不穩(wěn)定的氧自由基通過C—C β斷裂重排成C中心自由基，誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。圖4(b)證實(shí)了ApPdC膠束的活化及C中心自由基的形成。

實(shí)驗(yàn)表明，ApPdC膠束具有良好的特異性識別和位點(diǎn)選擇性激活機(jī)制，如圖4(c)所示。此外，由于血紅素的減少導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的消耗，可顯著降低腫瘤細(xì)胞的抗氧化能力，從而進(jìn)一步促進(jìn)毒性C中心自由基的抗癌作用，如圖4(d)所示。也驗(yàn)證了ApPdC膠束協(xié)同治療癌癥的潛力，顯然，Ap-6G-H-“T”比不含血紅素的Ap-6G-“T”更能有效抑制細(xì)胞增殖和生長，而且與單T膠束相比，Ap-6G-2“T”也展現(xiàn)了高效選擇性治療腫瘤的潛力。

圖4 (a) ApPdC膠束的合成及在癌細(xì)胞中自循環(huán)和原位擴(kuò)增產(chǎn)生有毒自由基的示意圖；(b) 以DEPMPO為自旋俘獲劑，測定“T”在二亞硫酸鈉誘導(dǎo)血紅素還原產(chǎn)生Fe2+(上圖)或血紅素(Fe2+)(下圖)活化下自由基的生成；(c) 不同處理下HepG2肝癌細(xì)胞中自由基水平的流式細(xì)胞術(shù)分析(上圖)和共聚焦熒光成像(下圖)；(d) Ap-6G-“T”、Ap-6G-H-“T”、Ap-6G-2“T”、Ap-6G-H-2“T”及相應(yīng)的非靶向樣品處理HepG2細(xì)胞的細(xì)胞活性。引自參考文獻(xiàn)[32]

設(shè)計(jì)的ApPdC膠束能夠?qū)崿F(xiàn)TME雙靶向和自我循環(huán)，在癌細(xì)胞中原位擴(kuò)增產(chǎn)生有毒自由基，顯示了很好的治療效果，但仍需要進(jìn)一步的研究，如體內(nèi)藥代動力學(xué)和ApPdC膠束的抗癌效果，以更好地說明它們在癌癥治療中的潛力。此外，盡管ApPdC膠束旨在靶向獨(dú)特的癌細(xì)胞代謝以最小化副作用，但未來還需要更多的研究來評估其對正常細(xì)胞或組織的長期安全性。另外，由于鐵代謝失調(diào)和易受氧化應(yīng)激影響是癌癥的共同特征，本研究可以為開發(fā)新型有效的專門治療多種晚期癌癥的ApPdC奠定基礎(chǔ)。

4 總結(jié)與展望

自由基在生物體中擔(dān)任重要功能，其過量產(chǎn)生會導(dǎo)致脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA等生物分子發(fā)生變形和失活。自由基的增加也與癌細(xì)胞的異常生長有關(guān)，可能在癌癥的開始和發(fā)展中扮演重要角色。此外，過量自由基導(dǎo)致的氧化應(yīng)激可能誘發(fā)很多其他疾病，如腦中風(fēng)和神經(jīng)退行性疾病，因此，維持自由基穩(wěn)態(tài)對保障細(xì)胞正常功能至關(guān)重要。當(dāng)氧化應(yīng)激發(fā)生時(shí)，由于人體內(nèi)抗氧化機(jī)制無法平衡自由基的產(chǎn)生與消除，往往需要利用一些外源的抗氧化劑進(jìn)行抗氧化治療。然而，由于過高水平的自由基應(yīng)激也可能殺害細(xì)胞，癌細(xì)胞氧化應(yīng)激增加時(shí)可能更容易受到外源性藥物誘導(dǎo)產(chǎn)生的自由基的損傷。因此，促氧化療法也是一種調(diào)節(jié)自由基水平特異性殺死癌細(xì)胞的有利選擇。

在抗氧化納米材料的合理設(shè)計(jì)上，需要繼續(xù)探索和優(yōu)化合成途徑，使材料具有更強(qiáng)、更穩(wěn)定的體內(nèi)抗氧化活性，并且高效、高選擇性地調(diào)節(jié)氧化還原微環(huán)境靶位點(diǎn)，使全身副作用最小化；為達(dá)到顯著的臨床效益，還需深入了解不同疾病的氧化還原病理和抗氧化納米材料的詳細(xì)抗氧化機(jī)制，以及進(jìn)行廣泛的臨床前研究，為開發(fā)設(shè)計(jì)抗氧化納米材料提供關(guān)鍵信息。迫切需要明確自由基在調(diào)節(jié)特定生物事件的分子機(jī)制，以及氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的動力學(xué)進(jìn)展。開發(fā)新的和更具有臨床相關(guān)性的體外或體內(nèi)動物模型也是自由基研究領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)，可對不斷涌現(xiàn)的抗氧化納米技術(shù)進(jìn)行強(qiáng)有力的評價(jià)。

對于促氧化療法的發(fā)展，一方面，針對自由基的產(chǎn)生，亟待開發(fā)新的材料來調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境以滿足需要，或者利用現(xiàn)有的環(huán)境開辟新的自由基產(chǎn)生機(jī)制；另一方面，由于涉及氧化還原調(diào)控和應(yīng)激反應(yīng)的因素很多，癌細(xì)胞的氧化還原變化非常復(fù)雜，單純使用自由基生成劑并不一定產(chǎn)生足夠的腫瘤殺傷性能。在持續(xù)的內(nèi)源性氧化應(yīng)激下，許多癌細(xì)胞能夠很好地適應(yīng)這種應(yīng)激并導(dǎo)致內(nèi)源性抗氧化劑性能增強(qiáng)。為了有效殺死癌細(xì)胞并克服與氧化還原適應(yīng)相關(guān)的耐藥性，了解癌細(xì)胞中復(fù)雜的氧化還原變化及其潛在機(jī)制是很重要的。同時(shí)，將促氧化試劑與傳統(tǒng)的化療或放療等治療方式相結(jié)合，有望顯著增強(qiáng)癌癥治療效果。

綜上所述，自由基調(diào)控是一種新型的、具有廣闊發(fā)展前景的疾病防治策略。期待著上述挑戰(zhàn)在可預(yù)見的未來得到解決，早日實(shí)現(xiàn)抗氧化和促氧化技術(shù)在預(yù)防和治療人類重大疾病方面的臨床應(yīng)用。