張彥龍, 侯 悅, 榮 欣, 張多英, 井立強(qiáng)

(1.黑龍江大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心, 哈爾濱 150500；2.黑龍江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 黑龍江省普通高校微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 哈爾濱 150080；3.黑龍江大學(xué) 建筑工程學(xué)院, 哈爾濱 150080； 4.黑龍江大學(xué) 化學(xué)化工與材料學(xué)院功能無機(jī)材料化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國家級催化技術(shù)國際聯(lián)合研究中心， 哈爾濱 150080)

0 引 言

光催化氧化法是基于半導(dǎo)體光催化原理，以光為能量，將有機(jī)物降解為二氧化碳和水的方法[1]。TiO2是最常用的一種半導(dǎo)體催化劑，近年來，還發(fā)展出了基于二氧化鈦的可見光光催化劑，如SiO2-TiO2、Ag-TiO2、N-TiO2和Er3+∶YAlO3/TiO2等[2-5]；以及鉍(Bi)系化合物、混合價(jià)態(tài)錳氧化物/磷酸銀光催化劑，如Bi12O17Cl2、Mn3O4/MnO2-Ag3PO4等[6-7]。已有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，光催化技術(shù)雖然可以高效轉(zhuǎn)化污染物，但很難達(dá)到完全礦化，加之投入成本較高，在實(shí)際應(yīng)用中還是受到一定的限制[8]。此外，光催化氧化法的光照催化氧化周期較長，處理效果也難以滿足實(shí)際處理的要求[9]。

光催化生物耦合(Intimated coupling of photocatalysis and iodegradation, ICPB)技術(shù)借助于多孔載體，將難降解污染物的光催化產(chǎn)物由載體表面?zhèn)髻|(zhì)至內(nèi)部，并被生物進(jìn)一步降解礦化[10]。ICPB同步解決了單一光催化技術(shù)對有機(jī)物礦化不完全，以及單一生物降解技術(shù)無法對難降解有機(jī)物起作用的問題[11]。徐政雪研究發(fā)現(xiàn)，ICPB體現(xiàn)了單獨(dú)紫外光光催化(UPC)與單獨(dú)生物降解(B)協(xié)同作用的特點(diǎn)，解除了苯酚對微生物的抑制，16 h在紫外光激發(fā)下的直接耦合體系(UPCB)中苯酚的去除率為67.7%[8]。Zhou等以海綿為載體，在光催化劑TiO2中同時(shí)摻雜Er3+和YAlO3，研究了UPCB對苯酚降解的影響。該工藝對苯酚的去除率為67.2%，進(jìn)一步顯示了光催化和生物降解的協(xié)同作用[4]。盡管ICPB技術(shù)存在許多優(yōu)點(diǎn)，但經(jīng)紫外光照射后，附著于載體外部的生物膜容易受到損傷，并且紫外光可能對載體內(nèi)部的生物膜也產(chǎn)生不利影響，例如導(dǎo)致生物膜脫落、損傷微生物細(xì)胞、產(chǎn)生可溶性微生物產(chǎn)物等[12]。紫外輻射(Ultraviolet, UV)是指波長介于100～400 nm的光輻射，254 nm波長的紫外光會使DNA鏈上相鄰的嘧啶堿基發(fā)生共價(jià)交聯(lián)，造成嘧啶二聚體損傷，激發(fā)堿基發(fā)生各種化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致堿基修改、丟失或改變遺傳信息[13]，破壞細(xì)菌、病毒等微生物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，造成細(xì)菌死亡[14]。因此，UV254是滅菌、消毒最常用的波長。有研究表明，在波長為254 nm紫外光照射下，納米光催化劑TiO2對大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的殺菌效果較好，作用30 min后去除率可以分別達(dá)到97.8%和99.4%[15]。而一般TiO2光催化反應(yīng)在300～388 nm波長條件下受到激發(fā)[16]，使H2O、O2發(fā)生氧化還原反應(yīng)生成·OH及超氧離子O2-[17]。TiO2受激發(fā)的最佳波長為365 nm。有研究發(fā)現(xiàn)選用波長為365 nm的紫外燈作為激發(fā)光源催化納米TiO2絲網(wǎng)時(shí)，空氣消毒器開機(jī)作用30 min對空氣中自然菌的平均消亡率為81.64 %；選用波長為254 nm的紫外燈作為激發(fā)光源催化納米TiO2絲網(wǎng)時(shí)，該空氣消毒器開機(jī)作用30 min對空氣中自然菌的平均消亡率為93.96 %[18]。由此可見，UV254及UV254+TiO2是微生物生長最不利的條件。

為提高ICPB生物降解性能和微生物的紫外光耐受能力，本文在UV254及UV254+TiO2的條件下，經(jīng)分離、篩選獲得耐紫外光的優(yōu)勢菌，對菌株進(jìn)行16S rRNA初步鑒定，確定其最佳生長溫度、最適pH及滲透壓，分析紫外光對優(yōu)勢菌生長的影響，并在UV365+TiO2的條件下構(gòu)建ICPB工藝，驗(yàn)證優(yōu)勢菌對難降解有機(jī)物的去除效果。本結(jié)果旨在為ICPB技術(shù)提供菌種資源，對提高光催化生物降解直接耦合技術(shù)處理難降解有機(jī)物效率及應(yīng)用具有一定意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種來源

本試驗(yàn)菌株篩選自哈爾濱市農(nóng)科院試驗(yàn)田表層土壤。

1.1.2 培養(yǎng)基

(1) 富集分離培養(yǎng)基：0.3 g·L-1土壤浸出液，10%TiO2，無機(jī)鹽溶液。

(2) 無機(jī)鹽溶液：MgSO47H2O 0.01 gL-1， K2HPO40.05 gL-1， NaCl 0.01 gL-1，MnSO44H2O 0.01 g·L-1，F(xiàn)eSO40.01 gL-1。

以上所有培養(yǎng)基在配制過程中需調(diào)節(jié)pH為6.9～7.0。如需配制固體培養(yǎng)基，只需向以上培養(yǎng)基中加入18 gL-1的瓊脂，在101 ℃的高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌30 min即可。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株篩選

從哈爾濱農(nóng)科院試驗(yàn)田取300 mg表層土壤，土壤有機(jī)質(zhì)含量、速效磷、速效鉀含量狀況優(yōu)良，堿解氮含量較高，呈弱酸性。將300 mg土壤置于燒杯中，加入蒸餾水至1 L，攪拌均勻后靜置，靜置后的上清液即為土壤浸出液。向土壤浸出液中加入10%TiO2制備富集分離培養(yǎng)基(MgSO47H2O 0.01 gL-1， K2HPO40.05 gL-1NaCl 0.01 gL-1，MnSO4·4H2O 0.01 gL-1，F(xiàn)eSO40.01 gL-1)，pH調(diào)節(jié)至6.9～7.0，在35 ℃、UV254紫外燈照射及磁力攪拌下富集3 d。培養(yǎng)后進(jìn)行梯度稀釋，涂布于富集固體培養(yǎng)基中，在35 ℃、UV254紫外燈照射條件下恒溫培養(yǎng)。待長出單菌落后，選取單一菌落進(jìn)行劃線分離。選取長勢良好的菌株用于腐殖酸降解試驗(yàn)。

1.2.2 腐殖酸降解試驗(yàn)

腐殖酸是經(jīng)微生物轉(zhuǎn)化、合成后積累形成的一類有機(jī)物質(zhì)，屬于難降解有機(jī)物[19]。腐殖酸廣泛存在于地表水、地下水、黑臭水體和垃圾滲濾液等，在飲用水中是天然有機(jī)污染物，在污水中是難降解有機(jī)物。選擇腐殖酸用于本文試驗(yàn)材料，主要考慮以下幾個(gè)方面：(1)腐殖酸的污染物特性；(2)對微生物無毒害作用；(3)分解后可為微生物生長提供碳源和氮源。因此，本文選取腐殖酸作為難生物降解大分子有機(jī)物的代表物，來測定菌株對難降解有機(jī)物的去除效果。將分離的1 mL菌劑接種于含有0.5 gL-1腐殖酸的無機(jī)鹽溶液中，在UV254紫外條件下處理24 h，將相同濃度的腐殖酸溶液放置暗處理作為對照，測定降解前后的和

1.2.3 菌株的形態(tài)特征研究

將分離、純化后的典型單一菌落接種到LB固體培養(yǎng)基，在UV254紫外燈照射條件下，于35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察菌落的形態(tài)、大小、顏色、表面狀況、是否有光澤等。通過革蘭氏染色方法觀察菌株的革蘭氏染色特征[20]，通過掃描電鏡(SEM)觀察菌體的形態(tài)特征和尺寸大小[21]。

1.2.4 菌株的16S rRNA基因鑒定

將菌株接種至LB固體培養(yǎng)基，在最適溫度下培養(yǎng)16～24 h，將菌落收集后，應(yīng)用細(xì)菌基因組回收試劑盒，根據(jù)操作指南提取細(xì)菌基因組DNA。通過生工生物公司對菌株T4的16S rRNA進(jìn)行測序，獲得菌株的基因序列號。采用BLAST在線工具(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)，將獲得的16S rRNA序列結(jié)果與NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中的已知模式菌株進(jìn)行同源性對比，將同源性對比結(jié)果相似度最高的菌株16S rRNA序列下載，并利用MEGA 7.0軟件[22]，采用Neighbour-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[23]，系統(tǒng)發(fā)育樹中其他物種的16S rRNA基因序列由NCBI的GenBank獲得。

1.2.5 碳源利用特性試驗(yàn)

將菌體置于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，在最適溫度下培養(yǎng)24～48 h，用無菌棉簽收集菌體于滅菌的生理鹽水中，調(diào)節(jié)菌液濃度至OD550為0.5，混合均勻使之形成均一的菌懸液。在GN Ⅲ板的各個(gè)孔中加入200 μL菌懸液，置于菌株的最適溫度下培養(yǎng)2 d，記錄試驗(yàn)結(jié)果，分析菌株對碳源的利用情況。若孔中的菌液由無色變?yōu)樽霞t色則為陽性，無變化則為陰性[24]。

1.2.6 優(yōu)勢菌的最佳生長條件

1.2.6.1 菌株最適生長溫度

配制pH為7的LB固體培養(yǎng)基，于101 ℃的高壓滅菌鍋中滅菌30 min后，將處于對數(shù)生長期的菌株接種于上述培養(yǎng)基中。初步在較大的溫度范圍(4 ～45 ℃)內(nèi)設(shè)置8個(gè)溫度梯度，分別為4、10、15、20、25、30、35和45 ℃，在UV254紫外條件下培養(yǎng)24 h后，觀察菌株形態(tài)，通過觀察菌株四區(qū)生長狀態(tài)判斷菌株T4的最佳生長溫度。

1.2.6.2 菌株最適pH

配制LB液體培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH分別為4、5、6、7、8、9、10，將菌株接種至上述培養(yǎng)基中，在30 ℃、160 rmin-1、UV254紫外條件下培養(yǎng)24 h，測定菌液在600 nm波長下的吸光度(OD600)值，確定菌株的最佳pH。

1.2.6.3 菌株最適滲透壓

配制pH為7的LB液體培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中NaCl的含量分別為0%、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、7%、8%和10%，將菌株接種至上述培養(yǎng)基中，在30 ℃、160 rmin-1、UV254紫外條件下培養(yǎng)24～48 h。培養(yǎng)24 h后，如菌液出現(xiàn)渾濁，則利用紫外分光光度計(jì)測定菌液OD600值；如菌液未出現(xiàn)渾濁，則繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，再測定菌液的OD600值，確定菌株的最適滲透壓以及可適應(yīng)的滲透壓范圍。

1.2.7 紫外光對菌株生長的影響

將配制好的LB液體培養(yǎng)基滅菌后，取7 mL置于10 mL的離心管中，取單菌落接種于上述離心管中混勻。分別取1 mL混勻后的菌液于錐形瓶中，在30 ℃、160 rmin-1、暗條件和30 ℃、160 rmin-1、UV254紫外條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長期，于0、0.5、2、4、8、11、24和29 h取樣，測定菌液的OD600值。以時(shí)間為橫坐標(biāo)、吸光度值為縱坐標(biāo)繪制生長曲線。

1.2.8 優(yōu)勢菌強(qiáng)化的ICPB工藝的處理效果

按照1%的接種量，將菌株T4接種于含有聚氨酯海綿(填充量為30%)的LB液體培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)。反復(fù)培養(yǎng)3次，使聚氨酯海綿被菌液充滿，在UV365+TiO2條件下構(gòu)建ICPB工藝，加入0.1 gL-1腐殖酸250 mL，在好氧條件下處理24 h后，測定處理效果。

1.2.9 分析方法

(3) TOC：利用日本島津公司TOC-VCPN型TOC檢測儀測定總有機(jī)碳，具體操作按照濕法氧化法[28]進(jìn)行，分別測定總碳(TC)含量和總無機(jī)碳(TIC)含量，兩者差值即為TOC 。

(4) OD：利用紫外分光光度計(jì)測定菌液的OD600值。

(5) COD：采用《水和廢水監(jiān)測分析方法》中的快速密閉催化消解法(含光度法)[26]進(jìn)行COD測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 耐紫外光優(yōu)勢菌的篩選

通過富集、分離、純化的方法，以腐殖酸為碳源，在35 ℃、紫外TiO2條件下篩選出三種菌，編號分別為T1、T2和T4。向含有腐殖酸的水溶液中分別添加T1、T2、T4三種菌，取上清液并測其亞硝酸鹽、氨氮，TOC的變化情況，結(jié)果如圖1所示。腐殖酸中含量最多的是碳元素(50%～60%)，其次為氧(30%～35%)，再其次為氫(4%～6%)和氮(2%～4%)[29]。對T1、T2、T4進(jìn)行TOC測定，降解24 h后，三株菌對腐殖酸均有去除作用。其中T4和T1去除效果較好，T1的去除率達(dá)到60%左右，其次為T4，去除率達(dá)到50.4%，二者均高于對照組(9.16%)。經(jīng)生物降解之后，體系中氨氮濃度有所升高，主要原因是腐殖酸中含有2%～4%的氮元素，腐殖酸經(jīng)過降解、礦化，微生物的脫氨基作用使腐殖酸中的氮以氨氮的形式釋放。對三株菌的亞硝酸鹽進(jìn)行測定，經(jīng)T1和T2降解后，亞硝酸鹽濃度升高，超過了1.3 mg·L-1，而經(jīng)T4降解后，亞硝酸鹽濃度最低。亞硝酸鹽含量過高會引發(fā)生物急性中毒和高鐵血紅蛋白癥等，亞硝酸鹽的代謝產(chǎn)物N-亞硝基化合物也具有強(qiáng)烈的致癌性[30]。因此，鑒于T4降解腐殖酸后亞硝酸鹽生成量最低，最終將T4作為降解腐殖酸的優(yōu)勢菌株。

圖1 耐紫外光的優(yōu)勢菌對腐殖酸的降解效果：(a)硝酸鹽、氨氮濃度變化;(b)TOC濃度變化Fig.1 Degradation effect of dominant bacteria resistant to ultraviolet light on humic acid: (a) changes of nitrate and ammonia nitrogen concentrations; (b) changes of TOC concentrations

2.2 優(yōu)勢菌的初步鑒定

2.2.1 形態(tài)特征

通過四區(qū)平板劃線法將純化后的單菌落接種于LB固體培養(yǎng)基中，待長出單菌落后，通過肉眼觀察的方式記錄菌落形態(tài)特征，結(jié)果如圖2(a)所示。培養(yǎng)12 h后的菌落呈圓形，不光滑，中間凸起，邊緣有菌環(huán)且顏色較淺，有芽孢。新形成的菌落呈乳白色，老齡菌落顏色較深，呈淡黃色。菌株革蘭氏染色結(jié)果如圖2(b)所示，T4為革蘭氏陽性細(xì)菌。通過掃描電鏡觀察菌株T4的細(xì)胞并測量菌體大小，結(jié)果如圖2(c)所示，菌株T4的大小為(2.58～7.60) μm×(1.06～1.37) μm。

(a)

2.2.2 菌株的16S rRNA鑒定

對菌株T4進(jìn)行16S rRNA基因測序，將獲得的T4菌株16S rRNA基因序列提交至NCBI的Genbank中獲得序列號為MN587976。將序列結(jié)果與NCBI中BLAST進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)與模式菌株BacillusaryabhattaiB8W22(EF114313)相似度為98.65%，與芽孢桿菌屬的其他相關(guān)菌株具有93.54%(B.paramycoidesMCCC 1A04098)～98.45%(B.megateriumATCC 14581)的相似度。將菌株T4與芽孢桿菌屬其他菌種構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖3所示。T4與其他菌種均未顯示較高的同源性，相似度不到99%，由此推測菌株T4可能為芽孢桿菌屬的新菌種。

圖3 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的菌株T4系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain T4 based on 16S rRNA gene sequences

2.3 優(yōu)勢菌的碳源利用特征

通過BIOLOG細(xì)菌自動(dòng)鑒定系統(tǒng)，對菌株T4的碳源利用情況進(jìn)行研究，并與其親緣關(guān)系較近的阿氏芽孢桿菌BacillusaryabhattaiB8W22T和巨大芽孢桿菌BacillusmegateriumMTCC428T[31-32]進(jìn)行對比分析，結(jié)果如表1所示。

表1 菌株T4與阿氏芽孢桿菌Bacillus aryabhattai B8W22T和巨大芽孢桿菌 Bacillus megaterium MTCC428T [31-32]碳源利用對比分析Table 1 Comparative analysis of carbon utilizing characteristics among strain T4, Bacillus aryabhattai B8W22T and Bacillus megaterium MTCC428T [31-32]

碳源利用試驗(yàn)陽性結(jié)果指的是，菌株T4可以利用該碳源進(jìn)行生長；而陰性結(jié)果則說明菌株不能利用該碳源進(jìn)行生長。根據(jù)BIOLOG試驗(yàn)結(jié)果得知，菌株T4可利用的碳源有D-葡萄糖、麥芽糖、海藻糖、龍膽二糖、蔗糖、D-松二糖、水蘇糖、棉籽糖、β-甲基-D-葡萄糖苷、N-乙酰氨基葡萄糖、D-果糖、水蘇糖、丙氨酸、L-谷氨酸、L-乳酸、果膠、丙酸，不能利用D-山梨糖醇，對半乳糖、蜜二糖、D-甘露醇、D-甘露糖、丙酸鹽、纖維二糖和葡萄糖酸鈉微弱利用。從表中數(shù)據(jù)可知，菌株T4可以利用葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖和海藻糖，說明T4對大分子有機(jī)物降解能力較強(qiáng)，這也是T4對腐殖酸降解能力較強(qiáng)的原因之一。菌株T4與BacillusaryabhattaiB8W22T和BacillusmegateriumMTCC428T[31-32]相比存在差異，說明菌株T4與對比菌株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.4 優(yōu)勢菌的最適生長條件

2.4.1 最佳溫度

通過固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的方式，確定菌株T4的最佳生長溫度，并與BacillusaryabhattaiB8W22T、BacillusmegateriumMTCC428T[31-32]進(jìn)行對比分析。通過四區(qū)平板劃線的方式，將菌株接種于不同培養(yǎng)溫度下的LB培養(yǎng)基中，24 h后觀察菌株的生長狀態(tài)，結(jié)果如表2所示。由表可知，菌株T4可以在10～45 ℃條件下生長，最佳生長溫度為35 ℃。BacillusaryabhattaiB8W22T生長在10～37 ℃；BacillusmegateriumMTCC428T可以在20～37 ℃條件下生長，最佳生長溫度為37 ℃；BacillusthuringiensisATCC 10792可以在10～45 ℃條件下生長，最佳生長溫度為30 ℃[31-32]。由此可見，菌株T4與其他菌種相比，具有一定的耐熱性，可以適應(yīng)相對較高的溫度。

表2 菌株T4、阿氏芽孢桿菌Bacillus aryabhattai B8W22T、巨大芽孢桿菌Bacillus megaterium MTCC428T 和Bacillus thuringiensis ATCC 10792的生長溫度范圍[31-32]Table 2 Growth temperatures of strain T4, Bacillus aryabhattai B8W22T, Bacillus megaterium MTCC428T and Bacillus thuringiensis ATCC 10792 [31-32]

2.4.2 最佳生長pH

將菌株T4分別接種至不同pH的LB培養(yǎng)基中，于30 ℃、UV254紫外光照射條件下培養(yǎng)24 h。利用紫外分光光度計(jì)測得菌株T4的OD600值，結(jié)果如圖4(a)所示。發(fā)現(xiàn)菌株可以在pH為5～9范圍內(nèi)生長，當(dāng)pH為5時(shí)，OD值為1.39，當(dāng)pH為7時(shí)，達(dá)到最大OD值1.72，因此，菌株的最佳生長pH為7。隨著pH的繼續(xù)升高，吸光度值呈現(xiàn)下降的趨勢，說明堿性環(huán)境不利于菌株T4的生長。而菌株BacillusaryabhattaiB8W22T和BacillusmegateriumMTCC428T可以在pH為6～10范圍內(nèi)生長[31]，以上結(jié)果說明與其他菌株相比，菌株T4更耐酸性環(huán)境。

2.4.3 最佳生長滲透壓

將菌株T4分別接種于不同含量NaCl的LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后測定菌液的OD600值，結(jié)果如圖4(b)所示。當(dāng)培養(yǎng)基中不添加NaCl時(shí)，OD值為1.39，當(dāng)NaCl含量為0.5%時(shí)，OD值達(dá)到最大值1.71。當(dāng)NaCl超過4%后，菌株T4在24 h內(nèi)未見明顯生長，因此繼續(xù)培養(yǎng)48 h，測定OD600值。結(jié)果表明，菌株T4的生長范圍為0%～10% NaCl，當(dāng) NaCl濃度超過4%，生長趨緩，說明高濃度NaCl抑制菌株T4的活性，最高滲透壓為10%時(shí)，仍可生長，說明菌株T4具有一定的耐鹽性。

圖4 pH (a)和滲透壓(b)對菌株T4生長的影響

2.5 紫外光對菌株T4生長的影響

生長曲線反映了細(xì)菌在不同培養(yǎng)條件下所表現(xiàn)出的生長規(guī)律和繁殖特點(diǎn)[33]。紫外光對菌株T4生長變化的影響如圖5所示。由圖可知，菌株T4在30 ℃、160 rmin-1培養(yǎng)條件下經(jīng)歷遲緩期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期4個(gè)時(shí)期，符合細(xì)菌的生長規(guī)律。由圖中菌株生長曲線可知，受紫外光照射，0～4 h為細(xì)菌T4的遲緩期，4～24 h為對數(shù)生長期，24～29 h為平穩(wěn)期，29 h后進(jìn)入衰亡期。在非紫外光照射條件下，0～11 h為菌株T4的遲緩期，11～24 h進(jìn)入對數(shù)生長期，24～29 h為平穩(wěn)期，29 h后進(jìn)入衰亡期。由此可見，紫外光照射縮短了菌株T4的遲緩期，快速進(jìn)入對數(shù)生長期。紫外光照射會破壞微生物細(xì)胞膜和DNA結(jié)構(gòu)，對細(xì)胞生物膜造成損傷[34]。然而在本文中，T4沒有產(chǎn)生損傷，尤其在24 h前生長速度尤為明顯，可能是經(jīng)紫外光照射后，LB培養(yǎng)基中大分子的多糖、肽鏈等被打開，使培養(yǎng)基中可利用的碳源增多，促進(jìn)了菌體生長[35]。而在29 h后吸光度值的降低說明溶液中營養(yǎng)物質(zhì)不為菌株的生長提供持續(xù)的碳源，最終進(jìn)入衰亡期。此外，T4是芽孢桿菌，芽孢是其抵抗不良環(huán)境而產(chǎn)生的休眠體，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)相對比較致密，這也可能是其對紫外線具有極強(qiáng)抵抗能力的原因之一[36]。

圖5 紫外光對菌株T4生長的影響Fig.5 Effect of ultraviolet light on the growth of strain T4

2.6 優(yōu)勢菌強(qiáng)化的ICPB工藝驗(yàn)證

載體是ICPB工藝的重要組成部分之一，常見的載體有纖維素載體、陶瓷載體、聚氨酯海綿和聚氨酯泡沫[10,37]。本試驗(yàn)以聚氨酯海綿為載體，將菌株T4接種于含有聚氨酯海綿的LB液體培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)(聚氨酯海綿填充量為30%)，反復(fù)培養(yǎng)3次，使聚氨酯海綿被菌液充滿，在UV365+TiO2條件下構(gòu)建ICPB工藝，進(jìn)行光催化耦合降解驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果如表3所示。經(jīng)優(yōu)勢菌強(qiáng)化的ICPB工藝在處理24 h后氨氮值有所升高，這與之前菌株篩選結(jié)果一致(圖1)，證實(shí)存在微生物的脫氨基作用。經(jīng)優(yōu)勢菌強(qiáng)化的ICPB對COD去除率為30.23%，低于UV254+TiO2的腐殖酸去除效果，原因可能是UV365+TiO2的光氧化作用相較于UV254的光解作用弱，無法更有效地將腐殖酸的環(huán)狀結(jié)構(gòu)分解，限制了微生物的降解作用。

表3 優(yōu)勢菌ICPB工藝的生物降解驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Verifying experiment results of biodegrading efficiency by bio-enhanced ICPB with predominant bacteria

3 結(jié) 論

從農(nóng)田表層土壤中分離出耐紫外光、可降解腐殖酸的優(yōu)勢菌株T4，對獲得的優(yōu)勢菌進(jìn)行16S rRNA基因鑒定和生理生化特征分析，并確定了紫外光對優(yōu)勢菌生長的影響。將優(yōu)勢菌用于ICPB工藝，驗(yàn)證了其在光催化體系下對難降解有機(jī)物的處理效果，具體結(jié)論如下：

(1) 菌株T4可以與紫外光(UV254)以及光催化(UV365+TiO2)耦合，分解難生物降解有機(jī)物。

(2) 優(yōu)勢菌T4為桿菌，大小為(2.58～7.60) μm×(1.06～1.37) μm，革蘭氏陽性，無鞭毛，16S rRNA基因與芽孢桿菌屬的菌種相似度最高，為98.65%，且與其他菌種的進(jìn)化親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，推測優(yōu)勢菌T4為芽孢桿菌屬的新菌種。

(3) 菌株T4的生長范圍為10～45 ℃，最適溫度為35 ℃；pH范圍為5～9，最適pH為7；滲透壓范圍為0%～10%，最適滲透壓是0.5%；菌株T4具有耐高溫、耐酸性環(huán)境和高滲透壓的特點(diǎn)。

(4) 菌株T4可以利用的碳源有D-葡萄糖、麥芽糖、海藻糖、龍膽二糖、蔗糖、D-松二糖、水蘇糖、棉籽糖、β-甲基-D-葡萄糖苷、N-乙酰氨基葡萄糖、D-果糖、水蘇糖、丙氨酸、L-谷氨酸、L-乳酸、果膠和丙酸。對二糖和多糖的利用能力較強(qiáng)，說明優(yōu)勢菌T4可以分泌降解多糖的胞外酶，有利于處理難降解有機(jī)物。

(5) 紫外光促進(jìn)了優(yōu)勢菌在LB培養(yǎng)基中的生長，縮短了適應(yīng)期的時(shí)間，主要原因可能是紫外光分解培養(yǎng)基中的有機(jī)物，使其更易被菌株T4利用，且菌株T4具有芽孢，耐受性更強(qiáng)。